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Assay Considerations
Metodi di quantificazione
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Guida alla selezione della miscela di PCR
Protocollo
Troubleshooting
Materiali
Referenze
Sintesi della tecnologia: SYBR Green qPCR
Con lo sviluppo di termociclatori che incorporano la rilevazione fluorescente, la PCR ha trovato un'applicazione nuova e innovativa. Nella PCR di routine, il risultato critico è la quantità finale di ampliconi generati dopo il processo. La PCR in tempo reale o quantitativa e la RT-PCR utilizzano la linearità dell'amplificazione del DNA per determinare le quantità assolute o relative di una sequenza nota in un campione. Utilizzando un reporter fluorescente nella reazione, è possibile misurare la generazione di DNA.
Figura 1.Panoramica della tecnologia: SYBR Green qPCR
Nella PCR quantitativa, l'amplificazione del DNA viene monitorata ad ogni ciclo di PCR. Quando il DNA si trova nella fase lineare dell'amplificazione, la quantità di fluorescenza aumenta oltre il fondo. Il punto in cui la fluorescenza diventa misurabile è chiamato ciclo di quantificazione (Cq) o punto di passaggio. Utilizzando diluizioni multiple di una quantità nota di DNA standard, è possibile generare una curva standard di concentrazione log contro Cq. La quantità di DNA o cDNA in un campione sconosciuto può quindi essere calcolata in base al suo valore di Cq .
A) Le diverse fasi della reazione:
Baseline: La concentrazione iniziale di templato è bassa; pertanto, l'intensità della fluorescenza è troppo bassa per essere rilevata ed è evidente solo il segnale di fondo.
Esponenziale: Dopo che la resa del target ha raggiunto la soglia di rilevazione, indicata dalla linea rossa di soglia, il corso della reazione può essere seguito attraverso la fase esponenziale.
Lineare: Man mano che la concentrazione di templato aumenta, la concentrazione di DNA polimerasi disponibile si riduce e la velocità di reazione diminuisce.
Plateau: L'enzima libero non è sufficiente per continuare l'amplificazione e quindi, dopo questo punto, la reazione raggiunge la resa massima, o la fase di plateau.
B) Le singole reazioni sono caratterizzate dal ciclo in cui la fluorescenza sale per la prima volta sopra la soglia, definito ciclo di quantificazione (Cq). Se il materiale di partenza è abbondante, l'amplificazione si osserva nei primi cicli e il Cq è più basso. Se il materiale di partenza è scarso, l'amplificazione si osserva nei cicli successivi e il Cq è più alto. Questa correlazione tra fluorescenza, Cq e quantità di prodotto amplificato consente di quantificare il templato in un ampio intervallo dinamico.
La PCR in tempo reale si presta anche a studi relativi. Una reazione può essere eseguita utilizzando primer unici per ogni regione da amplificare e taggati con diversi coloranti fluorescenti. Diversi termociclatori quantitativi disponibili in commercio includono canali di rilevazione multipli. In questo sistema multiplex, la quantità di DNA/cDNA target può essere confrontata con la quantità di una sequenza housekeeping, ad esempio GAPDH o β-actina.
| Applicazioni di qPCR in verde SYBR | |
|---|---|
| Mass Screening | XX |
| Microarray Validation | XX |
| Multipli geni target/pochi campioni | X |
| Rilevazione SNP | NR |
| Discriminazione allelica | NR |
| Rilevazione di patogeni | X |
| Multiplexing | NR |
| Quantificazione del carico virale | NR |
| Analisi dell'espressione genica | X |
| Determinazione della copia genica | NR |
| Genotipizzazione del punto finale | NR |
| quantificazione in vitro | NR |
NR= non consigliato
X= consigliato
XX= metodo preferito
Considerazioni sul test
Preparazione del DNA
Il passo più importante per garantire il successo della PCR è una preparazione del DNA di alta qualità. L'integrità e la purezza del DNA sono essenziali. La PCR quantitativa comporta più cicli di reazioni enzimatiche ed è quindi più sensibile a impurità come proteine, fenolo/cloroformio, sali, EDTA e altri solventi chimici. I contaminanti possono anche interferire con la rilevazione della fluorescenza. Il rapporto dei valori di assorbanza a 260 nM e 280 nM fornisce una stima della purezza del DNA. Il DNA puro ha un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0. Rapporti inferiori indicano la presenza di contaminanti come le proteine.
Template
Per avviare la qPCR sono necessarie pochissime copie di acido nucleico target (equivalenti a circa 100 pg di gDNA o cDNA). Per ridurre al minimo la contaminazione con inibitori di reazione, la quantità di templato di partenza deve essere mantenuta al minimo necessario per ottenere una quantificazione accurata. Quando il materiale di partenza è l'RNA, la progettazione del primer e il trattamento con DNase I ridurranno i segnali che possono essere generati dalla contaminazione del gDNA.
