Detekce, prevence a eliminace mykoplazmat v buněčných kulturách

Přečtěte si o

• Neviditelná hrozba pro buněčné linie a kultury
• Obvyklé zdroje mykoplazmy a jak je kontrolovat
• Metody detekce mykoplazmy
• Metody odstraňování mykoplazmat
• Roztoky pro odstraňování mykoplazmat
• Související produkty

HROZBA NEVIDITELNÉ KONTAMINACE PRO BUNĚČNÉ LINIE A KULTURY

Udržování kultur bez kontaminace je pro výzkum založený na buněčných kulturách zásadní. Mezi nejrozšířenější kontaminace v kulturách eukaryotických a kmenových buněk patří mykoplazma. Příslušníci tohoto rodu bakterií jsou obvykle submikronové velikosti a postrádají buněčnou stěnu. Díky tomu je obtížné nebo nemožné je odhalit mikroskopem a jsou odolné vůči mnoha antibiotickým přípravkům.

Ačkoli kontaminace mykoplazmou obvykle nezpůsobuje buněčnou smrt, může mít na kultivované buňky různé účinky. Patří mezi ně změněný metabolismus, zpomalení rychlosti růstu a chromozomální aberace. Takové změny nemusí být okamžitě patrné, ale v konečném důsledku mohou ovlivnit spolehlivost údajů o kultivaci. Kontaminované buněčné linie mohou být natolik narušeny, že se chovají jako zcela jiná linie.

Krátce řečeno, kontaminace mykoplasmou ohrožuje validitu postižených buněčných linií pro poskytování smysluplných dat pro výzkum v oblasti přírodních věd.

OBECNÉ ZDROJE mykoplazmy v laboratoři a jak je kontrolovat

Zdroje kontaminace mykoplazmou v laboratoři je velmi náročné s jistotou kontrolovat. Vzhledem k tomu, že se několik druhů vyskytuje na lidské kůži, mohou být do kultur zaneseny špatnou aseptickou technikou.

Tyto bakterie mohou být také zaneseny prostřednictvím kontaminovaných doplňků, jako je fetální bovinní sérum, nebo přenosem z jiných kontaminovaných buněčných kultur. Tato křížová kontaminace je velmi častým způsobem zavlečení kontaminace mykoplazmaty do laboratoře. Díky své malé velikosti (0,2-0,8 µm) a deformovatelnosti mohou mykoplazmata při filtraci sterilních médií pronikat filtry s velikostí pórů pouhých 0,2 µm. Mykoplazma se také může rychle šířit a kontaminovat další oblasti laboratoře prostřednictvím aerosolů a částic vznikajících při manipulaci s kulturami. 

Klíčové je přísné dodržování správné laboratorní praxe, jako je svědomitá aseptická technika. Pro úspěšnou kontrolu kontaminace se rovněž důrazně doporučuje rutinní screening kultur. Další informace o dalších zdrojích kontaminace a způsobech, jak kontaminaci předcházet, najdete v našem článku odstraňování problémů s kontaminací buněk.

Použití sterilizačních filtrů o velikosti 0,1 µm může pomoci odstranit nebo snížit množství mykoplazmy při přípravě médií pro buněčné kultury, pufrů a činidel. Dekontaminační spreje a utěrky určené pro laboratorní vybavení a povrchy mohou poskytnout další ochranu před kontaminací a zároveň zvýšit přesnost výsledků screeningu PCR.

