Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Cơ bản

What is PCR?

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra nhiều bản sao của một vùng DNA cụ thể. PCR có hiệu quả, nhanh chóng và có thể khuếch đại trình tự DNA hoặc RNA từ nhiều nguồn khác nhau. Sau khi DNA đã được khuếch đại đủ, sản phẩm thu được có thể được giải trình tự, phân tích bằng điện di gel, hoặc nhân bản thành một plasmid cho mục đích thực nghiệm.  

PCR hoạt động như thế nào? What are the steps of PCR?

Một phản ứng PCR đơn giản bao gồm DNA đích, một tập hợp các primers oligonucleotide tổng hợp bên sườn chuỗi DNA đích, một DNA polymerase ổn định nhiệt (thường là Ta qpolymerase ) và nucleotide. Ba bước cho mỗi chu kỳ khuếch đại bao gồm biến tính, ủ và mở rộng.

1. Thứ nhất, DNA bị biến tính bằng cách nung nóng đến 90-95 °C, tách DNA sợi kép (dsDNA) thành DNA sợi đơn. Nhiệt độ mà 50% dsDNA bị biến tính được gọi là nhiệt độ nóng chảy (_TM) và được xác định bởi hàm lượng G + C, chiều dài của mẫu và nồng độ ion (chủ yếu là Mg²⁺).
2. Trong bước ủ, mẫu được làm lạnh đến 40-60 °C, cho phép mồi gắn vào DNA đích.
3. Bước PCR cuối cùng xuất hiện ở 70-75 °C và được biết đến là một phần mở rộng. Trong giai đoạn này, DNA polymerase kéo dài DNA từ mồi, tạo ra dsDNA mới với một sợi cũ và một sợi mới.

Mồi PCR là gì?

Mồi là các chuỗi đơn của axit nucleic (oligonucleotide tổng hợp) cần thiết để bắt đầu PCR. Những sợi đơn DNA hoặc RNA này là đặc thù và bổ sung cho phần trình tự DNA/RNA đích. Trong giai đoạn làm mát (ủ) của PCR, mồi liên kết với mục tiêu và bắt đầu sao chép trình tự DNA / RNA đích. Mồi được sử dụng theo cặp, được gọi là mồi xuôi và ngược. Chúng tôi đề xuất rcustom oligo sin đa định dạng.  

Các trình tự mồi phải được chọn để nhắm vào một vùng DNA duy nhất, tránh khả năng lai giống với một trình tự tương tự. Khi thiết kế mồi, các cặp phải có nhiệt độ nóng chảy tương tự vì bước ủ xảy ra cho cả hai sợi cùng một lúc. Hơn nữa, mồi với _nhiệt độ nóng chảy quá cao hơn nhiệt độ ủ của phản ứng có thể lai và mở rộng ở trình tự DNA không mong muốn. A _TM thấp hơn nhiều so với nhiệt độ ủ có thể dẫn đến không ủ.

PCR tạo ra bao nhiêu bản sao DNA?

Bởi vì các sợi được tổng hợp trong một chu kỳ PCR phục vụ như một khuôn mẫu trong chu kỳ tiếp theo, sự gia tăng gấp triệu lần lượng DNA đạt được chỉ trong 20 chu kỳ. Những chu kỳ này có thể được thực hiện tự động bằng dụng cụ vòng tuần hoàn nhiệt.^1,2,3

Popular PCR Products

PCR thường xuyên được sử dụng để tạo ra một lượng DNA khuếch đại cho các ứng dụng xuôi dòng, bao gồm xác minh độ dài nhân bản. Our products offer a variety of options to perform routine PCR. Phản ứng ReadyMix™ PCR hỗn hợp và các tùy chọn nhuộm REDTaq ® mang đến sự thuận tiện hơn cho phản ứng khuếch đại của bạn.   

• DNA polymerase Taq
• PCR Reaction Mixes
  
• Roche Aptaq Nhanh DNA polymerase
• Roche Expand™
• Roche FastStart™ Taq

DNA polymerase Taq

Taq DNA polymerase là một enzyme ổn định nhiệt phân lập từ Thermus aquaticus, một vi khuẩn ưa nhiệt. Ta qis là DNA polymerase được sử dụng phổ biến nhất cho PCR và hiện được biểu hiện tái tổ hợp trong E. coli. Enzyme có khả năng hoạt động 5′ → 3′ polymerase và exonuclease; kiểm tra TRANG SDS không tìm thấy sự ô nhiễm có thể phát hiện được liên quan đến endonuclease hoặc exonuclease.

