Khắc phục sự cố RT-PCR

Trên trang này

• Phát triển một Giao thức khắc phục sự cố
• Tối ưu hóa thiết kế Oligo
  
• Tối ưu hóa xét nghiệm PCR
• Thiết kế xét nghiệm RT-PCR và qPCR
  
• Chất lượng khuôn mẫu RNA hoặc DNA
  
• Chương trình PCR xét nghiệm
• Trục trặc của máy chu trình nhiệt
• Troubleshooting Examples: Diagnostic Tools
• Đường cong phân ly / làm tan chảy
• Khắc phục sự cố Nghiên cứu Tình huống RT-PCR
• Tóm tắt — Danh sách kiểm tra khắc phục sự cố PCR

Phát triển Giao thức khắc phục sự cố PCR hoặc RT-PCR

Các Nguồn tiềm năng của Lỗi và/hoặc Lỗi Toán tử

Có nhiều khả năng xảy ra lỗi của người vận hành. Các nguồn của những lỗi này thường không được xác định. Bước đầu tiên trong bất kỳ quy trình xử lý sự cố nào là kiểm tra giao thức và lặp lại thử nghiệm. Kiểm tra giao thức (tham khảo Phụ Lục A, Giao thức, của hướng dẫn này) và yêu cầu một nhà sinh học phân tử có kinh nghiệm xem xét kế hoạch thực nghiệm là rất quan trọng. Câu chuyện cảnh báo về các nghiên cứu sinh sau tiến sĩ, người đã điều hành một số PCR thất bại trước khi nhận ra rằng các dNTP đã bị thiếu trong PCR master Mi xis một lời nhắc rằng ngay cả những nhà khoa học làm việc quá sức tốt nhất cũng dễ bị lỗi đơn giản.

Master Mix

Sai sót hoặc vấn đề với hỗn hợp chính của các thành phần phản ứng có thể là nguồn gốc của sự thất bại thảm khốc của khuếch đại trong tất cả các mẫu và điều khiển dương. Trước khi lặp lại thí nghiệm, hãy kiểm tra tất cả các thành phần và nồng độ của chúng. Nếu một lô thuốc thử mới đang được sử dụng, đó là một biện pháp phòng ngừa hữu ích để chạy loại thuốc mới chống lại loại cũ trước khi đưa vào một loạt các thí nghiệm chính. 

Khi chuyển đổi các sản phẩm pha trộn chính, điều quan trọng là nhận ra rằng một số xét nghiệm đặc biệt nhạy cảm vớikết hợp thành phần đệm/nhiệt độ ủ ( Ta )/mồi. Thay đổi bất kỳ một trong những điều này có thể dẫn đến hiệu suất khác. Do đó, xác minh tất cả các xét nghiệm trong hỗn hợp chính đã chọn và trên tất cả các dụng cụ mong muốn trước khi thực hiện thay đổi căn bản. Cũng cần phải xem lại các hướng dẫn được cung cấp với mỗi hỗn hợp chính vì chúng xác định các điều kiện khuyến nghị được tối ưu hóa cho enzyme, cơ chế khởi động nóng và các thành phần bộ đệm.  

Thực hành phòng thí nghiệm tốt để đảm bảo rằng hỗn hợp chính phản ứng đủ được chuẩn bị cho tất cả các mẫu sẽ được chạy cùng nhau. Đảm bảo rằng tất cả các thành phần đều được rã đông và trộn đều cẩn thận và hỗn hợp chính thử nghiệm được trộn rất tốt trước khi phân chia thành mẫu. Điều này đặc biệt liên quan đến một số bộ đệm 2× như KiCqStart^® có độ nhớt cao hơn bộ đệm PCR thông thường.

Oligo Optimization

Oligos có thể gây ra vấn đề nếu chúng được; một trình tự không chính xác hoặc được thiết kế kém, chạy ở nồng độ dưới mức tối ưu, Ta dưới mức tối ưu, hoặc không được dán nhãn hoặc làm nguội (đối với đầu dò). Một xét nghiệm chạy trong các điều kiện dưới tối ưu cho oligo, hoặc sử dụng một thiết kế kém có thể mang lại một số dữ liệu, tuy nhiên điều này có thể không phản ánh sinh học thực sự đang được xem xét. Khi nhận được một oligo đông khô, điều quan trọng là:

1. Xác minh trình tự
   
2. Đảm bảo rằng tất cả DNA được tái tạo trước khi sử dụng
   
3. Xác nhận dung dịch là nồng độ dự kiến
   

Resuspend oligos bằng cách đun nóng oligo đến 90 °C trong 5 phút và sau đó trộn đều. Các chu kỳ đóng băng lặp đi lặp lại cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất oligo và do đó tất cả các oligos ở nồng độ chứng khoán (thường là 100 μM) nên được tách ra và lưu trữ ở -20 °C, hoặc -80 °C trong thời gian dài.

Trong giai đoạn khắc phục sự cố, điều quan trọng là phải xác minh rằng chuỗi chính xác được sắp xếp bằng cách quay lại chuỗi đích và xác nhận rằng các chuỗi oligo thực sự có mặt. Đảm bảo rằng chất lượng oligo chính xác bằng cách liên hệ với nhà cung cấp oligo. Đo nồng độ hoạt động của oligo và kiểm tra bằng mắt các phân tử huỳnh quang để xác nhận rằng các phân tử này được dán nhãn. Kiểm tra các mồi của các xét nghiệm đầu dò trong hỗn hợp qPCR i Green SYBR ® để xác minh khuếch đại. Cân nhắc tối ưu hóa nồng độ mồi hoặc _Ta (xem Tối ưu hóa và xác thực xét nghiệm). Khi sử dụng đầu dò lần đầu tiên, thu thập dữ liệu huỳnh quang cho càng nhiều bước sóng tiềm năng càng tốt để quan sát thấy bất kỳ rò rỉ tín hiệu tiềm năng nào giữa các kênh và có thể phát hiện lỗi trong ghi nhãn.