METODY DETEKCE MYKOPLASMY

Níže uvedené produkty představují kompletní sadu nástrojů pro detekci mykoplazmy. Výzkumníci mohou chtít použít druhý test k potvrzení pozitivního výsledku kontaminace mykoplazmou. Soupravy Multitest mohou také zajistit, že testování bude prováděno s dostatečnou frekvencí, aby byly chráněny životně důležité kultury. Tři účinné metody detekce:

• Kultivace mykoplazmy: Bakteriální kultivační média optimalizovaná pro mykoplazmu se naočkují testovacími vzorky kultur a vypěstují se na mykoplazmové agarové plotně. Jedná se o nejpřímější test na kontaminaci mykoplazmou, který však také trvá nejdéle. Kultury by se měly před vyhodnocením nechat inkubovat nejméně dva týdny a získání výsledků z kultivace mykoplazmy může trvat až měsíc.
• Metoda barvení DNA: Tato jednoduchá metoda spočívá v barvení jader bakterií pomocí Hoechstu nebo DAPI, které je viditelné při fluorescenční mikroskopii. Tato metoda je sice rychlá, ale není definitivní pro kontaminaci mykoplasmou.
• PCR (polymerázová řetězová reakce): která amplifikuje bakteriální DNA, pokud je ve vzorcích kultury přítomna. Detekce mykoplazmy na základě PCR se stala důvěryhodnou metodou pro rutinní údržbu buněčných kultur a je metodou, kterou používají společnosti nabízející služby detekce mykoplazmy, a také způsobem, jakým buněčná úložiště chrání své vlastní zásoby. Dobře navržené primery PCR jsou důležité pro eliminaci falešně pozitivních výsledků a zajištění toho, aby cenné kultury nebyly zničeny, pokud nejsou kontaminovány. Tento test lze také provést rychle, takže je užitečný v situaci potenciální epidemie.

Testy PCR jsou mimořádně citlivé a mohou poskytovat rychlé výsledky, což umožňuje výzkumným pracovníkům rychle reagovat na izolaci a eliminaci kontaminace mykoplazmaty, pokud je zjištěna. Soupravy LookOut^® pro detekci mykoplazmy PCR jsou mimořádně citlivé, s detekčním limitem pouhé 2 genomy na μl vzorku. Naše nejnovější jednokroková souprava PCR je navržena tak, aby se pipetování omezilo na minimum, protože směs PCR obsahuje všechna činidla potřebná pro reakci: primery, nukleotidy, polymerázu a vnitřní kontrolu amplifikace, která je dodávána v lyofilizované reakční směsi připravené k použití. Prohlédněte si naši metodu Optimalizovaná detekce mykoplazmy na základě PCR.

Kontaminace DNA může ovlivnit výsledky testu PCR na mykoplazmu. Eliminace kontaminující DNA z prostředí PCR je proto důležitá pro zajištění přesnosti testů PCR. Sprej na eliminaci DNA (L8917) a utěrky (L9060-50) odstraňují z prostředí PCR kontaminanty nukleových kyselin, což vede k přesnějším výsledkům PCR.

Mycoplasma Clearance Methods

Efektivní filtrační strategie jsou nezbytné pro prevenci kontaminace mykoplazmaty. Díky své malé velikosti a deformovatelnosti mohou mykoplazmy pronikat filtry s velikostí pórů pouhých 0,2 µm. Bylo prokázáno, že Filtry Stericup^® a Steritop^® obsahující 0.1 µm PES membrány lze účinně použít k redukci mykoplazmy při přípravě médií pro buněčné kultury a pufrů. Výsledky ukazují, že tyto filtry lze použít ke zmírnění rizika kontaminace mykoplazmaty v předcházejících procesech buněčných kultur. Využitím mikrofiltračních strategií v pracovních postupech buněčných kultur mohou výzkumní pracovníci zmírnit rizika spojená s kontaminací mykoplazmaty a zajistit integritu a kvalitu svých biologických materiálů.

Řešení pro eliminaci mykoplazmy

Po zjištění mykoplazmy mohou kultivátoři buněk buď kontaminaci z kultur odstranit, nebo začít znovu. Vědci často chtějí kontaminaci odstranit, protože buněčné linie jsou pro projekt důležité nebo drahé.

Naše sady pro eliminaci mykoplazmy jsou pohodlnou a účinnou volbou pro zbavení buněčných kultur kontaminace.

Soupravy pro detekci, prevenci a eliminaci kontaminace mykoplazmou

.