Buccal DNA Extraction และ WGA Amplification Protocol

โปรโตคอลนี้เป็นวิธีที่ง่ายและสะดวกในการแยกขยายและทำให้ดีเอ็นเอของยีโนมบริสุทธิ์จากเซลล์วัว การเก็บตัวอย่าง DNA เป็นวิธีที่สะดวก เมื่อดีเอ็นเอถูกแยกออกโดยใช้โปรโตคอลการสกัด miniprep มันสามารถขยายได้โดยใช้โปรโตคอลการขยายจีโนมทั้งหมด

โปรโตคอล Miniprep DNA จีโนมิก

เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุดให้ใช้ GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(G1N10)สำหรับกระบวนการนี้

1. เช็ดก้านที่เก็บไว้ให้แห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที
2. เติมสารละลาย Lysis Solution T 280 μ L และ Proteinase K 20 μ m μL ใส่ก้านไม้แล้วค่อยๆหมุน μL ปิดฝาหลอดและผสมโดยการวน
3. บ่มตัวอย่างที่อุณหภูมิ 55°C เป็นเวลา 20 นาทีโดยใช้น้ำวนเป็นครั้งคราว
4. เติมสารละลาย Lysis 200 ไม μL รลิตร C และ Vortex ให้ทั่วเป็นเวลา 15 วินาที
5. บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 70°C เป็นเวลา 10 นาที
6. เติมสารละลายเตรียมคอลัมน์ 500 มล. ลงในคอลัมน์เย็บเล่ม GenElute Miniprep แต่ละคอลัมน์ (โอริงสีแดง) และ μL ไปปั่นเหวี่ยงที่แรงเหวี่ยง 12,000 × g เป็นเวลา 1 นาที ทิ้งของเหลวที่ไหลผ่าน
   โซลูชันการเตรียมคอลัมน์ช่วยเพิ่มการยึดเกาะดีเอ็นเอให้กับเมมเบรนทำให้ได้ผลผลิตที่สม่ำเสมอมากขึ้น
7. เติมเอทานอล 200 ไม μL รลิตร 95 - 100% ลงในไลเซทจากขั้นตอนที่ 5
8. ผสมให้เข้ากันโดยการวนและเพิ่มเนื้อหาทั้งหมดของหลอดลงในคอลัมน์ที่มีผลผูกพัน
9. ปั่นเหวี่ยงที่ ≥6500 × g เป็นเวลา 1 นาที
10. ทิ้งหลอดเก็บตัวอย่างที่มีการไหลผ่านและใส่แกนเข้าเล่มลงในหลอดเก็บตัวอย่างขนาด 2 มล. หลอดใหม่
11. เติมน้ำยา μL ความสะอาด 500 มล. (อย่าลืมเจือจางด้วยเอทานอลก่อนใช้งานครั้งแรก) และปั่นเหวี่ยงที่แรงเหวี่ยง ≥6500 × g เป็นเวลา 1 นาที
12. ทิ้งหลอดเก็บตัวอย่างและการไหลผ่านและใส่แกนที่เย็บเล่มลงในหลอดเก็บตัวอย่างขนาด 2 มล. ใหม่
13. เติมน้ำยา μL ความสะอาด 500 000 3 มล. ลงในคอลัมน์ที่มีผลผูกพันและปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงสุด (12,01-16,000 × g) เป็นเวลา 12 นาทีเพื่อทำให้คอลัมน์ที่มีผลผูกพันแห้ง
14. ปิเปตต์ 200 ไมโครลิตรของสารละลายเจือจางลงบนแกน ≥รับการจับและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 1 นาทีที่ μL 6500 × g
15. เก็บดีเอ็นเอที่เจือจางที่อุณหภูมิ -20°C หรือไปยังขั้นตอนการขยาย
    หากใช้ WGA 2 ไม่จำเป็นต้องจัดหา DNA polymerase เนื่องจากมีเอนไซม์มาพร้อมกับชุด
    

Whole Genome Amplification (WGA) Protocol

โปรโตคอลสำหรับ GenomePlex ทั้ง Genome Amplification ดำเนินการกับ GenomePlex ทั้ง Genome Amplification Kit (WGA1)และ/หรือชุดขยาย Genome ทั้งหมดที่สมบูรณ์ (WGA2)

การกระจายตัว

1. เตรียมสารละลาย DNA ขนาด 1 นาโนกรัม/มล. จากโปรโตคอลการแยกเลือดครบตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
2. เติม µL บัฟเฟอร์ 1 แตกตัว 10 μ m µL 10 เท่าลงใน DNA ขนาด 1 μ m (µL นาโนกรัม/ตารางเมตร) ในหลอด PCR
3. วางท่อในช่องระบายความร้อนที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 4 นาที หมายเหตุการบ่มเชื้อต้องใช้เวลานานและการเบี่ยงเบนใดๆอาจเปลี่ยนแปลงผลลัพธ์ได้ 
4. ทำให้ตัวอย่างเย็นลงทันทีบนน้ำแข็งและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ

Library Preparation

1. เพิ่ม µL บัฟเฟอร์ 2 รับเตรียมไลบรารี 1 หรือ ชุด 
2. เพิ่ม 1 ชุดของโซลูชันการ µL ให้ห้องสมุดเสถียร
3. ผสมให้เข้ากันและใส่ในช่องระบายความร้อนที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 2 นาที
4. ทำให้ตัวอย่างเย็นลงบนน้ำแข็งและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ
5. เติมเอนไซม์เตรียมห้องสมุด 1 µL ผสมให้เข้ากันและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ
6. ใส่ตัวอย่างลงในไซโคลนความร้อนและบ่มดังนี้:
       16°C เป็นเวลา 20 นาที
       24°C เป็นเวลา 20 นาที
       37°C เป็นเวลา 20 นาที
       75°C เป็นเวลา 5 นาที
       4°C
7. นำตัวอย่างออกจากเครื่องปั่นแบบใช้ความร้อนและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆ สามารถขยายตัวอย่างได้ทันทีหรือเก็บไว้ที่อุณหภูมิ - 20°C สูงสุดสามวัน
   

การขยายเสียง

1. เพิ่มสารตัวกระ µL ต่อไปนี้ลงในปฏิกิริยา 15 μ s ทั้งหมด:
       7.5 µL 10 เท่า Amplification Master Mix
       47.5 µL น้ำเปล่าฟรี
       5.0 µL JumpStart Taq DNA Polymerase (12.5 หน่วย) สำหรับ WGA1
       - หรือ -
       5.0 µL WGA DNA Polymerase สำหรับ WGA2 
2. ผสมให้เข้ากันปั่นเหวี่ยงเป็นเวลาสั้นๆและเริ่มการปั่นด้วยความร้อน
   
3. หลังจากปั่นจักรยานเสร็จแล้วให้รักษาปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 4°C หรือเก็บที่อุณหภูมิ– 20°C จนกว่าจะพร้อมสำหรับการวิเคราะห์หรือการทำให้บริสุทธิ์
   

การขยายเสียง

1. เติมดีเอ็นเอขยาย µL วน 1 นาโนกรัม/มล. WGA 10 มล. ลงในหลอด PCR หรือแผ่นมัลติเวล
   จำเป็นต้องทำความสะอาดปฏิกิริยา WGA เพื่อลดอคติที่เป็นไปได้ในการขยายซ้ำ เราขอแนะนำให้ใช้ชุดทำความสะอาด GenElute ™ PCR (หมายเลขผลิตภัณฑ์ NA1020) หรือวิธีการทำให้บริสุทธิ์มาตรฐานที่แยกดีเอ็นเอเดี่ยวและคู่ที่ติดอยู่
2. สร้างการผสมผสานการขยายเสียง สำหรับปฏิกิริยาการขยายแต่ละครั้งให้เพิ่มสิ่งต่อไปนี้ลงใน DNA ที่ขยายของ WGA (ขั้นตอนที่ 1):
       47.5 µL ของน้ำที่ไม่มี
       การปล่อยนิวเคลียร์ 7.5 µL ของ 10 X Amplification Master Mix
       5 µL ของ WGA DNA Polymerase
3. Vortex อย่างละเอียด, ปั่นเหวี่ยงสั้นๆและเริ่มต้น thermycycling โปรไฟล์ต่อไปนี้ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับ PE 9700 หรือเทอร์โมไซเซอร์ที่เทียบเท่า:
       การลดความอิ่มตัวเริ่มต้น 95°C เป็นเวลา 3 นาที
       ทำ 14 รอบดังนี้:
           ความสูง 94°C เป็นเวลา 15 วินาที
           หลอม/ขยาย 65°C เป็นเวลา 5 นาที
4. หลังจากปั่นจักรยานเสร็จแล้วให้รักษาปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 4°C หรือเก็บที่อุณหภูมิ– 20°C จนกว่าจะพร้อมสำหรับการวิเคราะห์หรือการทำให้บริสุทธิ์ ความเสถียรของ WGA DNA เทียบเท่ากับ DNA จีโนมิกที่เก็บไว้ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน
   

การทำให้บริสุทธิ์ของตัวอย่าง Buccal Swab ที่ขยาย

การทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ที่ขยายด้วย GenElute PCR ชุดทำความสะอาด(NA1020)