Tối ưu hóa PCR không đầy đủ

Ảnh hưởng của tối ưu hóa xét nghiệm được mô tả và thể hiện trong Tối ưu hóa và Xác thực xét nghiệm. Khi một xét nghiệm thất bại hoặc đang thực hiện dưới mức tối ưu, nhưng không có sai sót trong thiết kế hoặc quy trình hoạt động, nó có thể được hưởng lợi từ việc tối ưu hóa các điều kiện thử nghiệm. Khi khắc phục sự cố, hãy kiểm tra mồi ở nồng độ cuối cùng 100 nM, 500 nM và 900 nM và/hoặc _Ta từ 55 °C đến 70 °C (sử dụng độ dốc nhiệt độ) để xác định liệu xét nghiệm có cải thiện với tối ưu hóa hơn không.

Thiết kế xét nghiệm RT-PCR và qPCR

Thiết kế xét nghiệm được mô tả trong PCR/qPCR/dPCR Assay Design. Khi khắc phục sự cố một xét nghiệm, hãy đảm bảo rằng thiết kế đã được xác minh. Xác nhận rằng bộ mồi PCR/qPCR và vị trí amplicon phù hợp với giao thức mồi RT. Ví dụ, đảm bảo rằng các xét nghiệm áp dụng cho cDNA được chuẩn bị sau khi mồi oligo-DT nằm về phía 3 của bảng điểm. Đảm bảo rằng thông tin về trình tự là đáng tin cậy và các biến thể mối nối và SNP thích hợp đã được xem xét.

Hình 11,1A. Xét nghiệm có một sơ đồ khuếch đại bất thường với một sự trôi dạt rõ rệt của đường cơ sở.

Hình 11,1B. Trình tự của đầu dò được bao gồm trong xét nghiệm được nhập vào phần mềm dự đoán gấp nếp gấp khúc. Rõ ràng là đầu dò có thể áp dụng một cấu trúc gấp ổn định trong dung dịch và điều này có thể dẫn đến vấn đề quan sát được.

Chất lượng khuôn mẫu RNA hoặc DNA

Ảnh hưởng của chất lượng mẫu đối với hiệu suất xét nghiệm được mô tả trong phần Lọc và Đánh giá chất lượng mẫu. Chất lượng mẫu bao gồm việc xem xét số lượng, tính toàn vẹn và sự hiện diện của các chất ức chế. Điều quan trọng là phải đảm bảo chất lượng RNA phù hợp với giao thức mồi RT thích hợp nhất (xem Phiên mã ngược) và sử dụng mẫu chất lượng tốt nhất có thể. Tương tự như vậy, số lượng RNA được thêm vào phản ứng RT phải nằm trong phạm vi của giao thức và trong nhiều trường hợp, điều này phải giống nhau đối với tất cả các phản ứng. ReadyScript^® là một ngoại lệ đáng chú ý đối với hướng dẫn này vì việc sử dụng thuốc thử và giao thức này tạo ra nồng độ cDNA tuyến tính tỷ lệ thuận với số lượng RNA đầu vào. Khi khắc phục sự cố mẫu mang lại _{CQ cao hơn dự kiến,} hãy chạy xét nghiệm SPUD hoặc pha loãng mẫu qua chuỗi pha loãng 1:5 hoặc 1:10 và lặp lại xét nghiệm (Hình 11,2) để xác định các mẫu có chứa chất ức chế.

Hình 11,2. Khuếch đại dung dịch pha loãng chuỗi 10 lần của mẫu DNA. Các bản sao lại chính xác nhưng ΔCq không nhất quán, giảm khi pha loãng ngày càng tăng. Dữ liệu cũng cho thấy một tín hiệu dương trong điều khiển NO mẫu (NTC) cho thấy sự nhiễm bẩn hoặc hình thành dimer mồi và sự pha loãng dưới 105 bản sao có dữ liệu giống hệt với NTC.

Số lượng mẫu cũng là một cân nhắc quan trọng. Bao gồm quá nhiều hoặc quá ít mẫu vào PCR sẽ dẫn đến phản ứng thất bại và các biểu đồ khuếch đại qPCR xuất hiện bất thường. Hình 11,3 Hiển thị một phản ứng có chứa dung dịch pha loãng tuần tự gấp 10 lần mẫu oligo nhân tạo. Các pha loãng thấp hơn quá tập trung để phản ứng có hiệu quả hoặc để thiết bị xử lý hiệu quả dữ liệu cơ sở (Hình 11,3B), dẫn đến các biểu đồ khuếch đại bất thường và dữ liệu không đáng tin cậy.

Hình 11,3. A) Khuếch đại dung dịch pha loãng hàng loạt 10 lần của mẫu nhân tạo với các mồi cụ thể và đầu dò có nhãn FAM. CQ rất thấp đối với các mẫu tập trung, các biểu đồ khuếch đại không được cách quãng thường xuyên và bất thường. B) Hiển thị dữ liệu thô cho các biểu đồ khuếch đại này. Các phản ứng chứa nồng độ mục tiêu cao nhất cũng có huỳnh quang nền cao hơn đáng kể và năng suất huỳnh quang tối thiểu thông qua phản ứng.

