การจัดการ Oligonucleotide และความเสถียร

• เงินบำนาญการจัดเก็บและนิสัยการทำงาน
• Preparing Solutions
• ตัวอย่างการคำนวณเงินบำนาญแบบยาว
• การตรวจสอบปริมาณ
• สรุป

ดีเอ็นเอ oligonucleotides เป็นโมเลกุลที่ค่อนข้างเสถียร (ตารางที่ 1) อย่างไรก็ตามพวกเขาต้องการเทคนิคการจัดการและการจัดเก็บบางอย่างเพื่อให้แน่ใจว่าการทดลองที่ปราศจากปัญหาและยืดอายุการเก็บรักษาตามลำดับ

ตารางที่ 1 อายุการเก็บรักษาโดยประมาณของ oligonucleotides ดีเอ็นเอที่ไม่ได้ปรับเปลี่ยนและมีการจัดเก็บที่เหมาะสม ค่าเหล่านี้เป็นค่าโดยประมาณและไม่รับประกัน

เงินบำนาญการจัดเก็บและนิสัยการทำงาน

Non-modified DNA

เงินบำนาญ นอกจากจะมีการร้องขอให้จัดส่งในสารละลายแล้ว DNA oligonucleotides เดี่ยวทั้งหมดจะแห้งและพร้อมสำหรับการใช้งานเมื่อ resusPension ยกเว้นลำดับ thiol-modified (ตาม thi sreduction protoco LTO เปิดใช้งาน oligonucleotides) เหล่านี้  ควรใช้บัฟเฟอร์ที่อ่อนแอเช่น TE (ทริส 10 มม., pH 7.5 ถึง 8.0 EDTA 1 มม.) หรือทริส (ทริส - HCl 10 มม., pH 8.0 โดย TE เป็นตัวเลือกที่ดีที่สุด หาก TE ไม่เหมาะสำหรับเทคนิค/การใช้งานสุดท้ายน้ำปลอดเชื้อที่ปราศจากนิวไคลด์เป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดอันดับสอง

การจัดเก็บ ตามที่แสดงในตารางที่ 1 การจัดเก็บที่อุณหภูมิ -20°C จะให้อายุการเก็บรักษาที่ยาวนานที่สุด บัฟเฟอร์ TE เป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดแน่นอนเป็นน้ำเกรดห้องปฏิบัติการมักจะเป็นกรดเล็กน้อยซึ่งช้าย่อยสลายดีเอ็นเอ นอกจากนี้ oligos แห้งไม่เคยแห้งอย่างแท้จริง ความชื้นบางอย่างยังคงอยู่เสมอซึ่งจะนำไปสู่การย่อยสลายช้า อย่างไรก็ตามไม่น่าจะมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความมั่นคงเป็นเวลาอย่างน้อย 2 ปีไม่ว่าจะเก็บไว้ในที่แห้งในน้ำหรือในบัฟเฟอร์

Non-Modified RNA

เงินบำนาญ ควรใช้ RNA oligonucleotides แบบเดี่ยวอีกครั้งตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับดีเอ็นเอที่ไม่ได้ปรับเปลี่ยน

การจัดเก็บ อาร์เอ็นเอไม่เสถียรมากกว่าดีเอ็นเอเนื่องจากโครงสร้างทางเคมี RNA อยู่ภายใต้ภาวะ autocatalysis (รูปที่ 1) รวมทั้งการย่อยสลายโดย RNases ซึ่งมีอยู่มากมายในห้องปฏิบัติการเนื่องจากมีแหล่งที่มาเช่นเซลล์ผิวหนังที่มีอาการไอและจุลินทรีย์ที่มีอยู่ทั่วไป

รูปที่ 1 RNA autocatalysis. กลุ่ม 2 '-hydroxyl ของ RNA สามารถนำไปสู่การย่อยสลาย autocatalytic ซึ่งในทางกลับกันภายใต้เงื่อนไขที่ถูกต้องลดปริมาณของ oligonucleotide ที่เป็นประโยชน์

สำหรับการจัดเก็บระยะสั้นควรเก็บ RNA oligonucleotides แบบเกลียวเดี่ยวไว้ในบัฟเฟอร์ TE ที่อุณหภูมิ -80°C ในระยะยาวการจัดเก็บที่อุณหภูมิ -80°C เนื่องจากการตกตะกอนของเอทานอลเป็นตัวเลือกที่ดีที่สุด การใช้ความระมัดระวังเพื่อลดการสัมผัสกับ RNases จะเพิ่มอายุการเก็บรักษา