1. ใส่คอลัมน์เย็บเล่ม GenElute Miniprep (ที่มีโอริงสีน้ำเงิน) ลงในหลอดเก็บตัวอย่างที่ให้มาหากยังไม่ได้ประกอบ เติมสารละลายเตรียมคอลัมน์ 0.5 มล. ลงในคอลัมน์ miniprep แต่ละคอลัมน์และปั่นเหวี่ยงที่แรงเหวี่ยง 12,000 x g เป็นเวลา 30 วินาทีถึง 1 นาที ทิ้ง Eluate
   โซลูชันการเตรียมคอลัมน์ช่วยเพิ่มการยึดเกาะดีเอ็นเอให้กับเมมเบรนทำให้ได้ผลผลิตที่สม่ำเสมอมากขึ้น
2. เพิ่มสารละลายที่มีผลผูกพัน 5 ปริมาตรลงในปริมาตร 1 ของปฏิกิริยา PCR และการผสม ตัวอย่างเช่นเพิ่มสารละลายที่มีผลผูกพัน 500 µL ลงใน 100 µL ของปฏิกิริยา PCR ถ่ายโอนโซลูชันลงในคอลัมน์การเชื่อมโยง ปั่นเหวี่ยงคอลัมน์ด้วยความเร็วสูงสุด (12,000 ถึง 16,000 x g) เป็นเวลา 1 นาที ทิ้งหลอดดูดเลือดแต่เก็บหลอดเก็บตัวอย่างไว้
3. ใส่แกนที่เย็บเข้าไปในหลอดเก็บตัวอย่าง ใช้น้ำยาทำความสะอาดเจือจาง 0.5 มล. กับคอลัมน์และปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วสูงสุด 1 นาที ทิ้งหลอดดูดเลือดแต่เก็บหลอดเก็บตัวอย่างไว้
   ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้เติมเอทานอลลงในน้ำยาล้างน้ำยาเข้มข้นก่อนใช้ครั้งแรก โปรดดูคำแนะนำในการเตรียมการ
4. ใส่คอลัมน์กลับเข้าไปในหลอดเก็บตัวอย่าง ปั่นเหวี่ยงคอลัมน์ที่ความเร็วสูงสุดเป็นเวลา 2 นาทีโดยไม่ต้องใช้น้ำยาล้างเพิ่มเติมเพื่อขจัดเอทานอลส่วนเกิน ทิ้งอิลูเอตที่เหลืออยู่รวมทั้งหลอดเก็บตัวอย่าง
5. ถ่ายคอลัมน์ลงในหลอดเก็บตัวอย่างขนาด 2 มล. ที่สดใหม่ ใช้สารละลายเจือจาง 50 μ m หรือ µL ที่ตรงกลางของแต่ละคอลัมน์ บ่มเชื้อที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 นาที
   เมื่อใช้น้ำในการเดินทางตรวจสอบให้แน่ใจว่าค่า pH ของน้ำอยู่ระหว่าง 5.5 ถึง 8.5 นอกจากนี้ยังสามารถใช้สารละลายเจือจางเจือจางด้วยน้ำได้ 10 เท่า
6. ในการกำจัดดีเอ็นเอให้ปั่นเหวี่ยงคอลัมน์ด้วยความเร็วสูงสุด 1 นาที ขณะนี้ผลิตภัณฑ์ขยาย PCR มีอยู่ใน eluate และพร้อมสำหรับการใช้งานทันทีหรือจัดเก็บที่อุณหภูมิ– 20°C
   

การวัดปริมาณของตัวอย่าง Buccal Swab ที่ขยาย

ปริมาณของ DNA ที่ขยายโดยใช้การขยายจีโนมทั้งหมดสามารถตรวจจับได้โดยมีหรือไม่มีการทำให้บริสุทธิ์ สำหรับตัวอย่างที่มีคุณภาพสูงสุดของดีเอ็นเอขอแนะนำอย่างยิ่งให้ทำความสะอาดตัวอย่างหลังจากการขยาย ผลิตภัณฑ์ที่ขยายสามารถวัดได้ด้วย PicoGreen^® dsDNA Quantitation Assay จาก Molecular Probes Inc. (7589) อีกวิธีหนึ่งในการตรวจจับผลิตภัณฑ์ที่มีการขยายคือการดูดกลืนสเปกโตรโฟโต เมตริก (OD260) บนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop ® เครื่องมือนี้สามารถ μL การวัดการดูดซับของตัวอย่าง 1 μ m ในช่วงไดนามิกขนาดใหญ่ 2 (37-3,700 นาโนกรัม/μL)

ข้อมูลแอปพลิเคชันสำหรับการขยายตัวอย่าง Buccal Swab

การขยายจีโนมทั้งหมดดำเนินการกับตัวอย่างสวาบของ buccal

ผลิตภัณฑ์ที่ขยายจะถูกแสดงผลบนเจล agarose 1.5% 5 µL ของผลิตภัณฑ์ที่ขยายได้รับการโหลดต่อหลุม ผลิตภัณฑ์ที่ขยาย GenomePlex ทำให้มีขนาดเฉลี่ย 400 bp รูปแบบรอยเปื้อนจะแตกต่างกันไปตามแหล่งที่มาตามที่แสดงบนเจล

เลน 1 - 1 kb บันได
เลน 2 - Blood
Lane 3 - Plant
Lane 4 - Buccal Swab
Lane 5 - Soil
Lane 6 - Positive Control Lane
7 - 1 kb Ladder

ต้องมีเอกสารเพิ่มเติม

• สแวบตัวเล็ก
• หลอดเก็บตัวอย่างขนาดเล็ก 1.5 มล
• เครื่องปั่นแยกขนาดเล็ก (พร้อมโรเตอร์สำหรับหลอดขนาด 2 มล.)
• อ่างน้ำหรือบล็อกความร้อน 55°C