Přístupy k návrhu nanonosičů na bázi lipidů pro doručování mRNA

Xing Duan, Xiangrong Song^*

Department of Critical Care Medicine, Department of Clinical Pharmacy, Frontiers Science Center for Disease-related Molecular Network, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, 610041, China.

Material Matters™ 2023, 18.2

[email protected]

• Úvod
• Kationické lipidy pro doručování mRNA
• Ionizovatelné lipidy pro doručování mRNA
• Výzkum a vývoj vysoce účinných ionizovatelných lipidů
• Perspektivy
• Související produkty
• Reference

Úvod

Byly syntetizovány různé nosiče, včetně nanonosičů na bázi lipidů (LNP), polymerních nanočástic, kationtových nanoemulzí (CNE) a dalších nosičových systémů, které chrání mRNA před degradací široce přítomnou RNázou a mají zásadní význam pro vývoj léků na bázi mRNA. LNP jsou nejvýznamnějšími systémy pro doručování mRNA léčiv díky své vysoké účinnosti a nízké toxicitě. Dvě mRNA vakcíny na bázi LNP, BNT162b2 (od společnosti Pfizer BioNTech) a mRNA-1273 (od společnosti Moderna), byly schváleny americkým úřadem FDA pro kontrolu pandemie SARS-CoV-2.¹ Obecně se LNP skládají ze čtyř složek: kationtových nebo ionizovatelných lipidů, neutrálních fosfolipidů, cholesterolu a lipidů modifikovaných polyetylenglykolem. Kationtové lipidy byly jako první použity ke konstrukci LNP doručovacích systémů a byly široce využívány k doručování genových léčiv, včetně DNA, siRNA a plasmidů et al. Jejich vývoj však byl omezen relativně nízkou účinností při doručování mRNA a určitými toxickými vedlejšími účinky. Proto je správné využití kationtových lipidů k vývoji účinných LNP významným vědeckým problémem, který je třeba naléhavě studovat.

Ionizovatelné lipidy jsou nedílnou součástí bezpečnosti a účinnosti LNP a mají zásadní význam pro určení náplně, exprese a zacílení mRNA.² Například ionizovatelné lipidy použité v přípravcích Patisiran, BNT162b2 a mRNA-1273 jsou DLin-MC3-DMA (MC3), ALC-0315 a SM-102. V případě mRNA-1273 se jedná o DLin-MC3-DMA (MC3), ALC-0315 a SM-102. Je však třeba ještě objasnit, jak chemická struktura ionizovatelných lipidů ovlivňuje účinnost přenosu LNP pro mRNA. Vývoj účinných LNP zároveň vyžaduje pečlivý návrh formulací a výběr vhodných cest podání. V tomto přehledu se proto zabýváme tím, jak správně používat kationtové lipidy, vyvíjet vysoce účinné ionizovatelné lipidy, provádět inovativní výzkum v oblasti předepisování LNP a volit cestu podání LNP.

 

Kationické lipidy pro mDoručování RNA

Lipozomy jsou považovány za nejstarší lipidové nanočástice, protože jsou složeny z lipidů a ve většině případů mají nanorozměry. Liposomy mohou účinně zlepšit rozpustnost léčiv ve vodě a pomáhají většině léčiv rozpustných v lipidech vstoupit do klinické praxe, například liposomům doxorubicinu a přípravku Epaxal. V oblasti podávání léčivých látek s nukleovými kyselinami mohou kationtové liposomy složené z kationtových lipidů se stálým kladným nábojem účinně přenášet záporně nabité nukleové kyseliny. Kationtové lipidy byly široce používány při dodávání mRNA, včetně N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamonium chloridu (DOTMA), 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylamoniumpropanchlorid (DOTAP)3, 1,2-stearoyl-3-trimethylamoniumpropan (DSTAP) a 1,2-dimyristoyl-3-trimethylamoniumpropan (DMTAP). Lipidové nanočástice zkonstruované z těchto kationtových lipidů a dalších pomocných materiálů mohou účinně dopravovat léčiva nukleových kyselin do těla. S nástupem ionizovatelných lipidů však systémy pro doručování nukleových kyselin založené na ionizovatelných lipidech vykazují účinnější doručovací vlastnosti než systémy založené na kationtových lipidech. Proto se vývoj kationtových lipidů dostal do období úzkého hrdla.