ทำงานกับอาร์เอ็นเอ RNases มักมีพันธะซัลไฟด์จำนวนมากดังนั้นจึงมีเสถียรภาพมาก สั้นของการใช้สารเคมีที่รุนแรงเพื่อกำจัดเอนไซม์เหล่านี้พวกเขาจะทนต่อวิธีการทั่วไปของการปนเปื้อนเช่น autoclaving ข้อควรระวังต่อไปนี้จะช่วยลดการสัมผัส RNA oligonucleotide ของคุณกับ RNase:

• สมมติว่าทุกอย่างในพื้นที่ทำงาน/ห้องปฏิบัติการของคุณมีการปนเปื้อน RNases
• ใช้ส่วนที่แยกต่างหากของห้องปฏิบัติการที่ทุ่มเทให้กับการทำงานกับ RNA เท่านั้น
• ทำความสะอาดพื้นที่แยก RNA ด้วยสารที่ทำลาย RNases เป็นประจำ
• ใช้สารเคมีน้ำยาและน้ำที่ได้รับการรับรองว่าปราศจาก RNase
• ใช้เครื่องมือเช่นไมโครปิเปตต์ที่ใช้สำหรับการทำงานกับ RNA เท่านั้น
• สวมถุงมือเสมอและเปลี่ยนถุงมือหลังจากสัมผัสพื้นผิวอื่นๆ

Modified Oligonucleotides

เงินบำนาญ ควรใช้ oligonucleotides ดัดแปลงไม่ว่าจะเป็น DNA หรือ RNA ในบัฟเฟอร์ TE นี่เป็นสิ่งสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับหลอดไฟฟลูออเรสเซนต์เนื่องจากค่า pH สามารถส่งผลกระทบอย่างมากต่อความเข้มของการปล่อยฟลูออเรสเซนต์

การจัดเก็บ oligonucleotides ดัดแปลงควรมีโปรไฟล์ความเสถียรคล้ายกับดีเอ็นเอที่ไม่ได้ปรับเปลี่ยนและคู่ค้าของ RNA ดังนั้นจึงควรเก็บไว้ตามคำแนะนำข้างต้นสำหรับ DNA และ RNA เพื่อป้องกันการฟอกสีด้วยแสงควรเก็บ oligonucleotides ที่ติดฉลากด้วยการเรืองแสงไว้ในที่มืด

การปรับเปลี่ยนหลอดฟลูออเรสเซนต์ เพื่อป้องกันการฟอกสีด้วยแสงเมื่อทำงานกับ moieties เรืองแสงให้เก็บไว้ในหลอดสีเหลืองอำพันหรือหากถ่ายโอนไปยังหลอดใสให้ห่อด้วยฟอยล์

Duplex Oligonucleotides

นักวิทยาศาสตร์ของเราได้พบว่า duplexes sirna จะมีเสถียรภาพอย่างน้อย 3 ปีเมื่อเก็บไว้แห้งที่ -20°C ดีเอ็นเอดูเพล็กซ์ควรจะเป็นเพียงมีเสถียรภาพถ้าไม่มาก (ค่านี้เป็นค่าประมาณและไม่รับประกัน หากต้องการรับวันหมดอายุที่กำหนดโดยการทดลองด้วยการรับประกันโปรดสอบถามเกี่ยวกับการศึกษาความมั่นคง [ ด้านล่าง ] กับเรา)

Single-Use Aliquots

ในขณะที่วงจรการแช่แข็ง/ละลายเชื่อว่าจะลดดีเอ็นเอจีโนมิกซึ่งอาจเกิดจากการตัดเนื่องจากการก่อตัวของผลึกน้ำแข็ง¹นักวิทยาศาสตร์ของเราพบว่า oligonucleotides ไม่ได้รับผลกระทบในเชิงลบจากรอบดังกล่าว อย่างไรก็ตามการจ่าย oligonucleotides เป็นอะลิควอทที่ใช้ครั้งเดียวแล้วแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20°C ยังคงเป็นวิธีปฏิบัติที่ดีที่สุด ซึ่งจะช่วยป้องกันของเสียจากอุบัติเหตุเช่นการปนเปื้อนหรือการหกล้น ตัวอย่างเช่นหากคุณทำน้ำมัน Oligonucleotide ในหลอดเดียวหกลงบนพื้นคุณจะต้องเรียงลำดับใหม่ อย่างไรก็ตามหากคุณหกอะลิควอทหนึ่งอันบนพื้นคุณสามารถละลายน้ำแข็งหลอดอื่นได้

