[Direkt zum Inhalt](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de) Produkte Warenkorb0 ATDE Produkte ProdukteAnwendungenDienstleistungenRessourcenUnterstützung [Anmelden / Registrieren](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Bestellungssuche](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/order-lookup) [Schnelleinkauf](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/quick-order) Warenkorb0 [Startseite](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/applications/genomics/qpcr)Protokoll für die Auswahl des qPCR-Referenzgens # Protokoll für die Auswahl des qPCR-Referenzgens ## [PCR-Technologien Protokolle Inhaltsverzeichnis](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction) ## Optimierung der qPCR-Bedingungen Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen. [](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/W1754)[](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/W1754) Die Analyse von Genexpressionsdaten erfordert eine stabile Referenz- oder Ladekontrolle. Diese Referenz besteht in der Regel aus einem oder mehreren Referenzgenen. Geeignete Referenzgene sind Gene, die von Abweichungen zwischen den Proben und experimentellen Behandlungen nicht beeinflusst werden. Sie müssen für jedes experimentelle Modell bestimmt werden. Bei der Durchführung eines Versuchs zur Auswahl stabiler Referenzgene ist es von entscheidender Bedeutung, dass die ausgewählten Gene von verschiedenen biologischen Signalwegen stammen und dass ihre Expression unabhängig voneinander reguliert wird. Idealerweise werden alle Referenzgenkandidaten an einer Auswahl von fünf Test- und fünf Kontrollproben getestet.  ## Ausrüstung - Gerät für die quantitative PCR - Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional) ## Reagenzien - cDNA im Verhältnis 1:100 verdünnt (die stärker verdünnte cDNA reicht in der Regel aus, um hoch exprimierte Referenzgene nachzuweisen, für mittelstark exprimierte Gene wird eine Verdünnung von 1:10 eingesetzt). - KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ ([KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS03) - abhängig vom Instrument, __Tabelle P4-6__). - Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden. - Vorwärts- und Rückwärtsprimer für Testreferenzgene (Stammlösung bei 10 μM). *__Hinweis:__* Eine geeignete Liste von Genen ist in __Tabelle P15-37__ enthalten. Diese sind als [KiCqStart® Primer](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KSPQ12012) erhältlich, bei denen es sich, wie dargestellt, um vorgefertigte Assays handelt (die Sequenzen der Primer sind im Lieferumfang des Produkts enthalten). Hot Start ReadyMixes (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, [Art.-Nr. KCQS00](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS00)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , [Art.-Nr. KCQS01](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS01)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX, [Art.-Nr. KCQS02](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS02)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ, [Art.-Nr. KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KCQS03) __Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:____Kompatible Geräte:__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700  Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900  Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast  Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT  Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s    Illumina Eco qPCR    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q    Roche LightCycler® 480    Tabelle P17-42Auswahlhilfe für SYBR® Green PCR-Mix. ## Materialien[](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step)[](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step) - Sterile Filter-[Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/CLS430909) - PCR-Röhrchen und -Platten. Eins auswählen, um das gewünschte Format zu erhalten: • Einzelne dünnwandige 200 μl PCR-Röhrchen (Z374873 oder [P3114](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/P3114)) •    Platten \- [96-Well-Platten (Z374903)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z374903)       - [384-Well-Platten (Z374911)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z374911) •    Plattendichtungen \- [ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z734438)       - [ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/Z722553) #### Anmerkungen zu diesem Protokoll - cDNA wird mit dem ReadyScript® RT-Kit erzeugt, das eine Kombination aus Zufalls- und Oligo-dT-Priming enthält (siehe [Standardprotokoll für reverse Transkription (zweistufig)](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step) und [Reverse Transkription](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription)). - Wenn Sie eine PCR-Platte verwenden, folgen Sie einem Plattenschema, um sicherzustellen, dass die Reaktionsmischung, die Proben und die Kontrollen in die richtigen Wells gegeben werden. - Testen Sie eine breite Palette von Genen, die als Referenzgene in Frage kommen. Diese sollen in verschiedenen funktionellen Genpfaden exprimiert werden. Eine Auswahl möglicher  [KiCqStart® SYBR® Primer](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/product/sigma/KSPQ12012) für einige Modellorganismen ist in __Tabelle P15-37__ aufgeführt. OligoArchitect ist ein geeignetes Designwerkzeug für alternative Primerdesigns (siehe [OligoArchitect™ Assay-Design](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/oligoarchitect-assay-design) und [PCR/qPCR/dPCR Assay-Design](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design)). | | | | | |-------------|--------------|--------------|--------------| | Referenzgen | Maus | Mensch | Ratte | | CANX | M\_Canx\_1 | H\_CANX\_1 | R\_Canx\_1 | | HPRT1 | keine Angabe | H\_HPRT1\_1 | R\_Hprt1\_1 | | PGK1 | M\_Pgk1\_1 | H\_PGK1\_1 | R\_Pgk1\_1 | | TBP | M\_Tbp\_1 | H\_TBP\_1 | R\_Tbp\_1 | | YWHAZ | M\_Ywhaz\_1 | H\_YWHAZ\_1 | R\_Ywhaz\_1 | | ATP5B | M\_Atp5b\_1 | H\_ATP5B\_1 | R\_Atp5b\_1 | | SDHA | M\_Sdha\_1 | H\_SDHA\_1 | R\_Sdha\_1 | | TUBB2B | keine Angabe | H\_TUBB2B\_1 | R\_Tubb2b\_1 | | UBC | M\_Ubc\_1 | H\_UBC\_1 | R\_Ubc\_1 | | PPIA | keine Angabe | H\_PPIA\_1 | R\_Ppia\_1 | | GUSB | M\_Gusb\_1 | H\_GUSB\_1 | R\_Gusb\_1 | | GAPDH | keine Angabe | H\_GAPDH\_1 | keine Angabe | | TUBA1A | keine Angabe | H\_TUBA1A\_1 | R\_Tuba1a\_1 | | ACTB | M\_Actb\_1 | H\_ACTB\_1 | R\_Actb\_1 | Tabelle P15-37Potenzielle Referenzgen-Kandidaten und KiCqStart® Produktcodes [(KSPQ12012).](https://www.sigmaaldrich.com/product/sigma/KSPQ12012) ## Methode 1.    Berechnen Sie die Anzahl der __für jedes Referenzgen__ erforderlichen Reaktionen. Bereiten Sie eine ausreichende Mischung für zwei Reaktionen pro Probe vor. Wenn beispielsweise 5 Test- und 5 Kontrollproben geprüft werden, ergeben sich zwei Negativkontrollen (NTC) = 22 Reaktionen. Berechnen Sie einen Zuschlag von 10 %, um Pipettierfehler auszugleichen. 2.    Bereiten Sie den qPCR-Mastermix für jedes Referenzgen-Primerpaar gemäß __Tabelle P15-38 vor. Geben Sie keine__ cDNA in den Mastermix. Gut mischen und Blasenbildung vermeiden. | | | |------------------------------------------|---------------------------------------| | Reagenzien | Volumen (μl) pro 20 μl Einzelreaktion | | 2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR-ReadyMix™ | 10 | | Vorwärtsprimer (10 μM) | 0,9 | | Rückwärtsprimer (10 μM) | 0,9 | | Wasser in PCR-Qualität | 3,2 | Tabelle P15-38qPCR-Mastermix für die Auswahl von Referenzgenen. 3.    15 μl des Mastermix in die definierten Röhrchen/Wells geben. 4.    5 μl des entsprechenden Templates (Probe oder Wasser für NTC) in die definierten Röhrchen/Vertiefungen geben. 5.    Röhrchen verschließen oder Platten versiegeln und beschriften. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt) 6.    Die Reaktionen nach dem folgenden dreistufigen Protokoll durchführen (__Tabelle P15-39__). Die Schritte 1-3 werden in 40 Zyklen wiederholt. 7.    [Datenanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/data-analysis), um die Daten zu analysieren und das stabilste Referenzgen oder die stabilste Genkombination zu bestimmen. | | | | |-----------------------------------------------|------------|----------| | Zyklusbedingungen | Temp. (ºC) | Zeit (s) | | Anfängliche Denaturierung/Hot Start | 95 | 30 | | __Wiederholen der Schritte 1-3 in 40 Zyklen__ | | | | Schritt 1 | 95 | 5 | | Schritt 2 | 58 | 10 | | Schritt 3 | 72 | 15 | Tabelle P15-39PCR-Zyklusbedingungen für die Auswahl von Referenzgenen. __*Hinweis:*__ Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung). ## Materialien Bitte entschuldigen Sie, es ist ein unerwarteter Fehler aufgetreten Response not successful: Received status code 500 __Zugehörige Artikel__ - [MystiCq® MicroRNA® Quantifikationssystem](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/gene-expression-and-silencing/mysticq-microrna-analysis) - [Protokoll zur Konjugation von NHS-Estermodifikationen an Amino-markierte Oligonukleotide](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/pcr/nhs-ester-oligonucleotide-conjugation) - [ChIP-qPCR- und Datenanalyse](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/qpcr/chip-qpcr-data-analysis) - [Protokoll zur Optimierung der Primerkonzentration](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/qpcr/primer-concentration-optimization) - [Protokolle für die Primer-Optimierung mit Temperaturgradient](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/qpcr/primer-optimization-using-temperature-gradient) - [Protokoll zur Bestimmung der qPCR-Effizienz](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/qpcr/qpcr-efficiency-determination) - [Grundlagen der Fehlerbehebung für die RT-qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/qpcr/rt-qpcr) - [Universelles SYBR-Grün qPCR-Protokoll](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/genomics/qpcr/sybr-green-qpcr) - [Mehr anzeigen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Zugehörige Produktkategorien__ - [Dichtungsfilme, -folien und -klebebänder](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Pipettenspitzen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [Analytische Methode: Aluminium (gesamt) in Abwasser](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/aluminium-total-in-effluents) - [Analytische Methode: Aluminium (gesamt) in Abwasser, hoher organischer Gehalt](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/aluminium-total-in-effluents-high-organic-content) - [Analytische Methode: Aluminium (gesamt) in Kalkstein](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/aluminium-total-in-lime-stone) - [Ammonium in Abwasser](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/ammonium-in-effluents) - [Analytische Methode: Analytische Qualitätssicherung, Standard für Chlordioxid](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/analytical-quality-assurance-standard-for-chlorine-dioxide) - [Analytische Methode: Analytische Qualitätssicherung, Standard für Formaldehyd](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry/analytical-quality-assurance-standard-for-formaldehyde) - [Mehr anzeigen](https://www.sigmaaldrich.com/AT/de/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) Oben __Melden Sie sich an, um fortzufahren.__ Um weiterzulesen, melden Sie sich bitte an oder erstellen ein Konto. 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