Oligonucleotide Array CGH Phân tích của một phương pháp khuếch đại toàn bộ gen mạnh mẽ

Chad Brueck, Sunny Song¹, Jim Collins¹

Agilent Technologies, 5301 Stevens Creek Blvd., Santa Clara, CA, 95051

Giới thiệu

Trong những năm gần đây, sự lai ghép gen so sánh dựa trên mảng (aCGH) đã được tinh chỉnh để xác định những thay đổi nhiễm sắc thể ở độ phân giải cao hơn dần¹. Tuy nhiên, công nghệ phát triển này hơi bị cản trở bởi yêu cầu đầu vào DNA lớn—tối thiểu 150.000 bản sao của bộ gen người, hoặc 0,5 μg, thường cần cho mỗi mẫu để xử lý một mảng CGH.  Khuếch đại toàn bộ GenomePlex ® (WGA) cung cấp phương tiện để giảm lượng DNA cần thiết cho aCGH, có thể mở rộng ứng dụng của công nghệ để phân tích số lượng nano DNA, hoặc thậm chí là các tế bào đơn lẻ. Hơn nữa, và có lẽ thú vị hơn, GenomePlex WGA cho phép các nhà nghiên cứu khuếch đại đại đại đại đại đại diện bộ gen từ các mẫu đã được phân mảnh đến kích thước trung bình nhỏ hơn 1 kb. Tính năng này có thể cho phép phân tích CGH các mẫu cố định formalin, nhúng paraffin (FFPE) trước đây được cho là không thể sử dụng được do mức độ suy thoái DNA cao của chúng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh việc sử dụng thành công WGA DNA trên Agilent aCGH microarray. Sản phẩm WGA cũng đã được chứng minh là hoạt động trên mảng BAC ^2,  3and oligo Array 4platforms khác.

Vật liệu và phương pháp

DNA Sources

Các DNA di truyền chung bình thường được sử dụng trong thế hệ dữ liệu Agilent đã được mua từ Promega (số sản phẩm G1471 (nam) và G1521 (nữ)). HT29 (dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người) DNA được Agilent sử dụng đã được mua từ ATCC (số sản phẩm HTB-38D).

Văn hóa tế bào và cách ly DNA

Ung thư biểu mô đại tràng ở người HT29 tế bào (số hiệu sản phẩm ATCC HTB-38) được nuôi cấy bằng môi trường 5A của McCoy được bổ sung với 1,5 mm L-glutamine được điều chỉnh để chứa 2,2 g/L natri bicarbonate, 90%; huyết thanh bò của thai nhi, 10%. DNA bộ gen đã được chiết xuất bằng Bộ gen DNA Miniprep gen của động vật có vú Genelute™ (Product G1N70) và được sử dụng trong các mẫu của MilliporeSigma. DNA bộ gen từ nam giới bình thường thu được từ máu của một cá nhân mà không có tiền sử ung thư. DNA bộ gen được chiết xuất bằng cách sử dụng cùng một bộ gen phân lập DNA như mô tả ở trên và được sử dụng trong các mẫu của MilliporeSigma.

Phân mảnh DNA gen

Các DNA di truyền nam và nữ được phát sóng liên tục bằng đầu dò sonicator (Digital Sonifier 450, Branson Ultrasonics Corp., CA) trong 5 giây, 30 giây, 90 giây, hoặc 120 giây. Các DNA bị phân mảnh sau đó được chạy trên gel agarose 1,2% (E-gel agarose gel PN# G5000, Incitrogen, CA) để xác định phân phối kích thước mảnh.

GenomePlex WGA (bằng tiếng Anh)

Các mẫu DNA được khuếch đại bằng bộ gen WGA (Sản phẩm WGA2). Lượng đầu vào DNA vào các phản ứng WGA là 50 ng, ngoại trừ thí nghiệm chuẩn độ trong đó lượng đầu vào được chỉ ra trong văn bản dưới đây. Sau WGA, các mồi và dNTP dư thừa đã được loại bỏ bằng cách làm sạch sản phẩm WGA bằng Bộ công cụ dọn dẹp GenElute PCR (Sản phẩm NA1020).

DNA Labelling and hybridization (bằng tiếng Anh)

Bộ dán nhãn DNA của Agilent CỘNG (Số hiệu linh kiện Agilent 5188-5309) đã được sử dụng để gắn nhãn DNA WGA với cyanine 3 hoặc cyanine 5. Theo khuyến cáo của Agilent, 2,0 - 2,5 μg DNA khuếch đại được sử dụng làm vật liệu đầu vào cho mỗi phản ứng ghi nhãn. Ngoài ra, trong trường hợp ghi nhãn trực tiếp (vật liệu không khuếch đại), 0,5 μg DNA bộ gen được sử dụng làm vật liệu đầu vào cho phản ứng ghi nhãn. Các mẫu có dán nhãn Cyanine 3 và cyanine 5 được trộn lẫn và lai với Agilent microarray từ Human Genome CGH Microarray Kit 105A (Agilent P/N G4412A) hoặc Human Genome CGH Microarray Kit 44B (Agilent P/N G4410B) theo các khuyến nghị xử lý tiêu chuẩn của Agilent.