Primer Design
Sia che si utilizzi un colorante che lega il dsDNA, sia che si utilizzi una chimica di rilevamento basata su sonde, la progettazione di primer di alta qualità è una delle fasi pre-sperimentali più cruciali della qPCR. I primer specifici per la PCR devono essere progettati con l'ausilio di un software di primer design per eliminare le complicazioni introdotte dai primer-dimeri e dalle strutture secondarie. Concentrazioni più basse di primer riducono l'accumulo di primer-dimeri e la formazione di prodotti non specifici, che è fondamentale nell'uso del colorante SYBR Green I nella PCR quantitativa.
dNTPs
Le mastermix standard per PCR/qPCR contengono dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Tuttavia, sono disponibili alcune miscele che sostituiscono il dTTP con il dUTP. I prodotti di reazioni precedenti eseguite con dUTP conterranno uracile invece di timina. Questi sono quindi suscettibili di scissione da parte dell'Uracile-DNA-Glicosilasi (UNG). Pertanto, l'incubazione preventiva delle reazioni successive con UNG impedisce la contaminazione da carry-over tra le reazioni. Per essere efficaci, tutte le reazioni in laboratorio devono utilizzare il dUTP.
Concentrazione di magnesio
Il cloruro di magnesio (MgCl2) è necessario per l'attività della trascrittasi inversa, della Taq DNA polimerasi e dell'esonucleasi Taq DNA 5' - 3'. Le concentrazioni ottimali di Mg2+ per le reazioni contenenti DLP sono solitamente comprese tra 3 e 6 mM. Concentrazioni più basse di cloruro di magnesio determinano di solito la formazione di un minor numero di prodotti aspecifici. Alcune soluzioni ReadyMix sono fornite con una concentrazione 2X di 7 mM di cloruro di magnesio (concentrazione finale 3,5 mM). In alcuni casi, viene fornita una fiala di soluzione di cloruro di magnesio 25 mM per ottimizzare ulteriormente la concentrazione finale di cloruro di magnesio, se necessario. A volte può essere necessaria una miscela di reazione che non contenga MgCl2 in modo da poter utilizzare una bassa concentrazione, ad esempio quando si utilizza il rilevamento della sonda Scorpion.
Trascrittasi inversa
Un enzima di trascrittasi inversa che fornisca elevate rese di cDNA, mantenendo l'attività ad alta temperatura, è fondamentale per il successo della RT-qPCR. Le prestazioni ad alta temperatura contribuiscono a garantire che le regioni di RNA con una struttura secondaria significativa siano destabilizzate e accessibili per l'ibridazione e la successiva amplificazione. Quando si esegue la RT-qPCR in un solo passaggio, le prestazioni ad alta temperatura consentono l'uso di primer specifici per il gene con temperature di fusione elevate (Tm), che aumentano la specificità della reazione. Quando si eseguono protocolli a due fasi, è importante garantire che l'enzima produca una resa lineare e proporzionale di cDNA dall'RNA. Ridurre al minimo il pipettaggio può diminuire la variabilità. Alcune ReadyMix contengono primer e altri reagenti necessari per eseguire la RT, ad esempio ReadyScript® cDNA Synthesis Mix (RDRT).
Taq DNA Polymerase
Come per la selezione della trascrittasi inversa più appropriata per la RT, la selezione dell'enzima appropriato è fondamentale. Un problema fondamentale della Taq DNA polimerasi naturale è che l'enzima ha un'attività residua a bassa temperatura. Il legame non specifico del primer porta alla formazione di un prodotto non specifico come risultato dell'attività residua della polimerasi. Le Taq DNA polimerasi bloccate da anticorpi o chimicamente ("hot-start") aiutano a correggere questa situazione impedendo l'attività dell'enzima fino all'inizio della fase di denaturazione ad alta temperatura. Fare riferimento alla PCR Mix Selection Guide per definire la migliore polimerasi hot-start per la propria applicazione.
Dye di riferimento interno per tipo di strumento
Alcuni termociclatori per PCR in tempo reale richiedono un colorante di carico come ROX per controllare la variabilità del sistema ottico e normalizzare le differenze di intensità del segnale. Allo stesso modo, alcuni termociclatori richiedono la fluoresceina per creare uno sfondo virtuale quando si lavora con i dosaggi con colorante SYBR Green I (che hanno uno sfondo molto basso). Questi possono essere forniti nella ReadyMix o come componenti separati, in modo da poter utilizzare la concentrazione appropriata. In alcuni casi, è inclusa una fiala di colorante di riferimento interno per la normalizzazione della reazione. L'eccitazione massima di questo colorante è di 586 nM e l'emissione massima di 605 nM. Le impostazioni standard dello strumento per il colorante di riferimento ROX sono soddisfacenti per la misurazione del colorante di riferimento interno. Questo colorante di riferimento interno è necessario per i sistemi di rilevamento delle sequenze ABI.