Doručovací systém selektivního cílení na orgány (SORT)

Vědci naštěstí našli účinný způsob využití kationtových lipidů, z nichž nejvýznamnější je teorie selektivního cílení na orgány (SORT). Cheng a spol. nahradili některé pomocné lipidy kationtovými lipidy a zkonstruovali tak systém pro doručování mRNA se specifickou funkcí cílení na orgány. Přidáním kationtových lipidů by bylo možné účinně regulovat zeta potenciál LNP a typ proteinu adsorbovaného LNP během transportu v těle, čímž by bylo možné realizovat orgánově selektivní LNP (obr. 1).⁴

Modifikace povrchu a funkcionalizace kationtových liposomů

Na druhé straně mohou vysoce kladně nabité kationtové nanočipy ničit krevní buňky a způsobovat hemolýzu. Zároveň budou v důsledku absorpce nadměrného množství sérových bílkovin odstraněny retikuloendoteliálním systémem, což povede k nízké účinnosti doručení mRNA do organismu. K překonání tohoto problému připravili Song a spol. negativně nabité mRNA vakcíny modifikací přírodních aniontových polymerů na povrch kationtových liposomů. Tato strategie účinně snížila toxicitu kationtových liposomů a dosáhla účinného doručení mRNA. K modifikaci kationtových liposomů byl použit alginát sodný, kyselina hyaluronová, Dex-Aco a další aniontové polymery a tato strategie aniontového potahování může mít jedinečné výhody při vývoji kationtových liposomů (obr. 2).⁵

Obrázek 1. Selektivní cílení na orgány (SORT) umožňuje systematicky a předvídatelně upravovat lipidové nanočástice (LNP) tak, aby přesně doručily mRNA do konkrétních orgánů. A) LNP 5A2-SC8 SORT byly formulovány podle pokynů tak, aby vznikla řada LNP s 0 % až 100 % lipidů SORT (frakce celkových lipidů). Zde zařazení trvale kationického lipidu (DOTAP) systematicky posouvalo expresi proteinu luciferázy z jater do sleziny a plic v závislosti na procentuálním zastoupení DOTAP. B) Údaje z kvantifikace prokázaly, že procento molekul SORT je nejvýznamnějším faktorem pro dodávku specifickou pro danou tkáň. Údaje byly zobrazeny jako průměr±s.e.m. (n=4 biologicky nezávislá zvířata). C) Relativní exprese luciferázy v každém orgánu prokázala, že frakční expresi lze předvídatelně vyladit (0,1 mg/kg Luc mRNA, IV, 6 h). Údaje jsou uvedeny jako průměr ± s.e.m. (n=4 biologicky nezávislá zvířata). Přetištěno se svolením z odkazu 4, copyright 2020 Springer Nature.

Obrázek 2. Negativně nabitá SA@DOTAP-mRNA byla připravena potažením lipozomů DOTAP-mRNA SA, což přispělo k úniku komplexu lipozom/mRNA z lyzozomu a vyvolalo silnější imunitní odpověď. Přetištěno se svolením z odkazu 5, copyright 2022 Elsevier.

Ionizovatelné lipidy pro mdoručování RNA

LNP na bázi ionizovatelných lipidů dosáhly v klinické praxi slibných terapeutických účinků a ionizovatelné lipidy, které jsou hlavní složkou LNP, hrají rozhodující roli při nakládání mRNA, ochraně mRNA před degradací RNázou a řízení uvolňování mRNA. Klinicky nejstarším ionizovatelným lipidem použitým k doručení nukleových kyselin byl Dlin- MC3-DMA (MC3), který byl klinicky použit k doručení siRNA pro léčbu amyloidózy zprostředkované transthyretinem. V roce 2022 byly ionizovatelné lipidy ALC-0315 (Pfizer) a SM-102 (Moderna) využity v nanočásticích vakcíny COVID-19. Staly se tak jedinými dvěma mRNA vakcínami na světě, které byly schváleny FDA pro použití proti SARS-CoV-2. V současné době probíhají klinické studie různých mRNA léčiv na bázi ionizovatelných lipidů.

Chemická struktura ionizovatelných lipidů hraje při doručování nukleových kyselin zásadní roli, a proto bylo provedeno mnoho preklinických studií, které měly odhalit vliv jejich chemické struktury na doručování nukleových kyselin. Ionizovatelné lipidy jsou amfifilní molekuly, které obsahují tři domény: polární hlavovou skupinu, hydrofobní ocasní oblast a linker mezi oběma doménami.

