Truy cập ngày 1 tháng 2 năm 2015. ^ Sanger Whole Genome CRISPR

Sàng lọc mất chức năng toàn bộ gen là một cách tiếp cận mạnh mẽ để khám phá các gen và con đường làm nền tảng cho các quá trình sinh học. Để giúp bạn làm sáng tỏ các gen và con đường quan tâm, chúng tôi đã hợp tác với Viện Wellcome Sanger để tạo ra các thư viện loại trực tiếp CRISPR do vi-rút gây ra đầu tiên cho bộ gen người và chuột.¹ bao gồm hơn 17.000 gen người và hơn 20.000 gen chuột với hai gRNA được tối ưu hóa cho mỗi gen, các thư viện mảng của Sanger Whole Genome của chúng tôi là những công cụ mạnh mẽ có thể giúp bạn thực hiện khám phá thú vị tiếp theo.

Màn hình được sắp xếp có hiệu quả và linh hoạt, ngay cả trong các đường ống tế bào khó chuyển đổi

Trong khi các thư viện CRISPR gộp có thể cung cấp loại trực tiếp trên toàn bộ gen, một cách tiếp cận mảng mang lại nhiều lợi ích:  

• Nội dung kiểu hình phong phú: Tính linh hoạt trong các cuộc thử nghiệm chức năng và khả năng phân tích vượt quá khả năng tồn tại - sử dụng tạo ảnh tế bào, huỳnh quang, phát quang và đọc đo màu
• Phân tích dữ liệu hợp lý: Nhận dạng cú đánh dễ dàng mà không cần giải mã
• Độ nhạy cao: Một mục tiêu duy nhất ở mỗi giếng cung cấp tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu tốt hơn  
• Dễ nhận dạng gen ứng cử viên: Gần gũi hơn với tương quan kiểu hình 
• Tính linh hoạt: Có thể được áp dụng cho một loạt các loại tế bào bao gồm tế bào chính và tế bào thần kinh

Các thư viện CRISPR dàn dựng Sanger của chúng tôi chỉ dành riêng cho danh mục Sigma-Aldrich ® và có sẵn ngoài kệ hàng. Chúng có thể được kết hợp với các công cụ khác để có được kết quả bạn cần: thực hiện các thí nghiệm thí điểm ban đầu và tối ưu hóa hệ thống di động của bạn và các xét nghiệm với các điều khiển CRISPR của chúng tôi, hoặc sử dụng các thư viện được sắp xếp như một phần của các thí nghiệm bổ sung với các thư viện CRISPR, RNAi và ORF hiện có của chúng tôi để xác thực hoặc cứu hộ. 

Bắt đầu màn hình CRISPR của bạn ngay hôm nay

Tại sao phải khắc phục sự cố kết quả dương tính giả khi bạn có thể sử dụng thư viện Sanger CRISPR được tối ưu hóa, được phân mảng bởi gRNA? Thư viện Sanger CRISPR độc quyền của chúng tôi cung cấp loại gen sâu rộng, chất lượng cao, vì vậy bạn có thể theo dõi nhanh nghiên cứu của mình với toàn bộ thư viện được dàn dựng bộ gen đầu tiên. 

Màn hình CRISPR dựa trên vi-rút của chúng tôi cung cấp nhiều lựa chọn trong ứng dụng của chúng:

• Biến đổi ổn định hoặc thoáng qua
• Làm phong phú dân số của các tế bào (các vectơ cho phép chọn lọc dựa trên puromycin và BFP) 
• Thẻ BFP cho phép hiển thị các ô dương (Hình 1)
• Tạo ra một dòng tế bào ổn định với các hạt virus để tích hợp liên tục
• Chuyển đổi hầu như bất kỳ loại ô nào (cả đường ô chia và không chia)
• Có được các thang tùy chỉnh, phù hợp với bất kỳ ứng dụng nào

Hình 1. Biểu hiện BFP trong các tế bào ổn định A549-Cas9-Blast bị nhiễm virus lenti-gRNA, bảy ngày sau nhiễm trùng, phóng đại 20x.

Bạn cần trợ giúp về các nguyên tắc cơ bản của CRISPR?  

 Thông số kỹ thuật Thư viện Sanger

Glycerol Format

• Khoảng 400 96 tấm, 50 µL vi khuẩn glycerol trên mỗi bản sao
• Loài người hay chuột

Lentiviral Format

• Khoảng 100 384 tấm costar có nhãn mã vạch với vòng đệm nhôm có thể xỏ được
• 10 ul mỗi bản sao ở mức tối thiểu 1x10 6particles/mL được xác định bởi p24 xét nghiệm
• Loài người hay chuột

Sanger CRISPR Guide RNA Design and Vector Features (bằng tiếng Anh)

gRNA Design

• Tối đa hóa việc loại bỏ gen bằng cách nhắm vào nửa đầu của chuỗi mã hóa protein
  
• Tối ưu hóa việc nhắm mục tiêu tất cả các bảng điểm
  
• Tránh 90 bp đầu tiên của trình tự mã hóa trong đó các codon bắt đầu thay thế thường nằm
  
• Hướng đến các chuỗi được bảo tồn cao tránh SNP, để đảm bảo đại diện trong nhiều dòng tế bào
• Các quy tắc nghiêm ngặt làm giảm hoặc loại bỏ khả năng gây ra các hiệu ứng ngoài mục tiêu

Vector Features

• Đơn giản hóa quy trình công việc bằng lựa chọn puromycin
• Trực quan hóa các tế bào biểu hiện CRISPR và làm phong phú dân số được chuyển đổi bằng BFP
• Các vị trí transposase cung cấp một sự thay thế cho việc phân phối lentivirus

Hình 2. Sơ đồ vectơ Sanger Lentiviral CRISPR (LV04)

Chuyên gia sản xuất Lentiviral

Chúng tôi cam kết cung cấp hỗ trợ sản xuất GAND không gì sánh được cho công nghệ chỉnh sửa bộ gen.  Robot hiện đại, xử lý chất lỏng, LIMS và các phòng thí nghiệm chuyên dụng chúng tôi cung cấp chất lượng vượt trội và dịch vụ tiện lợi cho nhu cầu nghiên cứu CRISPR của bạn.