Strumenti
È necessario selezionare i reagenti compatibili con gli strumenti. Le piattaforme utilizzano coloranti di normalizzazione diversi, pertanto è necessario selezionare reagenti con coloranti di normalizzazione compatibili (fare riferimento a Appendice 1).
Molti strumenti qPCR sono stati progettati per supportare una gamma specifica di applicazioni, ad esempio contrapponendo la capacità di alta produttività di ABI 7900 che utilizza il caricamento automatico di piastre da 384 pozzetti allo strumento Illumina Eco che supporta una singola piastra da 48 pozzetti. Lo strumento più adatto risponde alle esigenze della ricerca. È auspicabile scegliere uno strumento con un software di facile utilizzo che svolga le funzioni più desiderate e che sia flessibile in termini di output dei dati, in modo da poterli manipolare facilmente nei pacchetti software di analisi statistica a valle. In questo modo si riduce il tempo necessario per la formazione del personale e quindi per la generazione dei risultati. Altre caratteristiche richieste sono un blocco PCR assolutamente uniforme (deviazione massima assoluta di 1Cq = 2 volte su 96 pozzetti di replicazione) e un sistema ottico che eccita e rileva l'emissione nel modo più sensibile e uniforme possibile su un'ampia gamma di lunghezze d'onda. Ciò consente un'ampia scelta di fluorofori e permette il multiplexing. Altre caratteristiche da considerare sono i costi operativi associati a materiali di consumo specifici, ad esempio se non si utilizza una piastra per microtitolazione standard per le reazioni e anche la convenienza di caricare piastre/tubi di formato non standard.
Controlli
Un controllo positivo è sempre utile per assicurarsi che tutti i componenti del kit funzionino correttamente. Un controllo no template/negativo è necessario per determinare l'eventuale presenza di contaminazione. Un segnale nel controllo senza templato dimostra la presenza di una contaminazione del DNA o la formazione di un dimero del primer.
Buffer
I buffer o le mastermix di reazione contengono tipicamente dNTP, una Taq DNA polimerasi, MgCl2 e stabilizzatori. Possono essere inclusi anche SYBR Green I, ROX™, fluoresceina e coloranti di caricamento inerti, a seconda dei requisiti della chimica di rilevazione, dello strumento e della reazione. I componenti del tampone PCR e gli stabilizzatori sono in genere di proprietà del produttore. Se acquistati separatamente, è possibile ottenere la massima flessibilità, poiché ogni ingrediente può essere ottimizzato individualmente nella reazione. Tuttavia, se da un lato l'acquisto degli ingredienti insieme come mastermix riduce la flessibilità, dall'altro aumenta la consistenza del lotto e la convenienza, riducendo il numero di passaggi di pipettaggio e, di conseguenza, le possibilità di errore e contaminazione.
Analisi dei dati
Seguire le raccomandazioni dello strumento in tempo reale utilizzato per eseguire la SYBR Green PCR quantitativa. Quanto segue può aiutare i nuovi utilizzatori dello strumento. In generale, il numero di cicli viene tracciato rispetto alla fluorescenza. I cicli di soglia (CTs) o i punti di incrocio sono utilizzati per determinare la quantità di templato in ciascun campione. Il ciclo di soglia o punto di incrocio è il primo ciclo che mostra un aumento rilevabile della fluorescenza dovuto alla formazione di prodotti di PCR. I cicli precedenti al punto di attraversamento sono i cicli di base. I cicli di base non mostrano un aumento rilevabile della fluorescenza dovuto ai prodotti di PCR. La soglia utilizzata per determinare quando si verifica il primo aumento rilevabile della fluorescenza può anche essere regolata manualmente. La soglia deve sempre essere effettuata su un grafico di amplificazione logaritmica. In un grafico di amplificazione logaritmica, la soglia deve essere impostata nell'intervallo log-lineare e non nella fase di plateau.
Curve di fusione
Eseguire un'analisi della curva di fusione alla fine della corsa aiuterà ad analizzare solo il prodotto PCR di interesse. Seguire le istruzioni del produttore dello strumento in tempo reale per l'analisi della curva di melting. Le corse successive con gli stessi primer possono essere modificate per rimuovere il contributo della formazione del dimero del primer al segnale del prodotto raccogliendo i dati in una fase di ciclaggio aggiuntiva, la cui temperatura deve essere compresa tra le temperature di fusione del dimero e del prodotto già determinate (TMs).