Chương trình PCR xét nghiệm

Các điều kiện chu kỳ PCR phải phù hợp cho cả thí nghiệm và thuốc thử (ví dụ, xem Master Mix). Không nên chấp nhận cài đặt thiết bị mặc định mà không xác minh.

Trục trặc chu trình nhiệt

Lỗi dụng cụ có thể có khởi phát xảo quyệt và do đó, có thể khó chẩn đoán. Để ngăn ngừa chi phí sửa chữa tốn kém, hãy đảm bảo rằng tất cả người vận hành dụng cụ đều được đào tạo đầy đủ và giám sát ban đầu. Một số lỗi dụng cụ gây ra các hỏng hóc thảm khốc, dẫn đến không có dữ liệu khuếch đại hoặc huỳnh quang trong khi những lỗi khác bóp méo dữ liệu hoặc xử lý các mẫu theo cách không đồng nhất tạo ra sự khác biệt nhân tạo giữa các mẫu sinh học giống hệt nhau. Việc sử dụng các mẫu kiểm soát với các xét nghiệm kiểm soát là vô giá để khắc phục sự cố. Khi nghi ngờ có lỗi thiết bị, xét nghiệm đáng tin cậy, tối ưu hóa phải được chạy trong tất cả các giếng. Việc kiểm tra tính đồng nhất này sẽ tiết lộ các vấn đề cụ thể cho các khu vực của thiết bị cũng như các vấn đề kiểm tra và dụng cụ riêng biệt.

Ví dụ khắc phục sự cố PCR minh họa cách sử dụng Công cụ chẩn đoán

Sau khi chạy PCR được lên kế hoạch tốt, có một số công cụ chẩn đoán sẵn có để khắc phục sự cố:

• Kiểm soát mẫu và xét nghiệm
  
• Thuốc thử nhuộm gel/SYBR Green I điểm cuối
• Biểu đồ khuếch đại (kiểm tra sơ đồ mạch khuếch đại và lặp lại)
  
• Đường cong chuẩn (độ dốc và R2)/chuỗi pha loãng
  
• Biểu đồ tan chảy/phân ly (nhuộm I xanh SYBR, Đèn hiệu phân tử, Đầu dò Scorpions ®)
  
• Dạng xem dữ liệu thô/đa thành phần

Kiểm soát mẫu/phản ứng

Chúng tôi đặc biệt khuyến nghị sử dụng các biện pháp kiểm soát. Hầu như không thể khắc phục sự cố xét nghiệm thất bại mà không có thông tin từ bộ điều khiển thích hợp.

Hình 11,4. A) Mẫu không pha loãng không thể khuếch đại trong khi các chất pha loãng cho thấy hiệu quả khuếch đại được cải thiện. B) Việc bổ sung 0,3% BSA vào hỗn hợp qPCR hỗ trợ khuếch đại từ mẫu không pha loãng.

Việc điều tra xét nghiệm hoàn toàn thất bại có thể khó khăn vì có rất ít thông tin để xử lý sự cố. Vì nhiều thất bại xét nghiệm là kết quả của một số lỗi thảm khốc, nên kiểm tra đầu tiên phải là để xác minh thử nghiệm đã thiết lập và sau đó lặp lại PCR. Nếu điều này không thành công, quy trình xử lý sự cố phụ thuộc vào thông tin liên quan đến từng thành phần của thí nghiệm (Hình 11-5).

Hình 11,5. Quy trình xử lý sự cố cơ bản cho PCR.

Khi một thí nghiệm qPCR hoàn toàn thất bại, bước đầu tiên là kiểm tra thiết kế xét nghiệm, các chuỗi oligo và dữ liệu QC từ nhà sản xuất oligo. Mặc dù xét nghiệm có thể đã thất bại, dữ liệu thô/đa thành phần qPCR có thể được sử dụng để cung cấp thêm thông tin. Hình 11,6 Hiển thị sơ đồ dữ liệu thô cho hai xét nghiệm có chứađầu dò có nhãn 6-FAM™ hoặc HEX™ (VIC ® ). Mặc dù cả hai xét nghiệm đều cho thấy khuếch đại, tín hiệu HEX xấp xỉ một nửa so với tín hiệu FAM. Vì đây là một chất nhuộm vốn yếu hơn, đây là một quan sát bình thường. Phân tích gel agarose (Hình 11,6B) cho thấy cả hai phản ứng mang lại nồng độ tương tự các sản phẩm, hỗ trợ quan sát rằng  các giá trị qPCR CQ là tương tự nhau.

Hình 11,6. A) Biểu đồ dữ liệu thô của xét nghiệm song công có chứa FAM và đầu dò HEXdán nhãn. Đầu dò FAM tự nhiên tạo ra huỳnh quang cao hơn. B) gel agarose cho thấy số lượng sản phẩm bằng nhau được sản xuất trong mỗi phản ứng và xác nhận quan sát qPCR CQ.

Kiểm tra dữ liệu thô là kiểm tra hữu ích để xác minh rằng đầu dò được dán nhãn chính xác và được thêm vào phản ứng. Hình 11. 7shows dữ liệu thô để khuếch đại ba mục tiêu trong một thí nghiệm triplex. Các đầu dò cụ thể cho từng mục tiêu được dán nhãn bằng FAM, HEX và TAMRA. Các đầu dò HEX và TAMRA cho thấy một nền thấp và khuếch đại hiệu quả, tuy nhiên tín hiệu FAM luôn cao trong suốt thí nghiệm và không có bằng chứng về khuếch đại. Điều này phù hợp với nồng độ đầu dò quá cao trong phản ứng hoặc lỗi với đầu dò sao cho không có sự ngắt quãng ban đầu của tín hiệu. Trong những trường hợp như vậy, cần xác minh nồng độ đầu dò và thiết kế xét nghiệm, đảm bảo đầu dò có nhãn và dụng cụ làm nguội tương thích và thử nghiệm đầu dò mới nếu cần.

