Lisis y extracción de proteínas

Existen numerosos métodos para romper las células y preparar su contenido para su análisis. En general, se emplean métodos suaves cuando la muestra consiste en células cultivadas o células sanguíneas fácilmente lisables, mientras que se emplean métodos más vigorosos para la ruptura de células bacterianas o vegetales más robustas, o células de mamíferos incrustadas en tejido conectivo.

• Lisis con detergente: La lisis con detergente es un método suave que se puede utilizar para células de mamíferos, células bacterianas, levaduras y plantas. Las suspensiones celulares se centrifugan suavemente y se resuspenden en una solución de lisis que contiene detergentes que actúan para romper la membrana celular. Las membranas se solubilizan, lisando las células y liberando su contenido. Es posible que sea necesario eliminar los detergentes en etapas posteriores si interfieren con el análisis o la producción.
• Lisis por congelación-descongelación: Este método es aplicable a suspensiones de células mamíferas o bacterianas. La suspensión celular se congela rápidamente con nitrógeno líquido. A continuación, la muestra se descongela y se resuspende mediante pipeteo o agitación suave en tampón de lisis, repitiendo el proceso varias veces. Entre ciclos, la muestra se centrifuga y se retiene el sobrenadante que contiene proteínas solubles.
• Choque osmótico: se trata de un método muy suave que puede ser suficiente para la lisis de células mamíferas o bacterianas en suspensión sin necesidad de utilizar detergentes. El método, que a menudo se combina con la disrupción mecánica, se basa en el cambio de un medio osmótico alto a uno bajo, y es muy adecuado para aplicaciones en las que el lisado se va a fraccionar posteriormente en componentes subcelulares.
• Ultrasonidos: este método de extracción de proteínas se aplica con mayor frecuencia a suspensiones celulares. Las células se rompen mediante ondas sonoras de alta frecuencia a través de una sonda insertada en la muestra. Las ondas sonoras generan una región de baja presión, lo que provoca la ruptura de las membranas celulares.
• Métodos mecánicos: Las proteínas pueden extraerse de las células y los tejidos utilizando diversas medidas «de trituración y molienda» rudimentarias pero eficaces. Por ejemplo, las membranas celulares pueden romperse mediante fuerzas de cizallamiento líquido utilizando la homogeneización Dounce o Potter-Elvehjem. Los tejidos pueden homogeneizarse cortándolos o picándolos en un tampón refrigerado utilizando una batidora Waring o un homogeneizador Polytron®. Los tejidos o las células pueden congelarse en nitrógeno líquido y molerse hasta obtener un polvo fino utilizando un mortero y una maja con alúmina o arena. La agitación rápida de las células con finas perlas de vidrio rompe las paredes celulares, lo que resulta eficaz para la mayoría de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
• Digestión enzimática: Los métodos enzimáticos se utilizan con frecuencia para extraer proteínas de bacterias, levaduras o células eucariotas incrustadas en tejidos fibrosos, donde las membranas celulares están rodeadas por una estructura protectora robusta. Las enzimas o cócteles de lisis celular, como la lisozima, la mutanolysina, la metapolizima, la lisonasa y la pronasa, pueden utilizarse en combinación con enzimas de digestión de tejidos (es decir, colagenasa, condroitinasa, hialuronidasa) para disolver o romper las paredes celulares, las cubiertas, las cápsulas, las cápsides u otras estructuras que no se cortan fácilmente con métodos mecánicos solos. La digestión enzimática puede ir seguida de homogeneización, sonicación o agitación vigorosa en un tampón de lisis.

Además, dado que las proteasas y fosfatasas endógenas pueden liberarse tras la ruptura celular y degradar la molécula diana, la muestra debe protegerse durante la ruptura celular y la purificación posterior utilizando inhibidores de proteasas y fosfatasas para evitar la pérdida incontrolada de la molécula diana.