Metodi di quantificazione
Curve standard
Le curve standard sono necessarie per la quantificazione sia assoluta che relativa. Quando si generano le curve standard, si devono usare diverse concentrazioni di DNA (in genere cinque) per generare una curva standard che sia di supporto alla concentrazione dell'incognita. Ogni concentrazione deve essere eseguita in duplicato.
Quantificazione assoluta e relativa
Questo kit SYBR Green PCR può essere utilizzato per quantificare il DNA target utilizzando la quantificazione assoluta o relativa. Le tecniche di quantificazione assoluta sono utilizzate per determinare la quantità di DNA target nel campione iniziale, mentre la quantificazione relativa determina il rapporto tra la quantità di DNA target e un amplicone di riferimento. L'amplicone di riferimento ideale avrebbe un'espressione invariante e costitutiva. In pratica, per questa funzione si sceglie un gene housekeeping, ma esistono altre scelte di riferimento che aderiscono meglio ai requisiti di cui sopra.1
La quantificazione assoluta utilizza standard esterni per determinare la quantità assoluta di acido nucleico target di interesse. Per eliminare le differenze di quantificazione dovute all'annealing, i siti di legame dei primer degli standard esterni devono essere uguali a quelli della sequenza target. Lo standard esterno ideale contiene sequenze che sono uguali alla sequenza target o che variano solo leggermente dalla sequenza target. Per la quantificazione assoluta sono necessarie efficienze di amplificazione equivalenti tra il target e lo standard esterno. Una volta identificato il costrutto o l'amplicone adatto, viene generata una curva standard di diluizioni dello standard esterno che viene utilizzata per determinare le concentrazioni dei campioni target sconosciuti.
La quantificazione relativa consente di calcolare il rapporto tra la quantità di template target e un template di riferimento in un campione. Poiché questo metodo misura la quantità di target rispetto a un controllo presumibilmente invariante, la qPCR relativa è molto spesso utilizzata per misurare le differenze di polimorfismo genetico, ad esempio tra tessuti o tra campioni sani e malati. Il vantaggio di questa tecnica è che l'uso di uno standard interno può ridurre al minimo le variazioni nella preparazione e nella manipolazione dei campioni. Quando si utilizzano sistemi SYBR, la quantificazione del target e del riferimento interno devono essere eseguiti in reazioni separate.
L'accuratezza della quantificazione relativa dipende dalla scelta appropriata di un modello di riferimento per gli standard. La variabilità dello standard influenzerà i risultati e quindi è molto importante che gli standard siano appropriati.1 Alcuni ricercatori scelgono di non eseguire una curva standard e di riportare le quantità del target come frazione del riferimento, una tecnica definita quantificazione comparativa. In alternativa, si può assumere che le efficienze di amplificazione del target e del riferimento siano trascurabili e quantificare il target basandosi esclusivamente sulla curva standard determinata per la sequenza di riferimento. Infine, nella più accurata delle tecniche di quantificazione relativa, si misurano le efficienze di amplificazione del riferimento e del target e si determina un fattore di correzione. Questo processo, definito normalizzazione,1 richiede un campione contenente concentrazioni note sia del target che del riferimento e la generazione di due curve standard.
Determinazione delle efficienze di reazione PCR
L'efficienza PCR tra un campione di riferimento e un campione target viene determinata preparando una serie di diluizioni per ciascun target. I valori di CT del riferimento vengono sottratti dal target e la differenza dei valori di CT viene tracciata rispetto al logaritmo della quantità di templato. Se la pendenza risultante della linea retta è inferiore a ± 0,1, le efficienze di amplificazione sono giudicate simili.
Equipaggiamento
- Strumento di PCR quantitativa
- Microcentrifuga
- Cappuccia a flusso laminare per l'allestimento della PCR (opzionale)
Forniture
- qPCR SYBR Green Mix - Fare riferimento alle guide alla selezione qPCR (Parte 1 e Parte 2)
- Modello di DNA/cDNA- reazione di cDNA diluita 1:10 per rilevare target mediamente o altamente espressi o da 1:2 a 1. 5 per trascritti rari o 10: 1:2 a 1. 5 per trascritti rari:5 per i trascritti rari o da 10 ng a 100 ng di gDNA
- Primers forward e reverse diluiti alla concentrazione di lavoro (stock di lavoro da 10µM sono sufficienti per la maggior parte dei saggi)
- Predisposizione di primer e di primer per la reazione di cDNA diluiti a 1: 10 per rilevare target mediamente o altamente espressi.ul>
- Per la maggior parte degli organismi modello sono disponibili anche primer per l'espressione genica (KiCqStart® SYBR® Green Primers, KSPQ12012)
| Miscele pronte complete con Hot Start (Taq, tampone, dNTP, colorante di riferimento, MgCl2) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Strumenti compatibili: Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad MiniOpticon™ BioRad MyiQ™ Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Roche LightCycler™ 480 | Strumenti compatibili: Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems ViiA 7 Stratagene Mx3000P® Stratagene Mx3005P™ Stratagene Mx4000™ | Strumenti compatibili: Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast< Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™ | Strumenti compatibili: BioRad iCycler iQ™ BioRad iQ™5 BioRad MyiQ™ | Strumenti compatibili: Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™ | Strumenti compatibili: Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad MiniOpticon™ Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler™ 480 |
| KiCqStart®® Green qPCR ReadyMix™ (KCQS00) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (KCQS01) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ con ROX (KCQS02) | KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ per iQ (KCQS03) | SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ per qPCR ad alta produttività (S9194) | SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ per la PCR quantitativa, formulazione capillare (S1816) |
| ReadyMix con Hot Start e componenti separati | ||
|---|---|---|
| Tintura di riferimento separata | MgCl2 separato Colorante di riferimento separato | |
| Strumenti compatibili: Fare riferimento a Appendice 1 per cercare la concentrazione ottimale del colorante di riferimento per il proprio strumento | ||
| SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ ().S4438) | LuminoCt®SYBR®Green qPCR ReadyMix™ (L6544) | SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (S5193) |
Protocollo
Preparazione
- Porre tutti i componenti della reazione su ghiaccio.
