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终点 PCR:特异性和产量增强的抗体介导的热启动 PCR 方案

简介

为什么要使用热启动 Taq?

当 PCR 反应在室温下进行时,在测定过程中,非特异性扩增可通过以下途径发生:

  • 引物与非特异性模板的结合
  • 形成引物二聚体,允许引物使用其他引物作为模板。

在热启动 PCR 中,Taq 聚合酶在加热之前是无活性的。 热启动 PCR 激活方法允许用户在增加目标产量和特异性的同时最小化非特异性扩增。

我们的热启动技术是如何工作的?

我们的 JumpStart Taq DNA 聚合酶是一种抗体失活的热启动酶。在最初的变性 PCR 步骤中,Taq DNA 聚合酶活性得以恢复。得到的 PCR 表现出更高的特异性和产量。与化学变性的热启动不同,酶激活可能需要 10 min,抗体介导的热启动酶则可在 1 min 内被激活。

抗体介导的热启动PCR机制

设备

  • 移液器分配体积,从 <1 到 200µL
  • 台式微量离心机
  • 热循环仪
  • 电泳设备
  • 紫外透射仪

耗材

  • 无菌过滤器移液管吸头
  • 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管(例如CLS430909)
  • PCR 试管,选择以下其中一种以匹配所需格式:
    • 单个薄壁200 μL PCR管(Z374873或P3114)
    • 连排管,200 μL (Z374962 )
    • 平板
      • 96孔板(Z374903)
      • 384孔板(Z374911)
      • 封板膜
        • AlumaSeal® 96膜(Z721549)
  • dNTP混合物,dATP、dCTP、dGTP和dTTP各10 mM(D7295,仅标准格式试剂需要)
  • 酶和缓冲液,查看下表,为您的应用定义最佳试剂:
  • DNA标记,根据您的PCR扩增子大小选择合适的标记
  • PCR级纯水(W1754)
  • DNA/cDNA 模板
    • cDNA 反应 1:10 稀释以检测高表达的靶标培养基或 1:2 到 1:5 稀释以检测稀有转录物或 10 ng 到 100 ng gDNA
  • 稀释至工作浓度的引物(10µM 工作原液对大多数检测来说已经足够)
    • 此处整理定制寡核苷酸
    • 预先设计的基因表达引物也适用于大多数模型生物 (KiCqStart® SYBR® Green Primers, KSPQ12012)

方法

  1. 将DNA聚合酶置于冰上或-20 ºC,在室温或冰上解冻剩余的反应组分,旋转混合,短暂离心,冰上更换。
  2. 设置PCR反应

    a.制备包含所有反应组分的主混合物,DNA/cDNA
    模板。

    I. 通过所需反应次数乘以数量计算所需的主混合物,
    包括对照品,然后加入10%,确保足够量的所有样品。

注:如果PCR缓冲液中尚未加入氯化镁,或者先前的优化显示一定的浓度要求,则单独加入氯化镁。

    b. 将反应组分合并到冰上的1.5 mL微量离心管中

  1. 通过上下小心移液来混合主混合物,确保所有混合物都从移液器吸头排出,然后短暂地脉冲或离心以收集管底部的样品。

  2. 将20 μL预混液分装到所需数量的200 μL薄壁PCR管中(为样品编号,包括重复样品和对照样品)

  3. 加入5 μL DNA模板样品(含总量为10 ng~100 ng gDNA或将cDNA样品从 1:2 稀释到 1:10)至 25 μL的最终反应体积。

  4. 旋转PCR管,放入带有加热盖的热循环仪中。

  5. 确定引物的合适退火温度 (Ta)。可以使用比Tm最低的引物的Tm低 5 ºC的Ta进行很好的首次检测。

  6. 执行以下热循环规程。
    a. 95°C,2-10 min
    b. [95℃,30 s;48-60 °C,(Ta) 30 s;72℃,0.5-2 min] 25-50 循环
    c. 72°C,10 min
  7. 通过琼脂糖凝胶电泳分析已完成反应的等分试样,并在透照器上或通过其他选择的分析方法观察。
材料
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