Quét microarray và phân tích dữ liệu

Quá trình quét và phân tích hình ảnh được tiến hành theo CGH dựa trên mảng oligonucleotide của Agilent cho Giao thức phân tích DNA bộ gen (phiên bản 4,0). Microarray được quét bằng máy quét Agilent DNA Microarray (Agilent P/N G2565BA). Phần mềm trích xuất tính năng của Agilent (v9,1.3) đã được sử dụng để trích xuất dữ liệu từ các tệp hình ảnh microarray thô để chuẩn bị phân tích. Phần mềm Agilent CGH Analytics (v3,4) được sử dụng để trực quan hóa, phát hiện và phân tích các mẫu quang sai từ hồ sơ microarray CGH.

Kết quả

I. Nhập chuẩn độ DNA

Hạn chế lượng mẫu bắt đầu có thể ức chế phân tích CGH của mảng đối với một số mẫu quý giá như chụp các tế bào vi phân tích bằng tia laser hoặc sinh thiết kim. Thí nghiệm được mô tả ở đây được thiết kế để chứng minh rằng GenomePlex WGA có thể được sử dụng để tạo ra dữ liệu aCGH chất lượng cao trên một loạt các đầu vào DNA bộ gen (1-100 ng). WGA cho tất cả các đầu vào trong khoảng 5-10 μg được đo bằng quang phổ UV (dữ liệu không được hiển thị). Sự phân bố kích thước DNA là từ 200 đến 5000 bp được đo bằng phân tích gel agarose (Hình 1, làn 4-7), mặc dù sự phân bố kích thước cho sản phẩm WGA từ các phản ứng với đầu vào 1 ng được thay đổi hơi thấp hơn (Hình 1, làn 7). Các giá trị số liệu hiệu suất của microarray như LogRatio Standard Deviation (DLRSD), Signal-to-Noise Ratio (SNR) và Background Noise (BGNoise) đã chứng minh rằng kết quả aCGH từ các đầu vào khác nhau vào trong các phản ứng WGA (đầu vào 1–100 ng) có thể so sánh (Bảng 1). Giá trị DLRSD cho đầu vào 1 ng cao hơn giá trị đầu vào khác, nhưng nằm trong phạm vi chấp nhận được (xem cước chú Bảng 1). Giá trị nhiễu tỷ lệ nhiễu của đầu dò trên đầu dò thấp cho thấy quang sai nhiễm sắc thể có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy trên phạm vi rộng các khối lượng DNA đầu vào này.

Hình 1. Hình ảnh gel, Tiêu đề nhập WGA. Số lượng tương đương (1 μg/well) khuếch đại (200–5.000 bp) và DNA bộ gen không khuếch đại (> 12.000 bp) HT29 được so sánh thông qua điện di gel. Làn 1 & 3: Dấu hiệu trọng lượng phân tử; Làn 2: HT29 DNA không khuếch đại; Làn 4: HT29 DNA khuếch đại từ đầu vào 100 ng; Làn 5: HT29 DNA khuếch đại từ đầu vào 50 ng; Làn 6: HT29 DNA khuếch đại từ đầu vào 10 ng; Làn 7: HT29 DNA khuếch đại từ đầu vào 1 ng.

Hình 2. Các chữ tượng hình phân tích CGH minh họa dữ liệu chuẩn độ đầu vào từ Agilent Human Genome CGH 105A microarrays. Các biểu đồ hoán đổi thuốc nhuộm được trình bày cạnh nhau trong mỗi bảng (A-F). Phân cực +1 (Cy5-HT29/Cy3-Female) được hiển thị ở bên trái và phân cực -1 (Cy5-Female/Cy3-HT29) được hiển thị ở bên phải. Các biểu đồ CGH này so sánh DNA nữ bình thường so với dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng ở người HT29 có sự xóa bỏ đã biết qua cánh tay p (dịch chuyển ngang sang trái của dòng không), một khuếch đại của cánh tay q trong vùng q23,3-24,33 (dịch chuyển ngang sang phải của dòng không), và xóa tiêu điểm vào năm q23,1. Hoán đổi thuốc nhuộm (chuyển nhãn thuốc nhuộm giữa các mẫu) đã được thực hiện trên các mẫu này để chứng minh rằng kết quả không phải là tác động của sự thiên vị thuốc nhuộm. A: Khuếch đại từ đầu vào 100 ng, B: Khuếch đại từ đầu vào 50 ng, C: Khuếch đại từ đầu vào 10 ng, D: Khuếch đại từ đầu vào 1 ng, E: MilliporeSigma khuếch đại từ đầu vào 10 ng, F: Không khuếch đại

*Xem cước chú Bảng 1 để được giải thích thêm.