- Miscelare e poi centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta.
Reazione standard con colorante SYBR Green I
Nota: Abbiamo osservato che i test eseguiti con KiCqStart ReadyMix sono ottimali quando si utilizza una concentrazione di primer più elevata rispetto alla PCR convenzionale. Nei protocolli che seguono, utilizziamo una concentrazione finale di 450 nM, che abbiamo osservato essere la concentrazione ottimale per diversi test indipendenti.
1. Preparare una quantità di master mix sufficiente per eseguire tutti i test. Preparare una quantità di master mix sufficiente per eseguire tutti i campioni in duplicato.
a. Assicurarsi di includere controlli negativi senza modello (NTC) in duplicato.
b. Selezionare la tabella appropriata in base al reagente qPCR selezionato.
c. Calcolare la quantità di reagenti da miscelare. Aggiungere il 10% di volume per tenere conto degli errori di pipettaggio
d. Mescolare bene, evitando la formazione di bolle. Mescolare bene, evitando la formazione di bolle.
Master Mix per i reagenti KiCqStart:
| Reazioni | Concentrazione finale del target | Volume per singola reazione da 20 μL (µL) |
|---|---|---|
| 2X qPCR mix | 1X | 10 μL |
| Forward primer (10 µM stock) | 0.45 µM | 0.9 μL |
| Reverse primer (10 µM stock) | 0,45 µM | 0.9 μL |
| Acqua di gradoPCR | - | 3.2 μL |
Master Mix per altre miscele pronte qPCR complete:
| Reazioni | Concentrazione finale del target | Volume per singola reazione da 20 μL (µL) |
|---|---|---|
| 2X qPCR mix | 1X | 10 μL |
| Forward primer (10 µM stock) | 0.2 µM | 0.4 μL |
| 0,2 µM | 0.4 μL | |
| Acqua di gradoPCR | - | 4,2 μL |
Master Mix per i reagenti qPCR con componenti separati:
| Reazioni | Concentrazione finale del target | Volume per singola reazione da 20 μL (µL) |
|---|---|---|
| 2X qPCR mix | 1X | 10 μL |
| Forward primer (10 µM stock) | 0.2 µM | 0,4 μL |
| Reverse primer (10 µM stock) | 0.2 µM | 0.4 μL |
| 3,5mM | 3.5 μL1 | |
| Tintura di riferimento (se separata) | da0a0.25 μL2 | |
| Acqua di gradoPCR | 4.2 μL |
1La concentrazione ottimale di MgCl2 può variare da 1mM a 6mM.
2Fare riferimento a Appendice 1 per determinare la concentrazione ottimale del colorante di riferimento per il proprio strumento.
2. Impostare le reazioni:
a. Per le reazioni NTC, aggiungere 4 μL di acqua alla provetta di reazione.
b. Per le reazioni sperimentali, aggiungere 4 μL di soluzione di cDNA alla provetta di reazione.
c. Centrifugare brevemente tutte le provette. Verificare visivamente che tutte le provette o i pozzetti contengano il campione sul fondo nel volume corretto.
d. Alimentare accuratamente 16 μL di master mix di template in ciascuna provetta o pozzetto di piastra qPCR.
e. Mescolare bene le reazioni e centrifugare se necessario.
f. Tappare le provette o sigillare la piastra PCR ed etichettare (secondo i requisiti dello strumento). (Assicurarsi che l'etichettatura non oscuri il percorso della luce di eccitazione/rilevazione dello strumento.)
3. Eseguire i campioni secondo le raccomandazioni del produttore dello strumento. Eseguire i campioni secondo le raccomandazioni del produttore dello strumento. Di seguito sono riportati esempi di cicli standard e veloci.
