Protein Expression Systems

소개

유전 공학 및 복제의 발전은 연구 목적을 위한 heterologous Protein Expression Systems 및 분리에 수많은 가능성을 열어주었습니다. 상당한 수준의 기술 발전으로 재조합형 단백질의 대규모 발현과 분리가 가능하게 되었습니다. 그러나 효소, 항체, 백신 생산과 같은 대규모 용도에서는 필요한 단백질의 양이 상당히 많습니다. 이러한 경우 Protein Expression Systems은 배양과 유지 보수가 용이하고, 빠르게 성장하며, 많은 양의 단백질을 생산해야 합니다. 게다가 포유 동물의 단백질은 다양한 PTM을 겪습니다. 이러한 요구 사항은 Protein Expression Systems의 발견으로 이어졌습니다. 다양한 Protein Expression Systems에는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 시스템이 있습니다.

다음 요인은 재조합형 단백질을 생성하는 데 사용되는 발현 시스템의 유형을 결정합니다.

• Protein Expression에 소요된 시간
• 발현 시스템 취급 용이성
• 필요한 단백질의 양
• 단백질의 질량
• PTM 유형, 이황화물 결합 수
• 발현된 단백질의 도착 지점

발현 시스템 내의 재조합형 단백질 발현 과정에는 다음과 같은 정보를 필요로 합니다.

• 목적 단백질을 암호화하는 유전자 판별
• 개별 mRNA에서 cDNA 생성
• 유전자 염기서열을 삽입하기 위한 적절한 발현 벡터 선택
• 벡터를 발현할 수 있는 적절한 시스템 선택
• 적합한 감별 및 확장 방법

원하는 재조합형 단백질 생산을 위한 핵심 단계는 다양한 발현 시스템에서 유사합니다(그림 1).

그림 1. 원하는 재조합형 단백질 생산을 위한 Protein Expression Systems의 최적화 단계

Bacterial protein expression systems - 대장균

박테리아는 짧은 배가 시간으로 인해 재조합형 단백질을 발현하는 빠르고 간단한 시스템처럼 작용합니다. 배양에 필요한 배지는 비싸지 않으며 생물 생성을 확장하는데 적용되는 방법은 간단합니다. 가장 널리 사용되는 숙주 시스템은 대장균으로, 유전학, 유전체 서열 및 생리학에 대한 충분한 지식이 포함되어 있습니다. 유전자 조작이 쉽고 고밀도로 성장하므로 대규모 발효에도 적합합니다. 그러나 대장균의 세포벽은 독성 파이로젠을 포함하고 있기 때문에 발현된 단백질은 사용 전에 광범위하게 검사해야 합니다.

그림 2. Bacterial protein expression system - 대장균

대장균을 이용한 단백질 발현은 다음 단계를 포함합니다.

• 목적 DNA 염기서열을 수집하기 위해 적격 대장균(카탈로그 번호 CMC0001, CMC0004, CMC0014) 세포 사용
• 박테리아 유전체에 DNA를 통합하거나 플라스미드로 존재하는 DNA 염기서열을 순환
• 선발표지 유전자(항생 물질)를 사용하여 변환된 대장균 선택(카탈로그 번호 L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• 전통적 방식의 LB 옵션(제품 번호 L2542, L3522, L3147) 또는 EnPresso™ B 성장 시스템(제품 번호 B11001)와 같은 적정 배지에서 선별된 대장균을 대규모로 확장
  
• 세포내/분비 단백질의 분리 및 정제

특징

• 낮은 비용 배양법
• 유연한 시스템 – 다양한 촉매, 표지 및 위치 제한이 있는 플라스미드를 운반할 수 있음
• 확장이 용이하며 단백질 수율이 높음

효모 단백질 발현 시스템 – 출아형 효모(Saccharomyces cerevisiae)

고도로 발달된 유전자 시스템, 사용 용이성, 압력 시간 단축 및 비용 감소를 통해 출아형 효모를 재조합형 단백질의 발현과 생산에 탁월한 유기체로 만들었습니다. 특별히 고안된 효모의 플라스미드 운반 기능은 재조합형 단백질 발현 시스템에 매우 중요합니다. 사용되는 플라스미드는 목적 유전자 염기서열 삽입에 사용 가능한 제한 지점을 구성합니다. 플라스미드를 이용한 효소의 변형은 원하는 단백질의 생성과 적절한 확장을 가능하게 합니다.

그림 3. 효모의 단백질 발현 시스템 – 출아형 효모

출아형 효모를 사용하는 단백질 발현은 다음 단계를 포함합니다.

• 목적 DNA 염기서열을 차지하기 위한 적격 대장균 세포 사용(카탈로그 번호 CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• 박테리아 유전체에 DNA를 통합하거나 플라스미드로 존재하는 DNA 염기서열을 순환
• 선발표지 유전자(항생 물질)를 사용하여 변환된 대장균 선택(카탈로그 번호 L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• 전통적 방식의 LB 옵션(제품 번호 L2542, L3522, L3147) 또는 EnPresso™ Y 정의 배지(제품 번호 Y22001)와 같은 적정 배지에서 선별된 대장균을 대규모로 확장
  
• DNA 또는 플라스미드 분리
• 효모로 변환(효모 변형 키트, 카탈로그 번호 YEAST1)
• 효모 염색체에 DNA를 통합하기 위한 형질전환체 판별
• 적절한 배지(카탈로그 번호 Y1375, Y1501, Y1751, Y2001, Y1376, Y0750)에서 높게 발현된 효모 복제 선택 및 확장
• 세포내/분비 단백질의 분리 및 정제