Hình 11,7. Một phản ứng triplex được sử dụng để phát hiện ba mục tiêu bằng các đầu dò được dán nhãn với FAM, HEX và TAMRA. Các đầu dò HEX và TAMRA mang lại khuếch đại từ các mục tiêu nhưng đầu dò FAM không cho thấy khuếch đại. Việc kiểm tra dữ liệu thô cho thấy độ huỳnh quang nền đặc biệt cao và không có sự khác biệt nào được quan sát trong suốt phản ứng. Điều này phù hợp với nồng độ đầu dò quá cao trong phản ứng hoặc đầu dò bị lỗi khi không đủ thời gian chờ.

Nếu thí nghiệm ban đầu dựa vào phát hiện đầu dò, xét nghiệm nên được lặp lại bằng cách sử dụng thuốc thử SYBR Green I, bao gồm kiểm soát dương và âm (nhưng không phải là mẫu quý). Ngoài ra, các sản phẩm của một phản ứng thất bại có thể được kiểm tra trên gel agarose nhuộm ethidium bromua. Việc áp dụng phương pháp SYBR Green I để lặp lại thí nghiệm là tốt hơn vì nó tránh nguy cơ nhiễm bẩn và cung cấp một thí nghiệm lặp lại để xác minh thất bại ban đầu. Nếu thí nghiệm SYBR Green I cung cấp dữ liệu, có thể lỗi đầu dò ban đầu là do lỗi kỹ thuật hoặc lỗi đầu dò. Để phân biệt giữa lỗi thử nghiệm hoặc lỗi với đầu dò, hãy lặp lại thí nghiệm đầu dò; nếu phản ứng lại thất bại, hãy thay đầu dò. Cách tiếp cận này có thể được áp dụng để điều tra các phản ứng đang tạo ra dữ liệu kém. Trong ví dụ được hiển thị trong Hình 11,8, phản ứng đầu dò là dưới mức tối ưu và khi so sánh với chạy phản ứng sử dụng SYBR Green I, có thể thấy rằng tín hiệu đầu dò không phản ánh thí nghiệm. Trong những trường hợp như vậy, thiết kế xét nghiệm phải được kiểm tra và thử nghiệm đầu dò mới.

Hình 11,8. Các phản ứng giống hệt nhau được chạy có chứa đầu dò qPCR hoặc nhuộm màu xanh lá cây SYBR (như được chỉ định). Phản ứng SYBR Green I là khoảng mười một chu kỳ nhạy cảm hơn và tạo ra huỳnh quang điểm cuối cao hơn nhiều. Đây là dấu hiệu của một lỗi trong đầu dò hoặc vấn đề với thiết kế đầu dò (dữ liệu được cung cấp bởi GS. Stephen Bustin, Vương quốc Anh).

Đang xác thực nhãn đầu dò

Dữ liệu thô hoặc biểu đồ đa thành phần là một công cụ chẩn đoán hữu ích để điều tra xem nồng độ thích hợp của đầu dò có được đưa vào phản ứng hay không và đầu dò được dán nhãn đầy đủ và làm nguội. Hình 11. 9shows biểu đồ đa thành phần cho một phản ứng chứa ba đầu dò. Hai biểu đồ khuếch đại đầu tiên tạo ra và huỳnh quang nền là hiển nhiên. Không có dữ liệu từ đầu dò thứ ba và kiểm tra dữ liệu thô cho thấy huỳnh quang nền tương đương với điều khiển trống nước không chứa đầu dò nào. Do đó, dữ liệu này là kết quả của sự thiếu huỳnh quang trong phản ứng. Điều này có thể là do lỗi trong quá trình thiết lập mà đầu dò không được đưa vào hoặc đầu dò không được dán nhãn.

Hình 11,9. Ba gen được phát hiện trong cùng mẫu. Hai phản ứng dẫn đến khuếch đại (1 và 2), tuy nhiên 3rd âm tính. Một cuộc kiểm tra chế độ xem đa thành phần cho thấy độ huỳnh quang nền cho phản ứng 3rd tương đương với việc kiểm soát nước cho thấy không có tín hiệu.

Kiểm tra thêm nhãn đầu dò có thể được thực hiện bằng cách tiêu hóa DNase I. Điều này phải được thực hiện cẩn thận để đảm bảo rằng các cổ phiếu thăm dò và mồi không bị nhiễm enzyme, dẫn đến kết quả thảm khốc. Một phân lượng của một đầu dò hỏng (Hình 11,10A) tương đương với nó bao gồm trong một phản ứng, ví dụ, 300 nM được ủ kèm và không có DNase I. Điều này có thể được thực hiện trong thời gian thực (Hình 11,10B) sao cho năng suất huỳnh quang được đo theo thời gian hoặc cách khác, chỉ số điểm đầu và kết thúc (sau 10 phút) cung cấp thông tin đầy đủ. Khi thực hiện kiểm tra này, điều quan trọng là phải so sánh dữ liệu với đầu dò hoạt động tốt và có cùng nhãn huỳnh quang và bộ làm chờ (Hình 11,10B). 