Parametri di ciclo standard:
| Temp | Time | |
|---|---|---|
| Denaturazione iniziale | 94 °C | 2 min |
| 40 cicli: | ||
| Denaturazione | 94 °C | 15 sec |
| Annealing, estensione, e lettura della fluorescenza | 60 °C o 5 °C sotto la più bassa T del primerM | 1 min |
| (Opzionale) Hold | 4 °C solo se i prodotti verranno esauriti su un gel | |
Parametri del ciclismo veloce:
| Temp (ºC) | Tempo (s) | |
|---|---|---|
| Denaturazione iniziale | 95 | 30 |
| 40 cicli: | ||
| Fase 1 | 95 | 5 |
| Fase 2 | 58 | 15 |
| Fase 3 | 72 | 10 |
Nota: Utilizzare il protocollo standard della curva di dissociazione (raccolta dati).
4. Fare riferimento al manuale dello strumento per le indicazioni su come analizzare i dati.
4. Fare riferimento al manuale dello strumento per indicazioni su come analizzare i dati.
Appendice 1
Concentrazioni di colorante di riferimento raccomandate per l'uso con gli strumenti. Per i reagenti qPCR con un colorante di riferimento separato
| Strumento | Concentrazione finale del colorante di riferimento | µL di colorante di riferimento (per 20µL di reazione) |
|---|---|---|
| Applied Biosystems 5700 | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems 7000 | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems 7300 | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems 7500 | 0.1X | 0.02µL |
| Applied Biosystems 7500 Fast | 0.1X | 0.02µL |
| Applied Biosystems 7700 | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems 7900 | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems 7900 HT Fast | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems 7900HT | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems StepOnePlus™ | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems StepOne™ | 1X | 0.2µL |
| Applied Biosystems ViiA 7 | 0,1X | 0.2µL |
| Bibby Scientific Techne®Prime Pro 48 | non usato | - |
| Bibby Scientific PCRmax® Eco 48 | non utilizzato | - |
| Bio-Rad CFX384™ | non utilizzato | - |
| Bio-Rad CFX96™ | non usato | - |
| Bio-Rad MiniOpticon™ | non utilizzato | - |
| Bio-Rad/MJ Chromo4™ | non usato | - |
| Bio-Rad/MJ Opticon 2 | non utilizzato | - |
| Bio-Rad/MJ Opticon® | non utilizzato | - |
| Cepheid SmartCycler® | non usato | - |
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex | non utilizzato | - |
| Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s | non usato | - |
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 | non utilizzato | -< |
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 | non utilizzato | - |
| Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q | non usato< | - |
| Roche LightCycler™ 480 | non usato | - |
| Stratagene Mx3000P® | 0.1X | 0.02µL |
| Stratagene Mx3005P™ | 0,1X | 0.02µL |
| Stratagene Mx4000™ | 0.1X | 0,02µL |
Guida alla risoluzione dei problemi
| Problema | Possibile causa | Soluzione | |
|---|---|---|---|
| Non si osserva alcun prodotto PCR. | Un componente della PCR è mancante o degradato. | Si deve sempre eseguire un controllo positivo per assicurarsi che i componenti funzionino. Si raccomanda anche una lista di controllo quando si assemblano le reazioni. | |
| SYBR è degradato. | Eseguire un gel di agarosio per analizzare il prodotto della reazione. Se è evidente una singola banda di dimensioni adeguate, il rilevamento è difettoso. Il SBYR Green I è sensibile alla luce e deve essere protetto. | ||
| La temperatura di annealing è troppo alta. | Ridurre la temperatura di annealing con incrementi di 2-4 °C. | ||
| Il template è di scarsa qualità. | Valutare l'integrità del template mediante elettroforesi su gel di agarosio. Potrebbe essere necessario ripurificare il templato con metodi che riducano al minimo le rotture e le scalfitture. È possibile che non vi sia alcun templato a causa di una mancata estrazione o purificazione. | ||
| I primer non sono stati progettati in modo ottimale. | Controllare il set di primer eseguendo una serie di diluizioni su un templato noto. Riordinare o riprogettare se necessario. | ||
| La temperatura di denaturazione iniziale è troppo lunga. | Eliminare la fase di attivazione. JumpStart Taq può essere degradato con tempi di denaturazione iniziale lunghi (3 minuti). | ||
| Il template del target è complesso. | Nella maggior parte dei casi, i target intrinsecamente complessi sono dovuti a un contenuto di GC e/o a una struttura secondaria insolitamente elevati. È stato riferito che la betaina favorisce l'amplificazione di template ad alto contenuto di GC a una concentrazione di 0,8-1,3 M.2 | ||
