S7350

Zestaw do wykrywania utlenionych białek OxyICC

• UNSPSC Code: 12161503
• NACRES: NA.84
• eCl@ss: 32161000

Właściwości

• Quality Segment: 100
• technique(s): immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable
• detection method: fluorometric

Opis

General description

Stwierdzono, że stres oksydacyjny odgrywa kluczową rolę w wielu zaburzeniach patologicznych. Wydaje się, że w oddziaływaniu tym pośredniczą reaktywne formy tlenu (ROS), które powodują modyfikacje białek, lipidów i DNA. W przypadku białek reaktywne formy tlenu powodują przede wszystkim powstawanie pochodnych karbonylowych na łańcuchach bocznych aminokwasów, wpływając na ich funkcjonalność enzymatyczną i biochemiczną. Nic dziwnego, że tworzenie karbonylów stało się ważnym biomarkerem stresu oksydacyjnego.

Reaktywne formy tlenu (ROS) są związane z procesami patologicznymi, w tym rakiem, apoptozą, starzeniem się, chorobami neurodegeneracyjnymi, przewlekłymi chorobami zapalnymi, chorobami płuc i chorobami sercowo-naczyniowymi (recenzje, patrz ref. 1-4).

Organizmy żywe są stale narażone na potencjalnie szkodliwe wolne rodniki tlenowe, które są generowane przez normalne funkcje komórkowe, a także przez czynniki środowiskowe (1, 5-7). Jednak te reaktywne cząsteczki są łagodzone przez obecność przeciwutleniaczy, a zatem organizmy istnieją z delikatną równowagą między utleniaczami i przeciwutleniaczami (7-9). W czasie stresu oksydacyjnego dochodzi do zachwiania równowagi na korzyść utleniaczy. W rezultacie wolne rodniki są w stanie atakować i modyfikować składniki subkomórkowe, w tym kwasy nukleinowe, lipidy i białka (7, 10-12). W niektórych przypadkach komórki reagują na bodźce oksydacyjne i pozwalają organizmowi dostosować się do stresu oksydacyjnego (13-15).

Białka są jednym z głównych celów wolnych rodników tlenowych i innych reaktywnych form tlenu

Utlenianie białek modyfikuje łańcuchy boczne metioniny, histydyny i tyrozyny oraz tworzy cysteinowe wiązania dwusiarczkowe (16-19). Katalizowane przez metale utlenianie białek wprowadza grupy karbonylowe (aldehydy i ketony) do reszt lizyny, argininy, proliny lub treoniny w sposób specyficzny dla danego miejsca (16, 20-22). Oksydacyjna modyfikacja białek może modulować właściwości biochemiczne białek, takie jak aktywność enzymatyczna (21-23), aktywność wiązania DNA czynników transkrypcyjnych (24-26) oraz podatność na degradację proteolityczną (12, 25-28). Chociaż sugerowano związek między utlenianiem białek a starzeniem się (29-31), niewiele wiadomo na temat znaczenia oksydacyjnej modyfikacji poszczególnych białek w patofizjologii procesów, w których pośredniczą wolne rodniki.

Nic dziwnego, że modyfikacja karbonylowa białek stała się kluczowym biomarkerem do identyfikacji stresu oksydacyjnego. Aby pomóc w tych wysiłkach badawczych, Millipore oferuje obecnie zestaw OxyICC, który zawiera odczynniki chemiczne i immunologiczne niezbędne do wykrywania grup karbonylowych za pomocą immunocytochemii fluorescencyjnej. Metoda testowa obejmuje chemiczną derywatyzację grup karbonylowych białek za pomocą 2,4-dinitrofenylohydrazyny (DNPH). Ta reakcja chemiczna powoduje, że białka są kowalencyjnie sprzężone z DNP w ich miejscach karbonylowych. Białka poddane derywatyzacji DNP są następnie wykrywane przy użyciu biotynylowanych przeciwciał, które są specyficznie reaktywne dla ugrupowania DNP. Późniejsza inkubacja z fluorescencyjnie sprzężoną streptawidyną umożliwia wykrywanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ilość wykrytej fluorescencji jest skorelowana ze stopniem stresu oksydacyjnego, któremu poddano komórkę.

Zestaw OxyICC zawiera odczynniki do immunodetekcji karbonyli białkowych metodą immunocytochemii fluorescencyjnej. Procedura testu jest prosta, a uzyskane wyniki są wysoce czułe i ilościowe.

Application

Protokół komórek poddanych stresowi nadtlenkowemu:
- Rozmieść komórki w normalnej gęstości (zazwyczaj dodaj ~30 tys. na dołek 8-dołkowego szkiełka komorowego).
- Inkubować przez noc
- Usunąć pożywkę
- Dodać świeżą pożywkę zawierającą _H2O2 (500uM przez 30 minut lub 50uM przez noc).
- Po odpowiedniej inkubacji delikatnie przepłukać komórki 2 razy PBS
- Utrwalić komórki zimnym metanolem
- Kontynuować z protokołem OxyICC.

Preparation Note

Dual^® Przechowywanie w temperaturze (szczegóły w instrukcji) Przechowywać przez okres do 6 miesięcy od daty otrzymania.

Other Notes

S7350-1 (Store at 2-8ºC) Streptavidin-Cy3^™: (Part No. CS203022) 15µL solution. 2,4-Dinitrophenylhydrazine Solution: (Part No. CS201876) One vial with 1.1mL. 10x PBS Wash Buffer: (Part No. CS201873) One 130mL bottle. 5x Blocking Buffer: (Part No. CS203024) One 10mL bottle. Millex^™ GP Filter Units (0.22µm): (Part No. SLGP033RB) 3 filters. S7350-2 (Store at - 20ºC) Anti-DNP, Biotinylated (mouse monoclonal) Antibody: (Part No. CS203021) 15µL of a 1mg/mL solution. DAPI: (Part No. CS202687) 10 L of 1mg/mL solution.

Legal Information

Cy3 is a trademark of Cytiva

Dual is a registered trademark of Ciba-Geigy AG

Millex is a trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Disclaimer

O ile nie określono inaczej w naszym katalogu lub innej dokumentacji firmy dołączonej do produktu(-ów), nasze produkty są przeznaczone wyłącznie do użytku badawczego i nie mogą być wykorzystywane do żadnych innych celów, w tym między innymi do nieautoryzowanych zastosowań komercyjnych, zastosowań diagnostycznych in vitro, zastosowań terapeutycznych ex vivo lub in vivo lub jakiegokolwiek rodzaju konsumpcji lub zastosowania u ludzi lub zwierząt.

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 10 - Combustible liquids