Phần mềm phân tích CGH được sử dụng để phân tích các mẫu quang sai trong HT29 DNA khuếch đại qua các đầu vào (Hình 2). Quan điểm nhiễm sắc thể cho tất cả các mức đầu vào đều cho thấy tất cả các quang sai đã biết bao gồm xóa bỏ trên 8p cánh tay, khuếch đại 8q cánh tay và xóa tiêu điểm trong 8q23.1. Những dữ liệu này cho thấy tính toàn vẹn của khuếch đại được duy trì trên một loạt các đầu vào vào WGA. Các kết quả mảng được tạo ra bởi MilliporeSigma so sánh HT29 DNA với DNA từ một bệnh nhân nam duy nhất mà không có tiền sử ung thư, trong khi dữ liệu Agilent được tạo ra bằng cách so sánh sự khác biệt nhiễm sắc thể giữa HT29 và tham chiếu chung của các cá nhân khỏe mạnh. Dữ liệu MilliporeSigma cho thấy giá trị tín hiệu nền cao hơn cũng như giá trị tín hiệu đến nhiễu thấp hơn cho tất cả các đầu vào so với dữ liệu Agilent (Bảng 1), có thể được giải thích tốt nhất bằng sự thay đổi số sao chép; mẫu tham chiếu được gộp được sử dụng trong việc tạo dữ liệu Agilent loại bỏ phần lớn sự thay đổi này. Tóm lại, dữ liệu chỉ ra rằng khi bị giới hạn bởi số lượng mẫu có sẵn, khuếch đại GenomePlex từ ít nhất 1 ng DNA bộ gen khởi đầu có thể tạo ra kết quả CGH nhất quán.

THỨ HAI Khuếch đại từ DNA bị phân mảnh

Nhiều nhà nghiên cứu muốn thực hiện aCGH trên các mẫu tính toàn vẹn đáng ngờ, chẳng hạn như gen DNAs từ FFPE, FROZEN và các mô lưu trữ khác. Mục đích của thí nghiệm sau đây đầu tiên là để đánh giá tính khả thi của việc khuếch đại DNA có trọng lượng phân tử thấp bằng cách sử dụng GenomePlex, và thứ hai, để xác định xem DNA khuếch đại từ các DNA phân mảnh sẽ mang lại kết quả aCGH chấp nhận được. DNA được phát sóng âm với các kích thước khác nhau đã được sử dụng như một nguồn cho DNA bị phân mảnh. Phân bố tính toàn vẹn kích thước được xác định bằng phân tích gel agarose (Hình 3). WGA đã được thực hiện bằng cách sử dụng cả kết quả DNA và aCGH HT29 nguyên vẹn và phân mảnh được hiển thị trong Hình 4, tiết lộ tất cả HT29 quang sai nổi tiếng trên nhiễm sắc thể 8. Hơn nữa, các giá trị số liệu chất lượng dữ liệu vi mảng có mối tương quan cao giữa DNA nguyên vẹn và DNA phân mảnh (Table 2). Ảnh hưởng của phân mảnh đã được đánh giá và xác minh hơn nữa bằng cách so sánh các mẫu nam và nữ như được ghi lại trong bảng 2. Những kết quả này chỉ ra rằng DNA bị cắt nhỏ có kích thước trung bình ít nhất 400 bp có thể được khuếch đại và sau đó được phân tích thông qua Agilent microarray để tạo ra kết quả tương đương với những kết quả thu được bằng cách sử dụng DNA bộ gen có trọng lượng phân tử cao nguyên vẹn.

Hình 3. Hình ảnh gel, khóa học thời gian phát sóng âm. Kích thước mảnh DNA được xác định thông qua điện di gel trước khi khuếch đại với GenomePlex WGA. Cả DNA bộ gen nữ và DNA bộ gen HT29 đều mang lại một dải phân tử trọng lượng cao nguyên vẹn (> 12.000 bp), trong khi DNA được phát sóng liên tục trong 5-120 giây cho nhiều dải DNA nhỏ hơn với các kích thước khác nhau. Các mẫu phát sóng âm 90 giây (~ 400 bp) được sử dụng trong phân tích aCGH tiếp theo. Làn 1 & 7: Dấu hiệu trọng lượng phân tử; Làn 2: DNA Nữ nguyên vẹn (>12.000 bp); Làn 3: DNA nữ được phát sóng âm 5 giây (~1.500 bp); Làn 4: DNA nữ được phát sóng âm 30 giây (~600 bp); Làn 5: DNA nữ được phát sóng âm 90 giây (~400 bp); Làn 6: DNA nữ được phát sóng âm 120 giây (~300 bp); Làn 8: Nguyên vẹn HT29 ADN (>12.000 bp), Làn 9: HT29 DNA được phát sóng âm 90 giây (~ 400 bp).

Hình 4. Các chữ tượng hình phân tích CGH minh họa dữ liệu từ Agilent Human Genome CGH 44B microarray. Sản phẩm WGA được tạo ra từ HT29 DNA (A) và phân mảnh HT29 DNA (B) cho thấy sự xóa giống hệt nhau được biết đến trên 8p cánh tay (dịch ngang sang trái của dòng không), khuếch đại dọc theo 8q cánh tay trong vùng 8q23.3-24,23 (dịch chuyển ngang sang phải của dòng không), và xóa tiêu điểm bằng 8q23.1 (dịch chuyển ngang sang trái của đường không, được phác thảo bằng ô chấm màu xanh dương). Các dạng xem gen phóng to tương ứng cho dữ liệu từ cả DNA nguyên vẹn (C) và DNA phân mảnh (D) tập trung vào Chr8 q22,2-23,1; rõ ràng cho thấy xóa ~1,5 MB (được đánh dấu là đường dày) liên quan đến protein kẽm ngón tay ZFPM2 và chất ức chế khối u LRP12 đã được báo cáo trước đó trong các phân tích dựa trên mảng BAC. A: Chế độ xem nhiễm sắc thể 8 trong HT29/Nữ với WGA nguyên vẹn HT29 DNA (đầu vào 50 ng); B: Chế độ xem nhiễm sắc thể 8 trong HT29/Nữ với WGA của HT29 DNA bị phân mảnh (đầu vào 50 ng); C: Dạng xem gen phóng to của bảng A (cửa sổ thu phóng 12 MB); D: Dạng xem gen phóng to của bảng B (cửa sổ thu phóng 12 MB).

¹Chỉ áp dụng cho so sánh nam và nữ. KHÔNG áp dụng.
^*Xem chú thích Bảng 1 để được giải thích thêm.

Kết luận

Sản phẩm WGA có thể dễ dàng được áp dụng cho nền tảng mảng CGH hai màu của Agilent để tạo ra dữ liệu chất lượng cao. Phương pháp khuếch đại này cho phép số lượng nhỏ hơn (số lượng nano) của vật liệu ban đầu. Hơn nữa, GenomePlex WGA đại diện cho cơ hội khuếch đại và phân tích các mẫu đã bị phân mảnh nghiêm trọng. WGA DNA có thể được kết hợp trực tiếp vào quy trình oligo-aCGH mà không có bất kỳ sai lệch nào so với giao thức được khuyến nghị của Agilent. Vật liệu khuếch đại tạo ra các karyotype nhiễm sắc thể chất lượng cao phù hợp với kết quả từ các mẫu DNA gen không khuếch đại. Các thí nghiệm trong tương lai sẽ tập trung vào việc tạo ra các cấu hình bộ gen chất lượng cao từ các mẫu mô, bao gồm các mẫu FFPE.

¹ cho chỉ so sánh nam và nữ. Không có trong Số liệu QC phần mềm CGH Analytics 3,4.

Tài liệu tham khảo

1. Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, Sampas N, Lipson D, Kincaid R, Tsang P, Curry B, Baird K, Meltzer PS, et al. 2004. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(51):17765-17770. https://doi.org/10.1073/pnas.0407979101

2. Johnson NA, Hamoudi RA, Ichimura K, Liu L, Pearson DM, Collins VP, Du M. 2006. Application of array CGH on archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues including small numbers of microdissected cells. Lab Invest. 86(9):968-978. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700441

3. Little SE, Vuononvirta R, Reis-Filho JS, Natrajan R, Iravani M, Fenwick K, Mackay A, Ashworth A, Pritchard-Jones K, Jones C. 2006. Array CGH using whole genome amplification of fresh-frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tumor DNA. Genomics. 87(2):298-306. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2005.09.019

4. O'Geen H, Nicolet CM, Blahnik K, Green R, Farnham PJ. 2006. Comparison of sample preparation methods for ChIP-chip assays. BioTechniques. 41(5):577-580. https://doi.org/10.2144/000112268

GenElute is a a trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany and/or its affiliates. Tất cả thương hiệu khác là tài sản của các chủ sở hữu tương ứng. Thông tin chi tiết về thương hiệu có trên các nguồn có thể truy cập công khai.