특징

• 낮은 비용 배양법
• 세포내 단백질과 분비 단백질 모두에 적합함
• 높은 발현 결과를 가져오지만 단백질 진핵의 번역 후 글리코실화를 초래함

곤충 세포 발현 시스템 – Sf9 및 Sf21

열대거세미나방(Spodoptera frugiperda), Sf9 및 Sf21에서 파생된 세포주는 재조합형 단백질 발현 시스템으로 자주 사용됩니다. 바큐로 바이러스는 나비목과에 속하는 곤충의 세포에서 일상적으로 증식하는 용해성 dsDNA 바이러스입니다. 척추 동물은 감염되지 않으며, 포유류 세포에서는 촉진 유전자가 활동하지 않습니다.

그림 4. 곤충 세포 발현 시스템 – Sf9 및 Sf21

바큐로 바이러스/곤충 세포를 통한 단백질 발현은 다음 단계가 포함합니다.

• 목적 DNA 염기서열을 차지하기 위한 적격 대장균 세포 사용(카탈로그 번호 CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• 박테리아 유전체에 DNA를 통합하거나 플라스미드로 존재하는 DNA 염기서열을 순환
• 선발표지 유전자(항생 물질)를 사용하여 변환된 대장균 선택(카탈로그 번호 L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• 적절한 배지에서 선별된 대장균의 확장(카탈로그 번호 L2542, L3522, L3147)
• DNA 또는 플라스미드 분리
• 바이러스 입자의 증식과 형성에 필요한 바이러스 유전자를 포함하는 2차 플라스미드 제조
• 발현 플라스미드와 2차 플라스미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 동시 트랜스펙션
• 재조합형 바이러스 스톡 정제
• 바이러스의 증식 및 재조합형 바이러스 스톡의 역가를 증가시키기 위한 추가적인 플라크 측정
• 고가역 재조합형 바이러스 스톡을 가진 곤충 세포의 감염
• 세포내/분비 단백질의 분리 및 정제

특징

• 재조합형 단백질은 세포 용해 전 마지막 용해 주기 단계에서 고도로 발현
• 세포질 단백질과 분비 단백질을 모두 생성하는데 적합
• 단백질의 이황화물 결합이 효율적으로 생성
• 포유류 세포에서 발견되는 PTM의 대부분을 제공

Mammalian cell expression systems – HEK293 및 CHO

재조합형 단백질 발현을 목적으로 포유류 세포를 사용하는 경우 주된 과제는 발현된 단백질의 효율성 및 수준의 감소입니다. 그러나 HEK293 및 CHO와 같은 세포주는 각각 효율적인 과도기 시스템과 안정적 발현 시스템으로 개발되었습니다. HEK293 세포는 리포솜, 인산칼슘 또는 PEG를 사용하여 일시적으로 트랜스펙션됩니다. 일시적 발현은 비교적 쉽고 간단하지만 확장은 기술적으로 어렵습니다. CHO 세포는 일반적으로 많은 양의 재조합형 단백질의 안정적 발현에 사용됩니다. 이러한 과정은 목적 유전자와 DHFR 선택 카세트를 가진 DHFR 결핍 CHO 세포의 트랜스펙션을 포함합니다. 그런 다음 감염된 세포는 안정적으로 트랜스펙션된 세포 집단을 얻기 위해 메토트렉세이트가 있는 곳에서 선별됩니다. 선택 및 확장 프로세스에는 2-3개월이 소요됩니다.

그림 5. 포유류 세포 발현 시스템 – HEK293 및 CHO

포유류 세포를 이용한 일시적 또는 안정적인 단백질 발현은 다음 단계를 포함합니다.

• 목적 DNA 염기서열을 차지하기 위한 적격 대장균 세포 사용(카탈로그 번호 CMC0001, CMC0004, CMC0014)
• 박테리아 유전체에 DNA를 통합하거나 플라스미드로 존재하는 DNA 염기서열을 순환
• 선발표지 유전자(항생 물질)를 사용하여 변환된 대장균 선택(카탈로그 번호 L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
• CloneStable™의 복제 스토리지 옵션
• 적절한 배지에서 선별된 대장균의 확장(카탈로그 번호 L2542, L3522, L3147)
• DNA 또는 플라스미드 분리
• X-tremeGENE™ 트랜스펙션 시약을 이용한 포유류 세포로의 플라스미드 발현 트랜스펙션
• 안정된 클론 선택
• 일시적인 배치 발현을 위한 복제 확장 또는 안정적인 발현을 위한 2-3개월 간의 클론 확장
• 세포내/분비 단백질의 분리 및 정제

특징

• 쉽고 빠른 일시적 발현
• 포유류 세포에서 발견되는 모든 PTM 제공
• 안정적인 트랜스펙션으로 더 높은 수율, 확장성 및 재현 가능한 생산 확보

다음 표에서는 네 가지 단백질 발현 시스템과 각각의 장단점을 비교합니다.

원하는 모든 PTM 상태에서 단백질이 발현되는 발현 시스템을 선택하십시오. 무엇을 선택하더라도 모든 단백질 발현 시스템에 적합한 다양한 범위의 적격 세포, 곤충 및 포유류 세포주 및 관련 제품을 제공받으실 수 있습니다.