Hình 11,10. A) Hai mẫu được phát hiện bằng các que đo khác nhau, cả hai đều được dán nhãn FAM. Trong khi phát hiện bằng cách sử dụng một đầu dò dẫn đến tín hiệu huỳnh quang cao, thứ hai yếu hơn nhiều. B) Một điều khiển và một đầu dò thử nghiệm (300 nM) được ủ ở 37 °C trong một dụng cụ thời gian thực trong bộ đệm DNase I khi có mặt hoặc không có enzyme DNase I. Việc phát hành huỳnh quang từ thăm dò 1 xấp xỉ hai lần so với thăm dò 2, chứng minh rằng việc dán nhãn đầu dò 2 là không đủ.

Biểu đồ khuếch đại

Cấu trúc của các biểu đồ khuếch đại và khả năng tái tạo của các bản sao kỹ thuật cung cấp nhiều thông tin liên quan đến chất lượng của xét nghiệm qPCR và cũng có thể cung cấp các chỉ báo cảnh báo đầu tiên rằng tất cả không phải như mong muốn. Các biểu đồ khuếch đại trong Hình 11,11 Aare không điển hình, rất ồn ào và sẽ khó diễn giải chính xác. Một cuộc kiểm tra thêm các giá trị huỳnh quang tiến sĩ cho thấy hiệu suất huỳnh quang điểm cuối chỉ là 400 đơn vị, cho thấy phản ứng không đầy đủ nhưng các biểu đồ khuếch đại đã được tạo ra bởi phần mềm thiết bị và tự động hóa. Tương tự như vậy, dữ liệu trong Hình 11,11 Bhas a foxtail (đường cong giảm) rõ rệt ở đầu hồ sơ, trước khi tăng trở lại sau một phần đường cơ sở. Sự xuất hiện của đuôi cáo là nhất quán trong hai phản ứng, nhưng một phản ứng có điểm cuối thấp hơn nhiều (Hình 11,11C) dẫn đến một đuôi cáo tương đối khuếch đại.

Hình 11,11. A) biểu đồ khuếch đại nhiễu do tự động hóa của phần mềm thiết bị của dữ liệu kém với độ huỳnh quang thấp. B) Các phản ứng tạo ra điểm cuối thấp Dr có một đuôi cáo ban đầu rõ rệt. C) Đuôi cáo được coi là một hiệu ứng bình thường khi tỷ lệ với xét nghiệm chất lượng cao.

Tương tự, các biểu đồ khuếch đại trong Hình 11,12 Aare rõ ràng bất thường và không thể được sử dụng khi chúng được trình bày. Một biểu đồ khuếch đại giảm xuống dưới 0 Dr (Hình 11,12A) là một dấu hiệu cổ điển về cài đặt đường cơ sở không phù hợp đã được áp dụng. Kiểm tra dữ liệu thô cho phản ứng này (Hình 11,12B) cho thấy các biểu đồ khuếch đại thực tế có cấu hình bình thường, xác nhận rằng dữ liệu được phân tích là kết quả của một vấn đề phần mềm thiết bị. Đường cơ sở thích hợp có thể được suy ra từ dữ liệu thô và được áp dụng trong phần mềm. Trong trường hợp này các chu kỳ từ 6 đến 16 đại diện cho tuyến tính ban đầu, pha cơ sở của phản ứng và khi áp dụng, dẫn đến các biểu đồ khuếch đại bình thường (Hình 11,12C).

Hình 11,12. A) Sơ đồ khuếch đại rõ ràng bất thường với một phần của biên dạng nhúng xuống dưới đường cơ sở. B) Kiểm tra biểu đồ dữ liệu thô cho thấy dữ liệu phản ứng đúng như mong đợi. C) Setting the instrument baseline according to the appropriate cycles restores the normal profile to the data of analyzed amplification plots.

Hồ sơ đồ khuếch đại cũng có thể được giải thích để cung cấp thông tin về chất lượng của xét nghiệm và tối ưu hóa. Hình 11,1 3shows Khuếch đại mẫu pha loãng tuần tự gấp 10 lần với mỗi nồng độ chạy trong qPCR trùng lặp. Khả năng tái tạo giữa các bản sao là kém, chênh lệch chu kỳ (Δ_{CQ )}giữa các dữ liệu không phải là hằng số và nó không phải là 3,323 chu kỳ, như dự kiến cho một pha loãng nối tiếp gấp 10 lần. Việc kiểm tra các biểu đồ khuếch đại, với việc xem xét đây là một đường cong tiêu chuẩn, cho thấy xét nghiệm dưới tiêu chuẩn và không thể sử dụng để phân tích. Các lý do sẽ cần điều tra thêm nhưng có thể là kết quả của; thiết kế xét nghiệm kém (xem PCR/qPCR/dPCRxét nghiệm Design ), điều kiện xét nghiệm dưới tối ưu (xem Tối ưu hóa và xác thực xét nghiệm), hoặc ống dẫn kém (xét nghiệm lặp lại).

Hình 11,13. Một mẫu cDNA đã được pha loãng thông qua pha loãng tuần tự gấp 10 lần và mẫu cụ thể được phát hiện bằng cách sử dụng qPCR trùng lặp cho mỗi pha loãng. Các bản sao rất kém, cho thấy một vấn đề với đường ống hoặc với tối ưu hóa xét nghiệm.

Hình 11,14. Trong một qPCR tiêu chuẩn, dữ liệu đột nhiên tăng lên với một cấu hình không điển hình.