Preparing Solutions

ปริมาณ Oligonucleotide พบได้ทั้งบนฉลากหลอดและแผ่นข้อมูลทางเทคนิคมีให้ในหลายหน่วยรวมถึงความหนาแน่นของแสง (OD), ไมโครกรัม (µg ; โดยการขยาย, µg/OD) และนาโนโมเลส (nmol) วิธีการวัดปริมาณของเราเริ่มต้นด้วยการอ่านค่าการดูดซับที่ 260 นาโนเมตรในเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV/Vis เพื่อให้ค่า OD - หน่วยอื่นๆทั้งหมดได้มาจากค่า OD นี้ (หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมโปรดดูที่ การวัดปริมาณ oligonucleotide) หน่วยของปริมาณซึ่งเป็น nmol มีประโยชน์มากที่สุดสามารถใช้ได้โดยตรงเพื่อสร้างโซลูชันสต็อก

มีหลายหน่วยของความเข้มข้นแต่ micromolar (µM) อาจเป็นหนึ่งที่ใช้กันมากที่สุดกับ oligonucleotides ที่นี่เริ่มต้นด้วยปริมาณ nmol ที่กำหนดไว้แล้วที่พบในฉลากหลอด/แผ่นข้อมูลทางเทคนิคทั้งการคำนวณแบบ longform และทางลัดที่จำเป็นในการสร้างโซลูชันสต็อก 100 µM เช่นเดียวกับโซลูชันการทำงาน 10 µM จะได้รับเป็นตัวอย่าง เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่รวดเร็วขึ้นรวมถึงการคำนวณความเข้มข้นในหน่วยอื่นๆโปรดใช้โมดูล resusPension และเจือจางของ OligoEvaluator ™

ตัวอย่างการคำนวณเงินบำนาญแบบยาว

เราต้องการทำงานในหน่วยฐานเพื่อช่วยป้องกัน ' ความสับสนในการแปลง ' ในระหว่างการวิเคราะห์ขนาด การทำผิดพลาดเป็นเรื่องง่ายเมื่อพยายามแปลงค่าระหว่าง nmol, µM และยูนิตซับเบสอื่นๆโดยตรง

ขั้นตอนที่ 1 แปลงจำนวน nmol บนป้ายชื่อหลอด/แผ่นข้อมูลทางเทคนิคเป็นโมล

oligonucleotide สมมุติของเรามาถึงด้วยปริมาณ 49.9 nmol

โมล = 49.9 นาโนโมล x 1 โมล 109 นาโนโมล^-1

โมล = 4.99 x 10^-8
 

ขั้นตอนที่ 2 แปลงความเข้มข้นของสารละลายในสต็อกที่ต้องการที่ 100 µM เป็น molarity

100 µM = 100 µโมล L^-1

M (โมล L^-1) = 100 µโมล L^-1 x 1 โมล 106 โมล ^-1

M (โมล L^-1) = 1 x 10^-4
 

ขั้นตอนที่ 3 ใช้ความเข้มข้นของสารละลายในสต็อกที่ต้องการในความเป็นโมลและจำนวนโมลเพื่อคำนวณปริมาณเป็นลิตรที่จำเป็นสำหรับการนำกลับมาใช้ใหม่

1 x 10^-4 mol L-1 = 4.99 x 10^-8 mol

L = 4.99 x 10^-8 โมล /1 x 10^-4 โมล

 

ขั้นตอนที่ 4 แปลงลิตรเป็นไมโครลิตร (µL)

ปริมาตร = 4.99 x 10^-4 ลิตร x 10⁶ µล.^-1

ปริมาตร = 4.99 µล
 

ตัวอย่างการคำนวณเงินบำนาญทางลัด

ขั้นตอนที่ 1 ใช้จำนวน nmol จากฉลากหลอด/เอกสารข้อมูลทางเทคนิคและคูณด้วย 10 เพื่อให้ได้ปริมาณเงินบำนาญในไมโครลิตร

ปริมาตร = 4.99 นาโนโมล x 10

ปริมาตร = 499 µล

การคำนวณทางลัดนี้ใช้ได้กับการสร้างโซลูชัน 100 µM เท่านั้น

ในกรณีนี้ให้เติมน้ำ 499 µL หรือบัฟเฟอร์ลงในหลอดที่มี oligonucleotide แล้วหมุนวนเพื่อให้แน่ใจว่ามีการผสมที่เพียงพอ