Table 1.

Mã sản phẩm	Tên sản phẩm	Tính năng
D1806	Taq DNA polymerase với bộ đệm phản ứng 10X	• Bộ đệm được tối ưu hóa với MgCl2
D4545	Taq DNA polymerase với 10X bộ đệm phản ứng không có MgCl2	• Lọ riêng biệt MgCl 2provided

REDTaq^® DNA polymerase

REDTaq^® DNA polymerase là sự pha trộn độc đáo của Taq DNA polymerase với thuốc nhuộm màu đỏ trơ. Sự pha trộn này hoạt động cũng như một  hỗn hợp Ta qenzyme rõ ràng và không can thiệp vào các ứng dụng hạ nguồn. Chức năng chính của nó là nhận dạng – các giải pháp dễ theo dõi trong ống PCR và gel. Nếu cần thiết, thuốc nhuộm có thể được loại bỏ bằng các phương pháp tinh chế tiêu chuẩn sau khuếch đại.

Hình 1. Hiệu suất polymerase REDTaq ® so với Taq tiêu chuẩn trong điều kiện giống hệt nhau.

Hình 2. Thuốc nhuộm REDTaq ® di chuyển giống như một mảnh 125 bp nên không cần tải bộ đệm và theo dõi thuốc nhuộm.

Table 2.

Mã sản phẩm	Tên sản phẩm	Tính năng
D4309	REDTaq® DNA polymerase	• Bộ đệm được tối ưu hóa với MgCl2
D8312	REDTaq® DNA polymerase	• Đối với khuếch đại DNA bộ gen • Bao gồm 10X bộ đệm được tối ưu hóa với MgCl2
D2812	REDTaq® DNA polymerase không có MgCl2	• Đối với khuếch đại DNA bộ gen • Bao gồm 10X bộ đệm và lọ riêng biệt MgCl2
D6063	REDTaq® SuperPak™ DNA polymerase	• Polymerase có khả năng hiển thị cao cho DNA bộ gen • Bao gồm dNTP và bộ đệm PCR được tối ưu hóa 10X MgCl 2

PCR Reaction Mixes

Các  hỗn hợp phản ứng ReadyMix ™ PCR chứa  DNA polymerase Taq chất lượng cao, dNTP tinh khiết 99% và bộ đệm trong tập trung phản ứng được tối ưu hóa 2x. Sản phẩm tiện lợi này giảm đường ống và giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn bằng cách loại bỏ các bước trộn khác nhau. Chỉ cần thêm mẫu và mồi vào hỗn hợp phản ứng ReadyMix™. Hỗn hợp phản ứng PCR được chế tạo để đáp ứng các nhu cầu PCR khác nhau và có thể được mua kết hợp với thuốc nhuộm REDTaq ® để thuận tiện hơn.

Hình 3. Khuếch đại 1, 2, 3 và 7 mảnh kb và 4,5 kb DNA bộ gen người sử dụng ReadyMix™ Taq PCR hỗn hợp.

Table 3.

Mã sản phẩm	Tên sản phẩm	Tính năng
R2523	REDTaq® ReadyMix phản ứng PCR hỗn hợp	• Bao gồm Taq DNA polymerase, 99% deoxynucleotide tinh khiết và bộ đệm phản ứng trong tập trung phản ứng tối ưu hóa 2× • Bao gồm thuốc nhuộm REDTaq để nhận dạng
P4600	ReadyMix™ Taq PCR phản ứng trộn	• Bao gồm Taq DNA polymerase, 99% deoxynucleotide tinh khiết và bộ đệm trong một phản ứng cô đặc tối ưu hóa 2×

Rất tiếc, đã xảy ra lỗi ngoài dự kiến

Response not successful: Received status code 500

Tài liệu tham khảo

1. Innis M. A. 2012. PCR protocols: a guide to methods and applications.. Academic press.

2. Haynie DT. 2001. Biological Thermodynamics. https://doi.org/10.1017/cbo9780511754784

3. McPherson, Mike, Simon M. 2000. PCR. London: Taylor & Francis.