| Il colorante di riferimento non è compatibile | Per i grafici Rn (fluorescenza normalizzata) spegnere il colorante di riferimento. In alternativa, visualizzare il grafico della fluorescenza grezza dell'amplificazione qPCR. La rimozione della normalizzazione spesso riporta i grafici alla forma prevista, consentendo il calcolo di valori Ct più ragionevoli. In alternativa, è possibile titolare il colorante di riferimento nella reazione. Vedere i suggerimenti nella sezione finale sulla risoluzione dei problemi. | ||
| Sono stati eseguiti troppi pochi cicli. | Aumentare il numero di cicli. | ||
| Non c'è abbastanza templato. | Dopo che l'aumento del numero di cicli non ha dato risultati, ripetere la reazione con una concentrazione di templato 10 volte superiore. | ||
| Il prodotto della PCR è troppo lungo. | I migliori risultati si ottengono quando i prodotti della PCR sono compresi tra 100-150 bp e non superano gli 800 bp. | ||
| La concentrazione di mg2+ è subottimale. | La concentrazione ottimale di cloruro di magnesio può variare in base al test e può variare da 1,5 a 5 mM. Utilizzare 25 mM MgCl2 (M8787) per eseguire una titolazione di cloruro di magnesio entro questo intervallo. | ||
| La rilevazione non è stata attivata o è stata attivata nella fase sbagliata. | Confermare che la modalità di acquisizione è attivata per una corretta rilevazione. La modalità di acquisizione per il rilevamento di SYBR Green è "singola" e viene raccolta nella fase di estensione o nella fase di rilevamento opzionale. | ||
| I primer sono degradati. | Verificare la degradazione del primer su un gel di poliacrilammide. | ||
| Scelta dello strato di colorante sbagliato. | Assicurarsi che il reporter utilizzato sia attivato nella vista di impostazione del software Sequence Detection. | ||
| Valori errati sull'asse Y | Modificare i valori sull'asse y. Facendo doppio clic su ΔRn è possibile modificare i valori dell'asse y. | ||
| L'efficienza della PCR è troppo bassa (<80%) | La temperatura di annealing è troppo bassa. | Aumentare la temperatura di annealing con incrementi di 2-3 °C. | |
| Il template contiene inibitori | Eseguire una curva standard (log [DNA] vs Cq). Se la curva non è lineare ad alte concentrazioni di DNA/cDNA, rivedere la purificazione del DNA/cDNA o limitare le concentrazioni di templato all'intervallo lineare. | ||
| I primer non sono stati progettati in modo ottimale. | Eseguire una curva di fusione o un gel di agarosio per verificare la presenza di ampliconi multipli. | ||
| Il templato è di scarsa qualità. | Valutare l'integrità del templato mediante elettroforesi su gel di agarosio. Potrebbe essere necessario ripurificare il templato con metodi che riducano al minimo il taglio e la scalfittura. | ||
| La temperatura di denaturazione iniziale è troppo lunga. | Eliminare la fase di attivazione. L'anticorpo Hot-Start Taq può essere degradato con tempi di denaturazione iniziale lunghi (3 min). | ||
| Molti loci ibridano con il set di primer. | Eseguire una curva di fusione o un gel di agarosio per verificare la presenza di ampliconi multipli. In alternativa, per un genoma target sequenziato, utilizzare il programma NCBI e-PCR alla ricerca di ampliconi multipli. | ||
| Gli errori di pipettaggio causano la fluttuazione | Preparare un grande volume di miscela completa e aliquotarlo in reazioni separate. Se la variazione persiste, vedere sotto. | ||
| Colorante di riferimento o concentrazione errata utilizzata per lo strumento | Fare riferimento a Appendice 1 per le concentrazioni di colorante di riferimento raccomandate per l'uso con gli strumenti. | ||
| Il colorante di riferimento non è compatibile | Per i grafici Rn (fluorescenza normalizzata) spegnere il colorante di riferimento. In alternativa, visualizzare il grafico della fluorescenza grezza dell'amplificazione qPCR. La rimozione della normalizzazione spesso riporta i grafici alla forma prevista, consentendo il calcolo di valori Ct più ragionevoli. Se si desidera la normalizzazione, la quantità ottimale di colorante di riferimento deve essere determinata mediante titolazione. | ||
| Il segnale è indipendente dalla diluizione del templato (prodotti multipli o prodotti spalmati) | La temperatura di annealing è troppo bassa. | Aumentare la temperatura di ricottura con incrementi di 2-3°C. | |
| I primer non sono stati progettati in modo ottimale. | Confermare l'accuratezza delle informazioni sulla sequenza. Se i primer sono lunghi meno di 27 nucleotidi, provare ad allungarli a 27-33 nucleotidi. Se il primer ha un contenuto di GC inferiore al 45%, provare a riprogettare i primer con un contenuto di GC del 45-60%. | ||