ความคิดเพิ่มเติมเกี่ยวกับเงินบำนาญ

ตัวอย่างเงินบำนาญข้างต้นนี้ใช้ 100 µM เนื่องจากเป็นความเข้มข้นของสารละลายในห้องปฏิบัติการทั่วไป การสร้างโซลูชันสต็อกที่มีความเข้มข้นต่ำกว่า 100 มล. อาจเป็นปัญหาได้เนื่องจากปริมาณที่ µM เป็นในการใช้เงินบำนาญใหม่สามารถเกินความจุ 2 มล. ของหลอดได้อย่างง่ายดาย ตัวอย่างเช่นในการสร้างโซลูชันสต็อก 20 µM โอลิโกโน ucleotide เฉพาะนี้ซึ่งมีอยู่ที่ 49.9 นาโนโมลจะต้องเติมน้ำหรือบัฟเฟอร์ 2.49 มล. ลงไป

ในทำนองเดียวกันการพยายามสร้างโซลูชันสต็อกที่มีความเข้มข้นมากขึ้นซึ่ง 100 µM อาจเป็นปัญหาได้ ตัวอย่างเช่นในการสร้างโซลูชันสต็อก 1000 µM โอลิโกโน ucleotide เฉพาะนี้จะต้องใช้น้ำหรือบัฟเฟอร์ 49.9 µL ปิเปตต์ขนาดเล็กนี้สามารถดูดได้อย่างแม่นยำจากหลอดขนาด 2 มล.

ในการสร้างโซลูชันสต็อก 100 μ s การคำนวณและเครื่องมือออนไลน์นั้นไม่ µM เป็นเนื่องจากปริมาณเงินบำนาญที่ต้องการจะรวมอยู่ในเอกสารข้อมูลทางเทคนิค

ตัวอย่างการคำนวณโซลูชันการทำงาน

ในตัวอย่างนี้เราจะสมมติว่าโซลูชันการ µM งาน 10 μ m สุดท้ายจะอยู่ในปริมาตร 20 μ m ซึ่งเป็นปกติ µL รับ PCR

ขั้นตอนที่ 1 ใช้สูตรความเข้มข้นปริมาณที่เท่ากันนี้

C₁V₁ = C₂V₂

100 µM x V₁ = 10 µM x 20 µL

V₁ = 2 µL

ในกรณีนี้ให้เพิ่มสารละลาย 2 µL ของสต็อกลงในหลอดปฏิกิริยาและพร้อมกับส่วนประกอบอื่นๆให้นำปริมาตรสุดท้ายด้วยน้ำหรือบัฟเฟอร์ไปที่ 20 µL

การตรวจสอบปริมาณ

เราดูแลอย่างดีเพื่อให้มั่นใจว่าค่า OD ของเรามีความถูกต้อง อย่างไรก็ตามคุณอาจยังต้องการตรวจสอบปริมาณของ oligonucleotide ของคุณ ในกรณีนี้หากคุณมีเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV/Vis แบบดั้งเดิมวิธีการนั้นง่าย

ทำตามขั้นตอนต่อไปนี้:

1. resuspend oligonucleotide ใน 400 µL ของน้ำหรือบัฟเฟอร์
2. เจือจาง 12 µL เป็น 988 µL ของน้ำปลอดเชื้อนิวไคลด์
3. เก็บ ตัวอย่างขนาด 26 0 มล. 1 ตัวอย่างลงในคิวเวทท์
4. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าค่า OD อยู่ในช่วงลิเนียร์ (~ 0.1 ถึง 1 OD)
5. คูณ OD ของปริมาตรตัวอย่างด้วยปัจจัยการเจือจาง
   OD ทั้งหมด = OD ของ ตัวอย่าง 1 ม. L X 400/12
6. หลาย OD รวมโดย µg/OD (จากเอกสารข้อมูลทางเทคนิค) ที่จะได้รับ µg

สรุป

แม้จะมีการรักษาที่ไม่ดีแต่ดีเอ็นเอที่มีการพันกันมากที่สุดจะมีความเสถียรพอที่จะทำงานได้ดีถ้าพวกเขาจะใช้ไม่นานหลังจากการส่งมอบ หากต้องการความช่วยเหลือเพิ่มเติมโปรดปรึกษากลุ่มบริการด้านเทคนิคของเรา A [email protected]

ข้อมูลอ้างอิง

1. Roder B, Fruhwirth K, Vogl C, Wagner M, Rossmanith P. 2010. Impact of Long-Term Storage on Stability of Standard DNA for Nucleic Acid-Based Methods. Journal of Clinical Microbiology. 48(11):4260-4262. https://doi.org/10.1128/jcm.01230-10