Hình 11,15. Đối với các vạch huỳnh quang giảm hoặc móc, nguyên nhân có thể là do chuỗi bổ sung cạnh tranh với mồi và/hoặc đầu dò để ủ mẫu. Bỏ qua miễn là CT không bị ảnh hưởng

Đường cong phân ly / làm tan chảy

Phân tích phân ly hoặc đường cong tan chảy được chạy sau qPCR và là một công cụ phân tích được sử dụng kết hợp với thuốc nhuộm liên kết DNA (chẳng hạn như SYBR Green I) hoặc các đầu dò không phân hủy như Đèn hiệu phân tử hoặc Đầu dò Scorpions ®, để xác minh rằng một sản phẩm đã được khuếch đại. Sau khi khuếch đại PCR, kết quả là amplicon được ủ ở nhiệt độ tăng và những thay đổi trong tín hiệu huỳnh quang được phát hiện khi sự chuyển đổi DNA giữa trạng thái sợi kép và sợi đơn. Khi phản ứng chứa một amplicon, điều này tan chảy đồng đều và biểu đồ của DF/DT (tốc độ thay đổi huỳnh quang đối với nhiệt độ) cho thấy một đỉnh duy nhất. Kiểm tra đường cong nóng chảy đặc biệt hiệu quả khi kết hợp với dữ liệu từ các biện pháp kiểm soát. Hình 11,16 Hiển thị hồ sơ tan chảy qPCR sau cho một loạt các mẫu thử nghiệm, điều khiển dương và điều khiển mẫu NO. Hồ sơ nóng chảy cho các mẫu xét nghiệm giống hệt với điều khiển dương và mỗi mẫu cho thấy một đỉnh duy nhất cho DF/DT. Cấu hình tan chảy cho điều khiển NO mẫu có cấu hình rộng hơn và _{TM thấp hơn}. Những quan sát này đều phù hợp với sự hiện diện của các bộ điều khiển mồi là rõ ràng trong điều khiển tiêu cực. Điều này được xác nhận bằng cách sử dụng một ethidium bromide nhuộm agarose gel (Hình 11,16B) cũng cho thấy các bộ điều chỉnh độ sáng mồi trở nên rõ ràng khi mẫu có mặt ở nồng độ thấp. Điều này gây ra ước tính quá cao đối tượng khi phát hiện trong các mẫu có nồng độ mục tiêu thấp. Do đó, xét nghiệm phải được tối ưu hóa hoặc thiết kế lại. Ngược lại, Hình 11,16 Cshows rằng biên dạng tan chảy cho sản phẩm trong điều khiển NO mẫu giống với biên dạng tan chảy cho mẫu kiểm soát dương và mẫu xét nghiệm. Đây là dấu hiệu rõ ràng về sự nhiễm bẩn của điều khiển không mẫu với mẫu trong quá trình thiết lập thử nghiệm. Ví dụ cuối cùng chứng minh sự nhận dạng khuếch đại mục tiêu từ gDNA có trong mẫu cDNA (Hình 11,16D). Các amplicon có nguồn gốc từ gDNA dài
 hơn và do đó, có TM cao hơn so với cDNA.

Hình 11,16A. Một điều khiển dương tính, phản ứng thử nghiệm và NTC đã được khuếch đại và sau đó được phân tích tan chảy sau PCR. Có thể thấy sản phẩm trong NTC tan chảy ở nhiệt độ thấp hơn và với đỉnh nóng chảy rộng hơn, phù hợp với sự hình thành dimer mồi.

Hình 11,16B. Các bộ điều chỉnh độ sáng mồi rõ ràng trên một độ phân giải gel của các mẫu này (cùng với các mẫu khác), với sự hình thành dimer nguyên tố tỷ lệ nghịch với nồng độ mẫu đầu vào.

Hình 11,16C. Một ví dụ về áp dụng phân tích đường cong nóng chảy để xác định ô nhiễm phản ứng trong NTC.

Hình 11,16D. Xác định một bộ khuếch đại lớn hơn là kết quả của PCR của gDNA.

Hình 11,17. A) Một hồ sơ nóng chảy và B) phân tích gel agarose của phản ứng i màu xanh lá cây SYBR. Mặc dù cấu hình tan chảy cho thấy các sản phẩm có TM khác nhau, hình ảnh gel cho biết có một bộ khuếch đại duy nhất. Đây là biểu thị của một chuỗi amplicon chứa các vùng giàu AT hoặc GC hoặc một nguyên tố lặp đi lặp lại dẫn đến sự tan chảy không đều

Pha loãng nối tiếp mẫu/đường cong chuẩn

Bất kể thiết kế thử nghiệm có bao gồm yêu cầu cho đường cong tiêu chuẩn để định lượng cuối cùng hay không, phát hiện pha loãng hàng loạt mẫu phù hợp là một cách tiếp cận mạnh mẽ để kiểm tra xác thực và khắc phục sự cố. Phát hiện pha loãng nối tiếp cho phép xác định phạm vi động học tuyến tính thực nghiệm của xét nghiệm. Hình 11,18 Hiển thị đường cong tiêu chuẩn với các điểm dữ liệu nồng độ thấp không phù hợp với biên dạng tuyến tính. Lý do thông thường nhất cho mô hình dữ liệu này là các bộ điều chỉnh độ sáng mồi đã được hình thành trong các mẫu có nồng độ thấp (như được thể hiện trong Hình 11,18B). Đây là đường cong tiêu chuẩn được tạo từ dữ liệu được hiển thị trong Hình 11,2. Hình 11,18 Hình ảnh một đường cong tiêu chuẩn với các mẫu tập trung cao rơi ra khỏi phạm vi tuyến tính. Lý do thông thường nhất cho điều này là ức chế mẫu phản ứng hoặc thiết lập đường cơ sở không phù hợp.

Hình 11,18. A) Các điểm dữ liệu liên quan đến nồng độ mục tiêu thấp hơn không nằm trên đường cong tiêu chuẩn. B) Đây là điển hình của một phản ứng dẫn đến các bộ điều chỉnh độ mờ như được minh họa. Trong trường hợp này không có sự gia tăng CQ quan sát được đối với các mẫu ở nồng độ thấp.

Hình 11,18C. Các mẫu có nồng độ mẫu cao không nằm trên đường cong tiêu chuẩn. Đây là điển hình của các phản ứng bị ức chế bởi nồng độ mẫu hoặc do cài đặt đường cơ sở không chính xác.

Đường cong tiêu chuẩn cũng được sử dụng để đo hiệu quả của phản ứng trên dải động của các pha loãng. Phải cẩn thận để đảm bảo rằng tất cả các điểm được sử dụng để tính toán hiệu quả nằm trên đường dây. Phản ứng nên hiệu quả càng gần 100% càng tốt và những phản ứng có hiệu quả rõ ràng (> 110%) hoặc thấp (<85%) được nghiên cứu thêm.

Hình 11,19A. Một mẫu axit nucleic đã được pha loãng thông qua một loạt 10 lần. Các biểu đồ khuếch đại có gradient nông bất thường và ΔCq là 4 chu kỳ thay vì 3,3 dự kiến.

Hình 11,19B. Gradient của đồ thị đường cong tiêu chuẩn của CQ so với đại lượng được sử dụng để tính toán hiệu quả của phản ứng.

Hình 11,20A. Một mẫu axit nucleic đã được pha loãng thông qua một loạt 10 lần. ΔCq giữa các biểu đồ khuếch đại là 1,5 chu kỳ thay vì 3,3

Hình 11,20B. Gradient của biểu đồ đường cong tiêu chuẩn của CQ so với đại lượng được sử dụng để tính toán hiệu quả của phản ứng gần 140%.

Hình 11,20C. Một cuộc kiểm tra hồ sơ đường cong nóng chảy cho thấy các mẫu nồng độ thấp hơn (các vết màu vàng và xanh dương) cũng chứa tín hiệu từ các bộ điều chỉnh độ sáng mồi được khuếch đại (cực đại ở TM dưới).

Khắc phục sự cố Nghiên cứu Tình huống RT-PCR

Một xét nghiệm dò không thành công

Một xét nghiệm dựa trên đầu dò được thiết kế để phát hiện EIFB1 trong các mẫu cDNA của con người nhưng không có khuếch đại. Các phản ứng ban đầu được chạy trên một thiết bị ABI StepOne sử dụng thuốc thử tương thích. Một nỗ lực đã được thực hiện để tối ưu hóa mồi bằng cách sử dụng một phạm vi nồng độ từ 200 nM đến 900 nM (Hình 11,21) nhưng không cải thiện. Thiết kế thử nghiệm đã được xác minh và tìm thấy phù hợp với mục tiêu, và trong silico, người ta dự đoán rằng đây là một xét nghiệm chất lượng cao. Mồi mới được tổng hợp và chạy cùng với một phân lượng của tổng hợp ban đầu bằng cách sử dụng một toán tử khác, thuốc thử SYBR Green I (do đó các thuốc thử khác nhau) và nhạc cụ (một Eppendorf Realplex) (Hình 11,22). Trong khi áp dụng phương pháp này, chúng tôi lưu ý rằng mục tiêu chính là giải quyết vấn đề, trong khi mục tiêu thứ hai là giải thích sự thất bại. Phản ứng này mang lại sự khuếch đại tương đương từ cả hai lô mồi. Ở giai đoạn này, có vẻ như vấn đề phản ứng nằm ở đầu dò và do đó một đầu dò mới đã được tổng hợp và cả hai lô được so sánh bởi người vận hành thứ hai trên dụng cụ Realplex sử dụng thuốc thử LuminoCt ® (các thuốc thử khác nhau với những người đã thử ban đầu) (Hình 11,23). Cả hai đầu dò đều mang lại dữ liệu khuếch đại, đầu dò mới xuất hiện tốt hơn một chút so với đầu dò ban đầu mặc dù đáng chú ý rằng đầu dò ban đầu đã được đăng giữa các phòng thí nghiệm và do đó ở nhiệt độ phòng, trong giải pháp trong vài ngày. Ở giai đoạn này, rõ ràng là cả xét nghiệm ban đầu và xét nghiệm thay thế đều hoạt động khi được vận hành bởi người vận hành thứ hai trong thuốc thử LuminoCt ® trên dụng cụ Realplex.

Do đó, các lý do còn lại cho lỗi ban đầu được coi là:

• Operator: Thí nghiệm đã được lặp lại nhiều lần bởi một nhà khoa học có kinh nghiệm và do đó, đây được coi là một lời giải thích không chắc chắn.
  
• Dụng cụ: Có thể có một số vấn đề vì một số xét nghiệm khác đã thất bại.
  
• Thuốc thử: Giải thích dễ nhất để kiểm tra.  Thuốc thử LuminoCt ® được người vận hành đầu tiên so sánh với thuốc thử hiện có bằng cách sử dụng cả hai lô oligo trên thiết bị ABI StepOne. Phản ứng thất bại với thuốc thử ban đầu nhưng khuếch đại tốt với thuốc thử LuminoCt ® (Hình 11,24).

Hình 11,21. Mồi đến EIFB1 đã được thử nghiệm ở nồng độ từ 200 nM đến 900 nM. Không có khuếch đại được quan sát dưới bất kỳ điều kiện nào (thuốc thử oligos và ABI trên ABI StepOne Plus).

Hình 11,22. Hai lô mồi với EIFB1 được so sánh trong thuốc thử SYBR Green I; mẻ ban đầu thất bại và một mẻ mới. (Oligos và thuốc thử trên Eppendorf Realplex Instrument). Cả hai bộ mồi đều hỗ trợ khuếch đại.

Hình 11,23. Hai lô mồi và que đo đến EIFB1 được so sánh trong thuốc thử LuminoCt®; mẻ không thành công ban đầu và một mẻ mới. (Oligos và thuốc thử trên Eppendorf Realplex Instrument). Cả hai bộ oligos đều hỗ trợ khuếch đại.

Hình 11,24. Xét nghiệm mồi và thăm dò năm EIFB1 được chạy trong hai thuốc thử khác nhau (thuốc thử ABI hoặc LuminoCt® ban đầu). Dữ liệu chỉ được thu nhận từ xét nghiệm này khi chạy bằng thuốc thử LuminoCt®.

Hiệu suất phản ứng không chính xác và thay đổi

Một thử nghiệm đã được thực hiện trên sự pha loãng hàng loạt của một oligo nhân tạo, sử dụng một mồi tiêu chuẩn và thử nghiệm đầu dò. Xét nghiệm ban đầu đã được phát triển và tối ưu hóa trên một thiết bị khác, nhưng hiệu ứng pha loãng kỳ lạ không được mong đợi khi được chuyển sang một phòng thí nghiệm và dụng cụ thử nghiệm khác (Hình 11,25A). Tất cả các điều kiện xét nghiệm được tối ưu hóa lại để cụ thể cho phòng thí nghiệm mới nhưng không có thay đổi đối với dữ liệu. Toán tử quan sát thấy hiệu ứng rõ rệt hơn khi xét nghiệm được lặp lại trong vòng vài giờ, sử dụng cùng một chuỗi pha loãng. Là một phần của quy trình khắc phục sự cố, xét nghiệm được chạy trên một thiết bị khác bởi một toán tử khác, một lần nữa tạo ra đường cong tiêu chuẩn dự kiến. Điều này dẫn đến gợi ý rằng vấn đề ban đầu là do; lỗi toán tử, lỗi thiết bị hoặc một số biến thể tinh tế trong quy trình thử nghiệm. Vì cả hai người vận hành đều có kinh nghiệm cao và thiết bị hoạt động tốt cho các thí nghiệm khác, lựa chọn khác biệt tinh tế đã được kiểm tra. Một đầu mối quan trọng là quan sát sự thay đổi trong dữ liệu từ cùng một chuỗi pha loãng sau một khoảng thời gian lưu trữ các mẫu ở 4 °C (hình 11,25 Aand 11,25B). Điều này dẫn đến việc kiểm tra các ống được sử dụng cho chuỗi pha loãng và thử nghiệm các lựa chọn thay thế. Sau khi chuyển sang ống phản ứng Eppendorf 1,5 mL cho chuỗi pha loãng, đường cong tiêu chuẩn dự đoán được tạo ra (Hình 11,25C), chứng minh rằng điều cần thiết là sinh học phân tử, đồ nhựa lưu giữ thấp được chọn cho PCR và những xét nghiệm này nhạy cảm với các biến đổi tinh tế trong giao thức.

Hình 11,25A. Một mẫu oligo nhân tạo đã được pha loãng gấp 10 lần và phát hiện bằng cách sử dụng một xét nghiệm dựa trên đầu dò cụ thể. Có sự khác biệt không nhất quán giữa các biểu đồ khuếch đại.

Hình 11,25B. Một mẫu oligo nhân tạo đã được pha loãng 10 lần (đây là các chất pha loãng được phát hiện trong Hình 11,25A) và để ở 4 °C trong vài giờ trước khi được phát hiện bằng xét nghiệm dựa trên đầu dò cụ thể. Có sự khác biệt không nhất quán giữa các biểu đồ khuếch đại được làm trầm trọng thêm bởi thời gian giữa pha loãng và xét nghiệm.

Hình 11,25C. Một mẫu oligo nhân tạo đã được pha loãng gấp 10 lần thành các ống cấp sinh học phân tử và được phát hiện bằng cách sử dụng một xét nghiệm dựa trên đầu dò cụ thể. Có sự khác biệt nhất quán giữa các biểu đồ khuếch đại, như mong đợi.

Tóm tắt — Danh sách kiểm tra khắc phục sự cố PCR

• Kiểm tra chất lượng của mẫu (vật liệu bị xuống cấp sẽ gây ra kết quả sai).
  
• Giao thức kiểm tra RT tương thích với thiết kế (ví dụ: Một Oligo-DT primed RT phải có một xét nghiệm qPCR trong chuỗi 3 1 kb).
  
• Kiểm tra thiết kế xét nghiệm.
  
• Kiểm tra tất cả các điều khiển.
  
• Kiểm tra mồi bằng cách sử dụng thuốc nhuộm I/gel màu xanh lá cây SYBR.
  
• Đảm bảo cài đặt phần mềm chính xác (đường cơ sở, phát hiện thuốc nhuộm, nồng độ cho tiêu chuẩn).
  
• Đảm bảo nồng độ ROX áp dụng cho thiết bị (và không can thiệp vào đa nhân).
  
• Kiểm tra mức độ huỳnh quang nền.
  
• Kiểm tra nhãn đầu dò bằng xét nghiệm DNase I hoặc lặp lại quá trình tổng hợp đầu dò.