Nhân viên và hệ thống sản xuất chất lượng cao:

•  Xử lý robot thông lượng cao (HT)
• 1D và 2 Dbarcoding
• Các chuyên gia được đào tạo cao với 10> năm kinh nghiệm chỉnh sửa gen lentiviral
  
• Sản xuất virus thông lượng cao

Từ mục tiêu đơn lẻ đến toàn bộ bộ bộ gen

Thư viện Sanger là công cụ duy nhất cho phép thẩm vấn CRISPR KO toàn bộ bộ bộ gen và đọc kiểu hình tinh vi theo định dạng mảng thuận tiện. Đối với các thí nghiệm quy mô nhỏ hơn, được hưởng lợi từ chất lượng sản xuất của chúng tôi và chuyên môn thiết kế của Viện Wellcome Sanger để xây dựng một bảng điều khiển tùy chỉnh cho nghiên cứu của bạn.

Do you need more focused or affordable screens?

• Chọn một bản sao Sanger QuickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPickPick
• Anh đào chọn một bảng điều khiển Sanger tùy chỉnh với bất kỳ kích thước nào
  
• Sắp xếp bất kỳ thiết kế gRNA nào trong vector Sanger
• Nhắm vào bất kỳ con đường hoặc gia đình gen nào bằng bảng điều khiển Sanger

Human Druggable Thuốc ức chế khối u Transcription Factors Cancer Cell Biology Protein bề mặt tế bào Di truyền biểu sinh Cell Cycle Kinase GPCR Chết rụng Cell Adhesion Các thụ thể cytokine & cytokine Ubiquitin ligases

Ubiquitin Enzymes Membrane Trafficking Kênh ion DNA Repair Protease Phosphatase B Cell Activation Kích hoạt ô T Helicase JAK-STAT Protease ubiquitin Thụ thể hormone hạt nhân

Không thấy sự lựa chọn bạn cần? Xác định gRNA của riêng bạn để sản xuất trong xương sống Sanger. Từ các thư viện bộ gen cho đến các bản sao riêng lẻ.

  Dữ liệu ứng dụng Sanger g RNA

GRNA màn hình gây sốc được tối ưu hóa và tạo điều kiện chỉnh sửa gen mạnh mẽ. Được thiết kế để tối đa hóa loại trực tiếp, các gRNA có hiệu quả cao như đánh giá bởi các xét nghiệm CEL-I để phát hiện nội bộ. Ngoài ra, hai gRNA được cung cấp cho mỗi gen, cho phép phân tầng ứng viên sau màn hình toàn bộ bộ gen, tối đa hóa hiệu quả và giảm dương tính giả.

A.

B.

C.

Hình 3. Các bản sao từ thư viện Sanger lenti-gRNA chứng minh chỉnh sửa gen dứt khoát trong xét nghiệm CEL-I để phát hiện đột biến. Các tế bào A549-Cas9-Blast đã bị nhiễm Sanger Screen gRNA, được chọn bằng puromycin, sau đó phải trải qua xét nghiệm CEL-I.  A) Tăng trưởng tế bào sau khi chọn puromycin trong bốn ngày; B) Representative agarose gel từ xét nghiệm CEL-I cho thấy sự phân cắt DNA trong các mẫu từ các tế bào nhận được hướng dẫn Sanger (làn G7-G12) so với không phân cắt trong kiểm soát; c) Một biểu đồ phân cắt % DNA trong xét nghiệm CEL-I (trục y) cho một lựa chọn đại diện của các bản sao gRNA (mỗi chấm đại diện cho một bản sao) cho thấy hoạt động nuclease trung bình cao và tần số gRNA hoạt động cao.

Xem cách người thiết kế màn hình Sanger sử dụng công cụ này để giúp tìm ra các liệu pháp mới cho các bệnh thoái hóa thần kinh.

Tài liệu tham khảo

1. Metzakopian E, Strong A, Iyer V, Hodgkins A, Tzelepis K, Antunes L, Friedrich MJ, Kang Q, Davidson T, Lamberth J, et al. 2017. Enhancing the genome editing toolbox: genome wide CRISPR arrayed libraries. Sci Rep. 7(1): https://doi.org/10.1038/s41598-017-01766-5

2. Denis Belitškin D, Pant SM, Munne P, Suleymanova I, Belitškina K, Hongisto H, Englund J, Raatikainen T, Klezovitch O, Vasioukhin V, et al. 2021. Hepsin regulates TGFβ signaling via fibronectin proteolysis. EMBO Rep. 22(11): https://doi.org/10.15252/embr.202152532

3. Turner RJ, Golz S, Wollnik C, Burkhardt N, Sternberger I, Andag U, Cornils H. 2020. A Whole Genome-Wide Arrayed CRISPR Screen in Primary Organ Fibroblasts to Identify Regulators of Kidney Fibrosis. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25(6):591-604. https://doi.org/10.1177/2472555220915851

HỘI THẢO QUA WEB MIỄN PHÍ THEO YÊU CẦU: