Tối ưu hóa và xác thực xét nghiệm PCR

A Technical Guide to PCR Technologies (bằng tiếng Anh)

Trên trang này

• Tối ưu hóa điều kiện PCR
  
• Đang xác thực thiết kế Primer
• Tối ưu hóa nồng độ đầu dò
• Tối ưu hóa các thành phần phản ứng và xét nghiệm Multiplex
• Tối ưu hóa hơn Mg2 nồng độ
• Chọn chụp huỳnh quang và bộ giảm chấn
• Hướng dẫn tối ưu hóa PCR phiên âm ngược định lượng (RT-qPCR)
• Assay Evaluation

Tối ưu hóa điều kiện PCR

Tối ưu hóa và xác thực xét nghiệm là rất cần thiết, ngay cả khi sử dụng các xét nghiệm đã được thiết kế trước và thu được về mặt thương mại. Tối ưu hóa được yêu cầu để đảm bảo rằng xét nghiệm nhạy cảm như được yêu cầu và nó cụ thể cho mục tiêu quan tâm. Ví dụ, phát hiện mầm bệnh hoặc phân tích biểu hiện của các mRNA hiếm gặp đòi hỏi độ nhạy cao; phát hiện SNP đòi hỏi độ đặc hiệu cao và định lượng virus cần cả độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Các xét nghiệm đòi hỏi độ đặc hiệu cao đặc biệt dễ bị tổn thương khi được thực hiện mà không tối ưu hóa và kiểm soát đầy đủ. Tương tự, khi nhiều mục tiêu được phát hiện đồng thời trong các phản ứng đa nhân, điều kiện xét nghiệm phải được tối ưu hóa để phát hiện tất cả các mục tiêu bằng nhau. Xác thực cung cấp dữ liệu cần thiết để biện minh cho việc sử dụng liên tục xét nghiệm trong các dự án nghiên cứu tiếp theo¹.

Có một số yếu tố có thể được thay đổi để đạt được hiệu suất xét nghiệm tối ưu và do đó dẫn đến độ nhạy phân tử cao hơn, độ đặc hiệu và độ chính xác cao hơn. Các cuộc thử nghiệm mua từ các nhà cung cấp thương mại lành nghề vẫn yêu cầu xác thực trong phòng thí nghiệm mà chúng đang được sử dụng. Các khiếu nại liên quan đến hoạt động của xét nghiệm phải được xác minh trong điều kiện của nghiên cứu, bao gồm các mẫu xét nghiệm, thuốc thử cụ thể và dụng cụ được lựa chọn.

Một xét nghiệm đã được thiết kế sao cho tất cả các tiêu chí thiết kế mong muốn đã được đáp ứng (PCR / qPCR / dPCR assay Design) có khả năng thực hiện tốt trong một loạt các điều kiện. Tuy nhiên, tất cả các xét nghiệm đều có một tập hợp các điều kiện tối ưu và chúng phụ thuộc vào thiết bị, các thuốc thử được chọn (điều kiện đệm), nồng độ mồi và / hoặc nhiệt độ ủ (_Ta), nồng độ magiê và thậm chí tốc độ dốc. Vì thông thường, xét nghiệm trên một dụng cụ được chọn và trong các điều kiện đệm tiêu chuẩn, hầu hết các quy trình tối ưu hóa tập trung vào sửa đổi động học liên kết mồi bằng cách sử dụng nồng độ mồi hoặc nhiệt độ ủ (_Ta) / nhiệt độ nóng chảy ( TM ).

Bất kể mục tiêu là DNA (qPCR) hoặc RNA (RT-qPCR), các bước sơ bộ sau đây sẽ giúp đảm bảo định lượng thành công:

• Đang xác thực thiết kế Primer
  
• Tối ưu hóa nồng độ Primer
  
• Tối ưu hóa nhiệt độ annealing của Primer
• Tối ưu hóa nồng độ đầu dò
  
• Tối ưu hóa các thành phần phản ứng và Điều kiện đa bộ phận
  
• Xác thực hiệu suất với Đường cong tiêu chuẩn và Phân tích đường cong tan chảy

Đang xác thực thiết kế Primer

Xác nhận thiết kế mồi là đặc biệt quan trọng khi áp dụng mồi từ ấn phẩm trước đó hoặc sử dụng xét nghiệm được cung cấp thương mại. Có thể xem lại thiết kế mồi liên quan đến hướng dẫn thiết kế xét nghiệm được cung cấp trong Thiết kế xét nghiệm PCR/qPCR/dPCR. Điều quan trọng là phải đảm bảo rằng:

• Mồi tương đồng với chuỗi đích mong muốn.
  
• Bộ mồi bổ sung ngược là chính xác. Cẩn thận kiểm tra các đơn đặt hàng cơ sở bổ sung ngược (usin ghttp://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).
  
• Phát hiện các biến thể mối nối thích hợp.
  
• SNP đã được tránh trừ khi cần thiết cho xét nghiệm.
  
• Các oligos và amplicon không áp dụng cấu trúc thứ cấp.
  
• Có tiềm năng thấp cho các oligos của phản ứng lai với nhau.

Primer dimer

Khả năng của mồi để lai với nhau, đặc biệt là ở đầu 3, có thể dẫn đến sự mở rộng mồi trong PCR và sự hình thành các sản phẩm độc lập mục tiêu, được gọi là dimer. Bất cứ khi nào các sản phẩm dimer mồi được sản xuất và khuếch đại, chúng chuyển hướng các thành phần phản ứng ra khỏi sự tổng hợp của sản phẩm mong muốn, do đó làm giảm hiệu quả và độ nhạy của xét nghiệm. Do đó, các bộ điều chỉnh độ sáng mồi là một vấn đề trong các phản ứng sử dụng cả phát hiện dựa trên đầu dò và SYBR Green I dựa trên chất nhuộm. Với việc phát hiện dựa trên thuốc nhuộm như SYBR Green I, các bộ điều chỉnh mồi cũng ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của xét nghiệm vì thuốc nhuộm liên kết DNA không đặc hiệu sẽ liên kết với mồi và được phát hiện cùng với sản phẩm mong muốn. Do đó, cần tránh các mồi có khả năng tạo thành các dimer mồi.

Primer dimer prediction

Để xác định tiềm năng hình thành dimer mồi, hãy sử dụng phần mềm thiết kế mồi để phân tích sự hình thành song công. OligoArchitec cung cấp các chi tiết về sức mạnh của quá trình lai tạo dimer và dimer chéo (Hình 9,1). Bất kỳ 3 bộ điều chỉnh độ sáng đầu cuối nào được hình thành bằng cách lai mồi với chính nó hoặc với đối tác của nó, phải rất yếu (ΔG ≥ –2,0 kcal, Hình 9,1).

Làm thế nào để giảm độ sâu xuống?

Cần tránh bất kỳ mồi nào có cả đầu cuối ΔG < –2,0 kcal và đầu 3 có thể mở rộng (5 chồng chéo). Dimer tổng thể mạnh nhất nên không ổn định (ΔG ≥ –6,0 kcal). Để tránh các bộ làm mờ 3 đầu cực mạnh trong khi duy trì tính đặc hiệu, hãy chọn bộ tản nhiệt có dư lượng 2 G hoặc C trong 5 cơ sở cuối cùng, 1 G hoặc C trong 3 cơ sở cuối cùng và A hoặc T ở đầu 3 (Hình 9,1).

Hình 9,1. Phân tích mồi cho tiềm năng dimer mồi. Các trình tự mồi được phân tích bằng phần mềm thiết kế OligoArchitect để xác định khả năng của chúng để tạo ra các bản in hai mặt. Khả năng tự giảm độ sâu và độ sâu chéo được hiển thị cho lựa chọn mồi tốt nhất. Đa diện qPCR sẽ cho kết quả tốt nhất nếu tất cả các mồi trong phản ứng có nhiệt độ nóng chảy tương tự (chênh lệch TM ≤ 2 °C) và không tạo thành 3 song công mạnh (ΔG ≥ –2,0 kcal).

Tối ưu hóa nồng độ Primer và Nhiệt độ Annealing (_Ta)

Khi tối ưu hóa điều kiện xét nghiệm sử dụng nồng độ mồi, _{Ta cố định} (thường là 60 °C) được chọn và các điều kiện tối ưu cho mỗi mồi được giải quyết độc lập. Điều này rất quan trọng khi thiết kế một xét nghiệm để chạy trong multiplex, vì tất cả các phản ứng phải chạy ở cùng nhiệt độ ủ, và là một chiến thuật cũng có thể được sử dụng để giải cứu các xét nghiệm thực hiện kém mà một thiết kế thay thế không có sẵn. Một cách tiếp cận đơn giản hơn về mặt kỹ thuật là chọn một nồng độ mồi cố định và sau đó tối ưu hóa _Ta chọn kết quả tốt nhất cho các mồi kết hợp. Đây là cách tiếp cận ưu tiên khi sử dụng một số xét nghiệm và phát hiện thuốc nhuộm liên kết dsDNA, chẳng hạn như SYBR^® Green I. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu một dụng cụ có thể đồng thời chạy các chương trình phản ứng bằng cách sử dụng  các tùy chọn TA khác nhau.

Tối ưu hóa nồng độ Primer

Khi sử dụng qPCR dựa trên đầu dò, kết quả thỏa đáng thường thu được bằng cách sử dụng nồng độ cuối cùng của cả mồi ở 500 nM và đầu dò ở 250 nM, đặc biệt nếu mục tiêu PCR phong phú và độ nhạy tối đa không cần thiết. Nồng độ mồi thấp hơn một chút, từ 200 nM đến 400 nM, thường tốt hơn khi sử dụng phát hiện dựa trên thuốc nhuộm SYBR Green I để giảm thiểu khuếch đại không đặc hiệu và khi tối ưu hóa các phản ứng đa bội. Để xác minh rằng các điều kiện tiêu chuẩn phù hợp để sử dụng, hãy tiến hành phân tích đường cong tiêu chuẩn (xem Đánh giá xét nghiệm). Nếu việc phát hiện là tuyến tính, có thể tái tạo và gradient nằm trong khoảng từ –3,2 đến –3,5 trong phạm vi nồng độ mục tiêu dự kiến trong mẫu, có thể không cần thiết phải tối ưu hóa nồng độ mồi và thăm dò thêm nữa.

Một số dấu hiệu cho thấy xét nghiệm không được tối ưu hóa tốt; nó thiếu khả năng tái tạo giữa các bản sao và nói chung là không hiệu quả và không nhạy cảm. Hiệu suất xét nghiệm thường được kiểm tra ở một loạt các nồng độ mồi, ví dụ, từ 50–800 nM, sử dụng mỗi mồi ở mỗi nồng độ (Hình 9,2; để biết toàn bộ giao thức, xem Phụ lục A, Giao thức; Tối ưu hóa Primer).

Hình 9,2. Ví dụ tối ưu hóa mồi. Cách bố trí dải 8 ống (trên và bên trái) và tấm PCR để pha loãng và phân phối mồi.

Sự kết hợp của nồng độ mang lại _{CQ thấp nhất,} biến đổi thấp nhất trong các bản sao và NTC âm được chọn (Hình 9,3)².

Hình 9,3. Kết quả từ việc tối ưu hóa nồng độ mồi PCR từ xét nghiệm nhuộm màu xanh lá cây SYBR. A) các hướng dẫn được thiết lập khuyến nghị rằng một loạt các nồng độ mồi tiến (F) và ngược (R) được thử nghiệm. Trong ví dụ này, 50 nM đến 600 nM đã được thử nghiệm kết hợp để xác định nồng độ tối ưu cho xét nghiệm. Trong thí nghiệm này, có một sự khác biệt rất lớn trong CQ do nồng độ mồi khác nhau, minh họa cách điều này có thể tác động đến dữ liệu cuối cùng (dữ liệu từ Jens Stolte, EMBL). B) Thí nghiệm này cho thấy tối ưu hóa một xét nghiệm và biến thiên được thiết kế tốt do nồng độ mồi. Sự kết hợp mồi tiến và lùi 400 nM đã được chọn là tối ưu vì sự kết hợp này đại diện cho nồng độ mồi thấp nhất có thể tái tạo các giá trị CQ sớm nhất trong khi vẫn giữ được đường cong sigmoidal.

Nếu một mục tiêu trong phản ứng đa nhân phong phú hơn đáng kể so với các mục tiêu khác hoặc nếu một cặp mồi tạo ra một _{CQ thấp hơn nhiều} so với các mục tiêu khác, khuếch đại của mục tiêu đó có thể chiếm ưu thế trong phản ứng, sử dụng các thành phần phản ứng trước khi các mục tiêu khác được phát hiện. Điều chỉnh nồng độ mồi có thể cho phép khuếch đại cân bằng hơn tất cả các mục tiêu. Để xác định xem các điều chỉnh đó có lợi hay không, hãy chuẩn bị các đường cong tiêu chuẩn (xem Đánh giá xét nghiệm) bao gồm phạm vi các mục tiêu được dự kiến chỉ cho mỗi cặp mồi (đơn) và với tất cả các mồi kết hợp (multiplex). Nếu các phản ứng multiplex và singleplex cho kết quả tương tự, nồng độ mồi là phù hợp. Mặt khác, việc tối ưu hóa nồng độ mồi có thể cải thiện kết quả nếu độ nhạy không thể chấp nhận được trong các phản ứng đa chiều. Giảm nồng độ mồi cho các cặp mồi dẫn đến  giá trị CQ thấp và/hoặc tăng nồng độ cho những cặp mang lại  giá trị CQ cao, trong phạm vi 50–500 nM.

Tối ưu hóa nhiệt độ annealing của Primer

Các xét nghiệm PCR định lượng thường được thực hiện bằng cách sử dụng các chương trình chu kỳ nhiệt độ hai hoặc ba bước, thường là với 35-40 chu kỳ. Phản ứng hai bước chu kỳ giữa hai nhiệt độ, thường là 95 °C (thường là 10–15 giây) và 60 °C (thường là 30–60 giây hoặc 5–10 giây trong điều kiện nhanh). Các phản ứng nhiệt độ hai bước được chọn khi chạy thử nghiệm Probe kép (TaqMan hoặc thủy phân) vì độ kéo dài nhiệt độ thấp hơn thúc đẩy hoạt động exonuclease của DNA polymerase và không khuyến khích sự dịch chuyển của đầu dò. Đây sẽ là giao thức điều kiện đạp xe ưa thích để thực hiện nhiều xét nghiệm khác nhau dưới cùng các thông số. Tuy nhiên, nhược điểm của việc sử dụng phương pháp hai bước là nó làm giảm các tùy chọn tiềm năng cho thiết kế mồi và giới hạn tối ưu hóa xét nghiệm chỉ để mồi tập trung vì khôngthể tối ưu hóa nhiệt độ ủ ( Ta ).

Một giao thức đạp xe ba bước được ưu tiên hơn khi các chuỗi đích phức tạp và các mồi được chọn khó tối ưu hóa hoặc hệ thống phát hiện được sử dụng không phụ thuộc vào việc sử dụng đầu dò thủy phân. Chiến lược ba bước xoay vòng giữa: 95 °C (thường là trong 10 giây), nhiệt độ ủ (từ 55 °C đến 65 °C, thường là trong 10–20 giây hoặc 5 giây trong điều kiện nhanh) và 72 °C (thường trong 20–30 giây hoặc 15–20 giây trong điều kiện nhanh). Trong trường hợp này, _Ta có thể được tối ưu hóa để cải thiện hơn nữa hiệu suất xét nghiệm bằng giao thức sau:

• Bắt đầu từ đầu thấp của  dãy Ta được thử nghiệm, được xác định bởi _Ta của mồi, và tăng nhiệt độ theo từng bước theo bước tăng dần (thường thử nghiệm trong khoảng từ 55 °C đến 65 °C). Một số dụng cụ có các khối gradient tạo điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ trong một lần chạy.
  
• Kiểm tra từng sản phẩm phản ứng để biết độ đặc hiệu, bằng cách phân tích đường cong tan chảy sau PCR hoặc điện di gel agarose, như mô tả dưới đây.
  
• Nhiệt độ ủ tối ưu là kết quả trong _{CQ thấp nhất}, NTC âm, phân tích đường cong nóng chảy tiết lộ sự phát hiện của một sản phẩm cụ thể và khả năng tái tạo cao giữa các phản ứng sao chép.

Nếu nhiệt độ ủ quá thấp, phản ứng sẽ không đặc hiệu. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, độ nghiêm ngặt có thể ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, dẫn đến thiếu khuếch đại hoặc  giá trị CQ rất cao, năng suất rất kém và khả năng tái tạo thấp.

Một ví dụ về tối ưu hóa nhiệt độ được hiển thị trong Hình 9,4. Trong trường hợp này (Hình 9,4A), các phản ứng giống hệt nhau đã được thực hiện trên khối PCR gradient sao cho nhiệt độ ủ là từ 47,8 °C đến 71,7 °C. Ủ ở 64,8 °C và 61,7 °C dẫn đến  các giá trị CQ giống hệt nhau nhưng nhiệt độ thấp hơn một chút tạo ra sản phẩm cao hơn, bằng chứng là sự huỳnh quang điểm cuối cao hơn và phản ứng với hiệu quả rõ ràng cao hơn (được biểu thị bằng gradient của biểu đồ khuếch đại). Việc xác định hiệu suất tuyệt đối đòi hỏi phải có đánh giá đường cong tiêu chuẩn (xem Đánh giá xét nghiệm) hoặc sử dụng thuật toán xác định hiệu suất ống đơn^3,4. Phần thứ hai của hình số (Hình 9,4B) cho thấy sự so sánh giữa hành vi của mồi trong điều kiện phản ứng giống hệt nhau nhưng trong các hỗn hợp thuốc thử khác nhau. Ở đây, rõ ràng là thành phần bộ đệm ảnh hưởng đến khả năng tái tạo của xét nghiệm và phạm vi nhiệt độ mà dữ liệu ổn định đạt được. Cuối cùng, hai xét nghiệm độc lập được thiết kế cho cùng một gen đích và chúng được tối ưu hóa trong mỗi bộ đệm. Như được hiển thị Hình 9,4C, mỗi bộ đệm yêu cầu một nhiệt độ tối ưu khác nhau để mang lại  dữ liệu CQ tương đương từ hai cặp mồi (61,7 °C ở LuminoCt và 58,4 °C ở KiCqStart).

Hình 9,4. Tối ưu hóa mồi bằng Ta. A) Một loạt nhiệt độ ủ đã được thử nghiệm cho các phản ứng giống hệt nhau. Ủ ở 64,8 °C và 61,7 °C dẫn đến các giá trị CQ giống hệt nhau và khả năng tái tạo cao giữa các bản sao, nhưng nhiệt độ thấp hơn một chút tạo ra sản phẩm cao hơn. B) Hai phản ứng giống hệt nhau đã được thiết lập trong các hỗn hợp thuốc thử khác nhau (LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™hoặc KiCqStart® Green qPCR® Green qPCR ReadyMix™) và chạy gradient nhiệt độ nguyên thủy. Nhiệt độ tối ưu khác nhau trong mỗi hỗn hợp và có ít sự thay đổi giữa dữ liệu khi các phản ứng được chạy trong thuốc thử KiCqStart. C) Hai cặp mồi với cùng một mục tiêu (KS và được thiết kế sử dụng Beacon Designer, BD) được chạy trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau. Có thể thấy rằng nhiệt độ ủ tối ưu khác nhau trong các thuốc thử khác nhau (61,7 °C trong LuminoCt và 58,4 °C trong KiCqStart) để tạo ra kết quả tương tự từ mồi.

Mặc dù hầu hết các xét nghiệm thương mại được cung cấp với các điều kiện xét nghiệm PCR tiêu chuẩn, các xét nghiệm riêng lẻ có thể được hưởng lợi từ tối ưu hóa hơn để xác định các điều kiện cụ thể cho tổ hợp mồi cụ thể. Điều này có thể là do các bộ điều chỉnh độ sáng mồi, khuếch đại không đặc hiệu hoặc hiệu suất phản ứng dưới tối ưu theo các điều kiện mặc định được chọn. Sau khi hoàn thành tối ưu hóa, hiệu quả xét nghiệm nên được tính bằng cách áp dụng các điều kiện đã chọn cho phép đo chuỗi tiêu chuẩn và chuẩn bị một đường cong tiêu chuẩn (Đánh giá xét nghiệm). Có thể, ngay cả sau khi tối ưu hóa, hiệu quả vẫn có thể là dưới mức tối ưu và trong trường hợp xấu nhất, một xét nghiệm mới có thể được yêu cầu.

Phạm vi các giá trị hiệu suất có thể chấp nhận được nên được xác định bởi người dùng trước khi bắt đầu quá trình tối ưu hóa. Lý tưởng nhất là hiệu suất phải >95%. Tuy nhiên, có thể thực hiện các phép đo chính xác với các xét nghiệm có hiệu suất <90% và, như với thiết kế mồi, chuỗi mục tiêu có thể quy định rằng mục tiêu không thể được khuếch đại với hiệu suất cao hơn. Tuy nhiên, khi sử dụng xét nghiệm có hiệu suất thấp hơn, có khả năng độ chính xác và giới hạn phát hiện sẽ bị ảnh hưởng. Trong những trường hợp này, cần phải sử dụng quyết định thích hợp khi diễn giải và báo cáo dữ liệu¹.

Tối ưu hóa nồng độ đầu dò

Nồng độ cuối cùng của que đo 250 nM có thể được sử dụng cho hầu hết các xét nghiệm. Tuy nhiên, nếu không cần độ nhạy tối đa, nồng độ thấp hơn của đầu dò có thể đủ, do đó làm giảm chi phí xét nghiệm. Để tối ưu hóa các điều kiện đầu dò, thử nghiệm nó ở một số nồng độ, từ 50 đến 500 nM cuối cùng, kết hợp với nồng độ mồi tối ưu và nồng độ axit nucleic mục tiêu thấp nhất dự kiến sẽ được đưa vào các thí nghiệm cuối cùng.  Có thể sử dụng nồng độ đầu dò thấp nhất cho phép phát hiện nhạy nhất ( CQ ≤ 30 với khả năng tái tạo tốt nhất).

Tối ưu hóa các thành phần phản ứng và xét nghiệm Multiplex

Có một số xét nghiệm đặc biệt nhạy cảm với điều kiện đệm/phản ứng. Đối với các thử nghiệm này sửa đổi thêm bộ đệm phản ứng bằng cách tối ưu hóa MgCl 2concentration, bổ sung các bộ tăng cường PCR (Mueller trong PCR Technologies; đổi mới hiện tại, 2013⁵) hoặc điều chỉnh tốc độ biến đổi dụng cụ có thể dẫn đến hiệu suất được cải thiện. Ngoài các hướng dẫn tối ưu hóa xét nghiệm được cung cấp trong các phần trước, những yếu tố này đặc biệt quan trọng khi tối ưu hóa phản ứng đa nhân.

Tối ưu hóa nồng độ mg 2+

Magiê đóng một số vai trò trong PCR. Nó là một phản ion cation hóa trị hai cần thiết cho dNTPs và một đồng yếu tố cho tất cả các polymerase. Các cation hóa trị hai ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình lai chuỗi DNA kép. Tăng nồng độ magiê làm tăng sự ổn định, hoặc nhiệt độ nóng chảy, của song công DNA. Theo đó, mức magiê cao làm tăng ái lực của mồi đối với lai, bao gồm các sự kiện mồi sai và tương tác mồi. Các song công DNA răng sai trở thành chất nền cho DNA polymerase, trong thực tế tạo ra các sản phẩm phụ và làm giảm hiệu quả PCR. Do đó, nồng độ MgCl 2has tác động đến cả tính đặc hiệu và năng suất của PCR vì magiê ảnh hưởng đến sự lai tạo của mồi với mục tiêu, sự rước của Taq DNA polymerase, cũng như tốc độ thủy phân bởi nửa exonuclease khi được sử dụng để phân tách đầu dò trong qPCR. Do đó, MgCl 2results không đủ trong sản lượng kém do tốc độ trùng hợp thấp của DNA polymerase, liên kết mồi bị tổn hại và phân cắt đầu dò không hiệu quả. Nếu nồng độ MgCl 2is quá cao, độ đặc hiệu của phản ứng sẽ bị ảnh hưởng bởi vì điều này sẽ dẫn đến sự ổn định lớn hơn của quá trình lai ghép mồi không đặc hiệu.

Trái ngược với các xét nghiệm PCR thông thường sử dụng MgCl 2concentrations tiêu chuẩn 1,5–2 mm, xét nghiệm qPCR của đầu dò thủy phân đòi hỏi nồng độ cao hơn khoảng 3–5 mm để đạt được sự phân cắt hiệu quả của đầu dò. Sự hiện diện của MgCl 2also làm tăng tốc độ lai ghép DNA, cho phép lai tạo hiệu quả trong các điều kiện chu kỳ nhanh được sử dụng bởi nhiều dụng cụ. Tối ưu hóa MgCl 2concentrations trở nên quan trọng hơn khi chạy các phản ứng đa chiều.

Các muối, chẳng hạn như KCl hoặc (NH₄)₂SO_4, cũng sẽ thay đổi DNA duplex _TM, nhưng tác dụng ít mạnh hơn đối với các cation đơn trị này.

Hình 9,5. Ảnh hưởng của nồng độ magiê.

Các hiệu ứng, được hiển thị trong Hình 9,5, được phóng đại khi thực hiện PCR đa năng. Chạy nhiều phản ứng đồng thời giới thiệu sự cạnh tranh cho thuốc thử và làm trầm trọng thêm bất kỳ điều kiện phụ tối ưu nào, tạo ra những thay đổi lớn trong hiệu quả PCR.

Tốc độ biến đổi

Có những trường hợp hiếm hoi khi một phản ứng khó khăn đòi hỏi phải sửa đổi thêm. Khi tất cả các tùy chọn khác đã hết, có thể khôi phục tình huống bị mất bằng cách kiểm tra thực nghiệm và sửa đổi tốc độ biến đổi PCR.

Chọn chụp huỳnh quang và bộ giảm chấn

Khi chạy các xét nghiệm đa nhân, điều quan trọng là tối đa hóa sự phân tách quang phổ của nhiều phát xạ từ các fluorophore khác nhau để tạo điều kiện cách ly tín hiệu và phân tích dữ liệu. Do đó, các tế bào fluorophore với băng thông hẹp, được phân tách rộng rãi là hữu ích cho các ứng dụng đa chức năng. Tuy nhiên, trong thực tế, việc lựa chọn fluorophore bị hạn chế bởi hệ thống quang học của thiết bị. PCR định lượng và Phương pháp phát hiện PCR kỹ thuật số chứa thêm thông tin liên quan đến việc lựa chọn fluorophore và quencher.

Hướng dẫn tối ưu hóa PCR phiên âm ngược định lượng (RT-qPCR)

Khi thực hiện RT-qPCR, điều quan trọng không chỉ là xem xét các hướng dẫn cho qPCR tiêu chuẩn như đã thảo luận trước đây và tối ưu hóa RT như đã thảo luận trong Phiên âm ngược, mà còn để giải quyết các điểm sau đây dành riêng cho bước RT:

• Xác minh chất lượng RNA (Tinh chế mẫu và Đánh giá chất lượng).
  
• Xác nhận rằng mồi trải dài hoặc sườn xâm nhập dài (Thiết kế xét nghiệm PCR/qPCR/dPCR).
  
• Tối ưu hóa phiên âm ngược (Phiên âm ngược).
  
• Xác minh Dữ liệu Điều khiển Phiên mã Không-Đảo ngược (Không-RT).

Xác nhận rằng mồi kéo dài hoặc nối hai bên đầu vào dài

Trong khi hầu hết gDNA được loại bỏ khỏi mẫu trong quá trình tinh chế RNA, không có thủ tục nào loại bỏ tất cả DNA. Vì PCR có khả năng khuếch đại một phân tử DNA duy nhất, DNA bị ô nhiễm được khuếch đại cũng như RNA khi sử dụng RT-qPCR. Nếu mRNA đích là khá phong phú (hàng trăm hoặc hàng ngàn bản sao trên mỗi tế bào), tín hiệu thu được từ khuếch đại nhiễm DNA sẽ không đáng kể so với các sản phẩm từ RNA; tuy nhiên, nếu mRNA đích có số lượng vừa phải hoặc hiếm (<100 bản sao / tế bào), tín hiệu phát sinh từ khuếch đại DNA có thể dẫn đến ước tính sai lầm cao về mức mRNA. Để tránh khuếch đại DNA trong suốt thời gian RT-qPCR, nếu có thể, hãy sử dụng các mồi ở hai bên một intron không có trong trình tự mRNA hoặc trải qua một mối nối exon-exon (PCR / qPCR / dPCR / dPCR).

Nếu gen quan tâm không chứa intron, nếu vị trí intron không xác định, hoặc nếu không có mồi phù hợp mở rộng hoặc bên sườn, có thể cần phải tiêu hóa RNA đầu vào bằng DNase không có RNase hoặc mức khuếch đại DNase I. Có thể sử dụng dữ liệu từ các điều khiển không RT để xác định xem có cần tiêu hóa thêm với DNase I hay không.

Xác minh Dữ liệu Điều khiển Bản sao chép Không đảo ngược (Không-RT)

Bất kể primers là span hay sườn intron, độ đặc hiệu của các xét nghiệm RT-qPCR nên được kiểm tra trong các phản ứng kiểm soát không chứa enzyme phiên mã ngược (kiểm soát không RT) để đánh giá khuếch đại tiềm năng từ DNA bị ô nhiễm. Như được mô tả trong PCR/qPCR/dPCR xét nghiệm Design, các chuỗi DNA với các intron ngắn (≤1 kb) có thể được khuếch đại thành công trong RT-PCR. Nhiều gen có các bản sao bổ sung, hoặc các gen giả, mà thiếu một hoặc nhiều intron. Kết quả là, sự đóng góp DNA vào dữ liệu thu được từ các xét nghiệm RT-PCR nên được kiểm tra bằng cách thực hiện một phản ứng chứa các mẫu RNA nhưng không có enzyme RT, cùng với các phản ứng chứa cả enzyme RNA và RT (hình 9,6). Khuếch đại DNA được coi là chấp nhận được trong qPCR nếu  các giá trị CQ cho các phản ứng không-RT ít nhất 5 chu kỳ lớn hơn so với các chu kỳ cho các phản ứng với RT6. Tuy nhiên, nếu có ít hơn 5 chu kỳ giữa  các giá trị CQ cho các phản ứng có và không có RT, khuếch đại DNA có thể góp phần định lượng mRNA.

Hình 9,6. Đánh giá các hệ thống điều khiển không RT. Các sản phẩm RT-PCR được sản xuất với sự hiện diện (+) hoặc vắng mặt (-) của enzyme RT đã được phân đoạn trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide trong TBE. Mồi cho mục tiêu mRNA bên sườn một intron 1 kb. MRNA đích trong B liên kết với một số gen, ít nhất một trong số đó là gen giả thiếu intron giữa mồi được sử dụng cho RT-PCR và do đó, tạo ra một sản phẩm có cùng kích thước với và không có enzyme RT.

Khi sự ô nhiễm DNA của RNA đóng góp tín hiệu đáng kể cho thí nghiệm, RNA nên được tiêu hóa bằng DNase I không có RNase hoặc mức khuếch đại, trước RT-qPCR để cho phép định lượng mRNA đáng tin cậy. Lưu ý rằng tiêu hóa DNase trên cột (một thủ tục được cung cấp với nhiều bộ lọc RNA thương mại có sẵn trong đó quá trình tiêu hóa DNase được thực hiện trong khi RNA liên kết với cột silica) kém hiệu quả trong việc loại bỏ DNA so với tiêu hóa trong dung dịch sau khi đẩy RNA ra khỏi cột. Do đó, tiêu hóa DNase trên cột (OC) có thể không đủ cho RT-qPCR (Hình 9,7). Các kiểm soát không RT nên được thực hiện với RNA tiêu hóa DNase để xác minh rằng quá trình tiêu hóa đã thành công và đủ. Trong ví dụ được hiển thị trong Hình 9,7, tiêu hóa DNase của OC là đủ để phát hiện mRNA đích đáng tin cậy. Nó sẽ không đủ để định lượng đáng tin cậy một mRNA ít phong phú hơn nhiều nếu cần độ nhạy lớn hơn.

Lưu ý rằng các loại tế bào và mô khác nhau, cũng như điều kiện tăng trưởng khác nhau, tạo ra nồng độ mRNA cụ thể khác nhau đáng kể. Ngoài ra, các phương pháp tinh chế RNA khác nhau tạo ra một lượng DNA nhiễm bẩn khác nhau. Kết quả là, các phản ứng có và không có phiên mã ngược nên được thực hiện ít nhất một lần với mỗi vật liệu khởi đầu mới, phương pháp chuẩn bị RNA hoặc xét nghiệm.

Hình 9,7. So sánh tiêu hóa DNase trên cột (OC) với tiêu hóa DNase sau khi chuẩn bị. Tổng RNA được chuẩn bị từ 30 mg miếng gan chuột với bộ RNA GenElute™ của chúng tôi hoặc quy trình lọc cột từ một nhà cung cấp thay thế, cả hai đều theo hướng dẫn sinh hoạt của các nhà sản xuất. Hai mẫu RNA được chuẩn bị với sản phẩm DNase trực tiếp của nhà sản xuất tương ứng và hai mẫu được chuẩn bị mà không tiêu hóa DNase. Sau khi tinh chế, các phân lượng của bốn mẫu RNA được chuẩn bị mà không có DNase trên cột đã được tiêu hóa với khuếch đại DNase I của chúng tôi theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tỷ lệ tương đương của tất cả đã được sử dụng trong một bước RT-qPCR. Các biểu đồ huỳnh quang cho hai trong số các mẫu RNA được hiển thị. Kết quả tương tự thu được với cả hai nhà sản xuất sản phẩm và chỉ có quy trình yêu cầu xử lý DNAse sau thanh lọc đã loại bỏ tất cả gDNA.

Assay Evaluation

Sau khi xét nghiệm đã được tối ưu hóa để xác định các điều kiện nhạy cảm nhất, điều quan trọng là phải xác định độ đặc hiệu của xét nghiệm, hiệu quả và dải động kỹ thuật.

Xác định độ đặc hiệu bằng cách sử dụng Phân tích đường cong nóng chảy

Độ đặc hiệu có thể được xác định bằng cách sử dụng phân tích đường cong nóng chảy. Việc thực hiện đường cong nóng chảy đòi hỏi phải kết hợp thuốc nhuộm phóng viên như nhuộm màu xanh lá cây SYBR hoặc sử dụng đầu dò không thủy phân như Beacon phân tử hoặc Scorpions^® Probe (xem Phương pháp PCR định lượng và PCR kỹ thuật số). Sau khi amplicon được sản xuất trong qPCR, nó sẽ được ủ ở nhiệt độ tăng lên, thường là từ 55 °C đến 95 °C. Tuy nhiên, người dùng nên xác minh rằng điểm nóng chảy lý thuyết của bộ khuếch đại nằm trong phạm vi này vì điều này sẽ phụ thuộc vào kích thước và nội dung GC. _{TM thử nghiệm} sẽ thay đổi một chút giữa các lần chạy và thuốc thử khác nhau, chủ yếu là do sự thay đổi trong MgCl 2and nồng độ ion khác.

Sự thay đổi trong huỳnh quang được xác định và biểu thị theo tốc độ thay đổi huỳnh quang so với nhiệt độ. Vì SYBR Green I là một loại thuốc nhuộm không đặc hiệu liên kết với bất kỳ DNA sợi kép nào, điều quan trọng là phải xác minh rằng qPCR chỉ sản xuất sản phẩm mong muốn khi sử dụng hóa học phát hiện này. Tan chảy, hoặc phân ly, phân tích đường cong có thể được sử dụng để xác định số lượng và kích thước xấp xỉ của các sản phẩm. Một xét nghiệm với độ đặc hiệu cao sẽ dẫn đến một đỉnh nóng chảy duy nhất ở nhiệt độ cao trong các phản ứng chỉ chứa mục tiêu không có gì, hoặc rất ít, được phát hiện trong các điều khiển không có mẫu (Hình 9,8A). Nếu đường cong nóng chảy có nhiều hơn một đỉnh chính, như trong hình 9,8 Band 9,8C, danh tính của các sản phẩm có thể được điều tra thêm bằng cách giải quyết chúng trên một gel agarose nhuộm ethidium bromide. Như được thể hiện trong Hình 9,8 Dand 9,8E, phản ứng B và C chứa lượng quá nhiều chất mồi hoặc các sản phẩm không đặc hiệu khác. Giảm nồng độ mồi thường sẽ làm giảm lượng sản phẩm không đặc hiệu. Nếu các sản phẩm không đặc hiệu vẫn được phát hiện với số lượng đáng kể với mức mồi thấp, tốt nhất là thiết kế lại mồi.

Hình 9,8. Đánh giá các đường cong nóng chảy. Tan chảy, hoặc phân ly, các đường cong cho thấy đỉnh sắc nét của sản phẩm cụ thể ở> 80 °C với rất ít sản phẩm không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp hơn (A) hoặc một lượng đáng kể sản phẩm nóng chảy thấp hơn (B và C). D đến F cho thấy các sản phẩm PCR từ như thể hiện trên đường cong nóng chảy A đến C, được giải quyết tương ứng trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromua.

Một ví dụ về phân tích đường cong nóng chảy tiết lộ sự ô nhiễm gDNA và nTC mồi của RNA được thể hiện trong Hình 9,9. Trong Hình 9,9A, một sản phẩm cụ thể rõ ràng từ các phản ứng thử nghiệm và một sản phẩm nhỏ hơn, tan chảy ở nhiệt độ thấp hơn, có mặt trong NTC. Điều này là dấu hiệu cho thấy sự hình thành của các bộ điều chỉnh sơ cấp trong trường hợp không có khuôn mẫu. Điều này là phổ biến và chỉ là mối lo ngại khi các sản phẩm mồi này rõ ràng trong các mẫu thử nghiệm như được thể hiện trong Hình 9,8. Ví dụ trong hình 9,9 Bshows phát hiện gen gDNA chưa được xử lý trong một mẫu DNA sử dụng cùng một xét nghiệm (trong trường hợp này, mồi được đặt trong exon trải dài intron) cũng đã được sử dụng để phát hiện mRNA. Các sản phẩm được phân biệt bởi hồ sơ nóng chảy của chúng với sản phẩm gDNA nóng chảy ở nhiệt độ cao hơn vì điều này cũng chứa intron.

Hình 9,9. Ví dụ về phân tích đường cong nóng chảy A) các bộ điều khiển mồi không có điều khiển mẫu và B) khuếch đại qua intron của gDNA.

Độ đặc hiệu rất quan trọng khi thiết kế xét nghiệm cho kiểu gen. Đây thường là các xét nghiệm thăm dò và đòi hỏi sự phân biệt đối xử của một sự khác biệt cơ sở duy nhất như khi phân biệt giữa các đa hình nucleotide đơn (SNPs). Trong trường hợp này, điều quan trọng là phải kiểm tra từng đầu dò trong một phản ứng duy nhất chống lại một khuôn mẫu được biết là có chứa chuỗi khớp cụ thể và chống lại chuỗi không khớp.

Xác định hiệu suất và giới hạn phát hiện

Phương tiện hiệu quả nhất để đo hiệu suất xét nghiệm là thông qua việc xây dựng đường cong tiêu chuẩn từ pha loãng mẫu nối tiếp. Hiệu quả xét nghiệm có thể được đo bằng hệ số của gradient đường cong tiêu chuẩn. Một loạt các nồng độ mẫu được thực hiện, đảm bảo rằng chúng đạt đến sự pha loãng giới hạn, do đó cho phép xác định phạm vi động của xét nghiệm kỹ thuật từ cùng một thí nghiệm.

Bất kỳ tài liệu mẫu phù hợp nào đều thích hợp cho các quyết định kỹ thuật về hiệu suất xét nghiệm này. Việc lựa chọn một tài liệu tham khảo tiêu chuẩn, có thể chuyển nhượng cho phép xác nhận nội phòng thí nghiệm. Do đó, giai đoạn xác nhận này có thể được thực hiện trên plasmid tuyến tính hoặc có nhãn hiệu (DNA siêu xoắn không khuếch đại hiệu quả và dẫn đến khả năng tái tạo thấp), mảnh nhân bản hoặc oligo tổng hợp. Tuy nhiên, phải nhận ra rằng việc xác nhận các mục tiêu này là thước đo của chức năng xét nghiệm và không phù hợp với sự biến đổi được đưa ra bởi sự phức tạp của một mẫu sinh học.

Việc xác định dải động kỹ thuật và hiệu quả của một xét nghiệm từ đường cong tiêu chuẩn được minh họa trong Hình 9,10. Trong ví dụ này, mẫu đã được pha loãng thông qua một chuỗi 11 bản ghi 10 lần và vì vậy giới hạn phát hiện lý thuyết được chứng minh là 3 bản ( _{CQ thấp nhất}), mặc dù độ chính xác của phép đo này được xác định rõ ràng bởi khả năng tái tạo, tương đối thấp ở các chu kỳ cao như vậy.

Hình 9,10. Một ví dụ về khả năng tái tạo cao và phạm vi phát hiện rộng bằng cách pha loãng nối tiếp plasmid tuyến tính. Tám bản tái tạo được thực hiện cho mỗi pha loãng và khuếch đại của mục tiêu được phát hiện bằng thuốc nhuộm màu xanh lá SYBR. Định lượng có thể trong khoảng từ 3×1010 đến 3 bản sao.

Hiệu quả xét nghiệm được xác định bằng cách đo độ dốc của đường cong tiêu chuẩn là biểu đồ của nhật ký nồng độ mục tiêu so với _CQ (Hình 9,10). Một xét nghiệm với hiệu suất 100% sẽ chứng minh tăng gấp đôi ở mỗi chu kỳ (E = 2) và độ dốc –3,323.

     Hiệu suất có thể được tính theo phương trình:

     Hiệu suất = 10^{(–1/độ dốc} ) –1. Lưu ý: Phần mềm cho nhiều công cụ cung cấp một thước đo hiệu quả theo
     tỷ lệ phần trăm. Giá trị này là tỷ lệ phần trăm của E = 2; do đó, hiệu suất 95% tương đương với E = 1,9

     Độ dốc = m và được xác định từ đường cong chuẩn của phương trình y=mx+C.

     C là giao cắt lý thuyết trên trục y và cung cấp một thước đo tương đối về độ nhạy của xét nghiệm.

Độ dốc từ –3,1 đến –3,6 dẫn đến hiệu quả từ 90% đến 110% và thường được chấp nhận, nhưng điều quan trọng là phải cố gắng đạt tới 100% khi xét nghiệm cho phép. Dữ liệu được trình bày trong Hình 9,1 1are minh họa phạm vi biến đổi bình thường về hiệu quả và độ nhạy của một loạt các xét nghiệm khác nhau. Điều này nhằm chứng minh tầm quan trọng của việc báo cáo những dữ liệu này trong ấn phẩm^1,6-8.

Hình 9,11. Một ví dụ về xác định hiệu quả và so sánh một số gen tham chiếu tiềm năng. Như có thể thấy, chúng có hiệu quả và độ nhạy rất khác nhau (dữ liệu do sinh viên tham dự hội thảo qPCR nâng cao, EMBL) cung cấp.

Các phương pháp thay thế cho tính toán hiệu suất đường cong tiêu chuẩn đã được đề xuất. Những phương pháp này báo cáo hiệu quả của các phản ứng đơn lẻ trong ống. Những cách tiếp cận này dựa vào các thuật toán để mô hình hóa các đường cong biểu đồ khuếch đại và do đó phụ thuộc vào số chu kỳ mà có sự gia tăng huỳnh quang. Chúng có khả năng thành công nhất khi phép đo được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA hoặc que đo Scorpions ® vì các xét nghiệm này mang lại sự thay đổi lớn hơn về huỳnh quang trên mỗi chu kỳ. Trong khi loại phương pháp này có khả năng cung cấp một sự thay thế lý tưởng cho các đường cong tiêu chuẩn, phương pháp sau này vẫn là phương pháp phổ biến hơn được sử dụng để đánh giá xét nghiệm. Điều này là do các đường cong tiêu chuẩn không chỉ cung cấp ước tính hiệu quả mà còn cung cấp thêm thông tin về dải động, độ nhạy và khả năng tái tạo của hoạt động và dễ dàng hơn về mặt khái niệm để áp dụng⁹.

Giá trị của R², hoặc mức độ phù hợp của dữ liệu trên đường thẳng đường cong tiêu chuẩn, là thước đo khả năng tái tạo và bị ảnh hưởng bởi độ chính xác của đường ống và bởi phạm vi động của xét nghiệm. Do đó, khi đánh giá xét nghiệm, điều quan trọng là phải sử dụng tối thiểu ba bản sao kỹ thuật cho mỗi pha loãng. Nếu R 2is ≤0,985, xét nghiệm có thể không mang lại kết quả đáng tin cậy vì khả năng tái tạo giữa các lần tái tạo kém. Nếu một hoặc nhiều điểm ở mức thấp nhất của axit nucleic đầu vào bị dịch chuyển ra khỏi vùng tuyến tính của biểu đồ, có khả năng nồng độ đo được vượt quá độ nhạy của xét nghiệm. Nếu một hoặc nhiều điểm ở số bản sao cao nhất của axit nucleic đầu vào được dịch chuyển ra khỏi vùng tuyến tính của cốt truyện, có khả năng phản ứng được bão hòa và nồng độ của mục tiêu vượt quá phạm vi xét nghiệm hữu ích. Ngoài ra, nếu một số điểm ngẫu nhiên nằm trên hoặc dưới đường thẳng, độ chính xác của đường ống hoặc tối ưu hóa xét nghiệm có thể là một vấn đề. Xác minh rằng các nút tai nghe vừa với ống hút đúng cách và thể tích phân phối có thể tái tạo và xác minh tối ưu hóa bộ mồi như mô tả ở trên.

Đường cong tiêu chuẩn là một công cụ thiết yếu để xác nhận các phản ứng đa chiều. Chạy nhiều phản ứng đồng thời giới thiệu sự cạnh tranh cho thuốc thử và làm trầm trọng thêm bất kỳ điều kiện không tối ưu nào, tạo ra những thay đổi lớn trong hiệu quả PCR. Hình 9,1 2demonstrates điểm này. Các đường cong hiệu quả cho hai mục tiêu mồi/đầu dò được thực hiện riêng lẻ và sau đó trong multiplex. Biểu đồ cho thấy rằng trong khi các phản ứng riêng lẻ (các đường màu xanh đậm và xanh lá cây) cho hiệu quả và độ nhạy tương đối tương tự (các giá trị trục y), chạy các phản ứng với nhau làm thay đổi đáng kể độ nhạy và hiệu quả của phản ứng đa nhân.

Hình 9,12. Phản ứng Singleplex so với phản ứng Duplex.

Vật liệu

Rất tiếc, đã xảy ra lỗi ngoài dự kiến

Response not successful: Received status code 500

Tài liệu tham khảo

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, et al. 2009. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 55(4):611-622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

2. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006. SPUD: A quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytical Biochemistry. 351(2):308-310. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.01.051

3. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters. 339(1):62-66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4

4. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WMH, Karlen Y, Bakker O, van den Hoff MJB, Moorman AFM. 2009. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. 37(6):e45-e45. https://doi.org/10.1093/nar/gkp045

5. Nolan T, Bustin SA. 2013. PCR Technology: Current Innovations. 3. CRC Press.

6. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1(3):1559-1582. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236

7. Bustin SA. 2010. Why the need for qPCR publication guidelines??The case for MIQE. Methods. 50(4):217-226. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006

8. Huggett J, Bustin SA. 2011. Standardisation and reporting for nucleic acid quantification. Accred Qual Assur. 16(8-9):399-405. https://doi.org/10.1007/s00769-011-0769-y

9. Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, et al. 2013. Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods. 59(1):32-46. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.08.011