| La concentrazione del templato è troppo alta. | Ridurre la concentrazione del templato nella reazione di PCR. | ||
| La concentrazione del primer è troppo alta. | Ridurre le concentrazioni di primer in una serie di diluizioni di due volte (cioè 0,1 µM, 0,05 µM, 0,025 µM e 0,0125 µM) e sottoporre queste reazioni di prova alla PCR. | ||
| L'efficienza della PCR è troppo alta. | Molti loci ibridano con il set di primer. | Eseguire una curva di fusione o un gel di agarosio per verificare la presenza di ampliconi multipli. In alternativa, per un genoma target sequenziato, utilizzare il programma e-PCR dell'NCBI alla ricerca di ampliconi multipli. | |
| Le repliche tecniche restituiscono valori Ct molto diversi o i dati forniscono curve di amplificazione non inter-pretabili< | Errori di pipettaggio causano la fluttuazione | Preparare un grande volume di miscela completa e aliquotarlo in reazioni separate. Se la variazione persiste, vedere sotto. | |
| Colorante di riferimento o concentrazione errata utilizzata per lo strumento | Fare riferimento a Appendice 1 per le concentrazioni di colorante di riferimento raccomandate per l'uso con gli strumenti. | ||
| Grande variabilità all'interno dei campioni e/o dei duplicati. | Reazioni non ben miscelate. | Gentilmente agitare e centrifugare le reazioni. | |
| Piani non ben tappati o coperti. | Coprire saldamente tutti i pozzetti, anche quelli vuoti. I tappi allentati possono compromettere la tenuta dei pozzetti adiacenti. | ||
| La denaturazione iniziale è troppo lunga. | Ridurre la denaturazione iniziale per non superare i due minuti. | ||
| Prodotti PCR multipli | I primer non sono progettati in modo ottimale. | Confermare l'accuratezza delle informazioni sulla sequenza e la specificità della sequenza del primer rispetto alla sequenza non bersaglio. Aumentare la lunghezza dei primer per renderli più specifici per il target. | |
| I primer sono degradati. | Verificare la degradazione dei primer su un gel di poliacrilammide. | ||
| La concentrazione di mg2+ non è ottimale. | La concentrazione ottimale di cloruro di magnesio può variare in base al test e può variare da 1,5 a 5 mM. Utilizzare 25 mM MgCl2 (M8787) per eseguire una titolazione di cloruro di magnesio entro questo intervallo. | ||
| La temperatura di ricottura è troppo bassa. | Aumentare la temperatura di ricottura con incrementi di 2-3 °C. | ||
| Contaminazione del DNA | Controllare tutti i reagenti per verificare la possibile contaminazione e impostare le reazioni in una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione da altre reazioni. | ||
| Sono stati amplificati primer-dimeri | Includere la fase di rilevazione opzionale nel programma di ciclaggio per evitare la rilevazione di primer-dimeri. | ||
| La concentrazione del templato è troppo alta. | Ridurre la concentrazione del templato nella reazione di PCR. | ||
| La concentrazione del primer è troppo alta. | Ridurre le concentrazioni del primer in una serie di diluizioni di due volte (cioè 0.1 µM, 0.1 µM, 0.1 µM, 0.1 µM).0,1 µM, 0,05 µM, 0,025 µM e 0,0125 µM) e sottoporre queste reazioni di prova alla PCR. | ||
| I valori di linearità del punto di incrocio non corrispondono al log della quantità di templato | Quantità di templato troppo elevata. | Non superare le quantità massime raccomandate di DNA campione. | |
| Quantità di campione troppo bassa. | Aumentare la quantità di DNA. | ||
| Contaminazione del DNA | Controllare che tutti i reagenti non siano contaminati e impostare le reazioni in una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione incrociata. | ||
| Sono stati amplificati primer-dimeri | Includere la fase di rilevazione opzionale nel programma di ciclaggio per evitare la rilevazione di primer-dimeri. | ||
| La fluorescenza non viene rilevata o è variabile | SYBR Green ReadyMix non è stata ben miscelata. | Miscelare accuratamente ReadyMix prima dell'uso per garantire che il SYBR Green venga aggiunto nella concentrazione corretta a tutti i capillari. | |
| Lo strumento per PCR quantitativa è contaminato. | Decontaminare lo strumento secondo le istruzioni del produttore. | ||
| Le curve di amplificazione raggiungono un massimo e poi diminuiscono con quantità elevate di templato | Ridurre il numero di cicli usati per il calcolo della linea di base. La correzione della linea di base compensa eccessivamente e annulla il segnale. | ||
| Tempo di esposizione adeguato | Modificare adeguatamente il tempo di esposizione se si utilizzano tappi (25) o coperture adesive ottiche (10). |
I materiali
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