Polární hlavová skupina ionizovatelných lipidů

Hlavová skupina je tvořena jedním nebo více protonovatelnými N atomy. Ačkoli všechny tři lipidy, které jsou v současné době na trhu, obsahují pouze jeden protonovatelný atom N, není jasné, zda jsou ionizovatelné lipidy, jejichž hlavy obsahují určitý počet protonovatelných atomů N, vhodnější pro dodávání nukleových kyselin. Song a spol. navrhli knihovnu ionizovatelných lipidů se strukturou 4N4T. Ionizovatelné lipidy 4N4T lze rozdělit na hydrofilní centra a hydrofobní ocasy. Hydrofilní centrum se skládá ze čtyř terciárních aminů (N) a čtyř nasycených hydrofobních řetězců (T). Tyto 4N4T LNP vykazují mnohem vyšší účinnost translace mRNA než schválené LNP SM 102 a tyto mRNA vakcíny na bázi 4N4T COVID-19 úspěšně vyvolávají robustní a trvalé humorální imunitní odpovědi proti SARS-CoV-2 a jeho variantám, včetně Delta a Omicron. Důležité je, že mRNA vakcíny COVID-19 na bázi 4N4T mají vyšší titry IgG specifických pro RBD a titry neutralizačních protilátek než mRNA vakcíny na bázi SM 102.6 Mezi další ionizující lipidy na bázi více atomů N patří C12-200, 5A2-SC8, 306Oi10, TT3 a C14-4.7 Ačkoli podle literárních údajů nebyly tyto nosiče srovnávány s nosiči SM102 nebo ALC-0315, mohou mít stejnou schopnost doručení mRNA jako SM102 a ALC0315.

Hydrofobní oblast ocasu ionizovatelných lipidů

Dan Peer a kol. vyvinuli řadu ionizovatelných lipidů s různou strukturou ocasu na bázi stejné hlavy. Zjistili, že lipidy s rozvětveným řetězcem a esterovými vazbami jsou méně účinné než lipidy s řetězci linolových mastných kyselin. To by mohlo být přičítáno lepšímu úniku z endosomů v důsledku změny struktury linolových lipidů.⁸ V jiné studii byla navržena malá knihovna lipoidů s použitím 3,3′-diamino-N-methyldipropylaminu, která reagovala s 11 nasycenými alkylakrylátovými ocasy o délce od 6 do 18. V této knihovně byly použity lipoidy o délce od 6 do 18, které se liší v závislosti na délce. Výsledky ukázaly, že lipoid 306Oi10 s jednouhlíkatou větví v chvostu poskytuje desetinásobné zlepšení oproti lipoidu 306O10 s rovným chvostem. Nanočástice obsahující 306Oi10 ionizují při endozomálním pH 5,0, čímž zlepšují doručení mRNA.⁹

Vazba mezi polární hlavovou skupinou a hydrofobním ocasem

Struktura ligandů hlavy a ocasu ionizovaných lipidů hraje zásadní roli při řízení stability LNP, cílení na orgány během transportu in vivo a rychlosti uvolňování molekul nukleových kyselin. Virgil Percec a kol. zjistili, že LNPs mají zřetelnější cílení v játrech a slezině, pokud je struktura ligandu esterová vazba, a specifičtější cílení v plicích, pokud je struktura ligandu amidová vazba.¹⁰ To potvrdila i výzkumná práce Qiaobing Xu a kol. Porovnáním ionizovatelných lipidů řady 306Oi10 s ionizovatelnými lipidy řady 306N12B se můžeme lépe přesvědčit, že spojovací skupiny hrají významnou roli při regulaci orgánové selektivity LNP.¹¹ Kromě toho mohou být biodegradovatelné lipidy tvořeny také esterovými i disulfidovými motivy. Štěpení disulfidických vazeb vede k vnitročásticovému nukleofilnímu útoku na esterový linker, což urychluje jejich rozklad.¹²

Ačkoli všechny tři složky ionizovatelných lipidů mají své role, celek je větší než lokální přídavek. Při vývoji účinných ionizovatelných lipidů bychom měli navrhovat z hlediska celé molekuly a zvolit vhodnou kombinaci.

Výzkum a vývoj vysoce účinných ionizovatelných lipidů

Ionizovatelné lipidy jsou základními složkami LNP, takže jejich vývoj přitahuje velkou pozornost. Podle přehledu v Nature Communications se ionizovatelné lipidy dělí do pěti kategorií. Nenasycené ionizovatelné lipidy (DLin-MC3-DMA, A6, OF-O2, A18-Iso5-2DC18), víceocasé ionizovatelné lipidy (98N12-5, C12-200, 9A1P9 a cKK-E12), ionizovatelné polymerní lipidy (7C1 a G0-C14), biologicky rozložitelné ionizovatelné lipidy (L319, 304O13, OF-Deg-Lin, 306-O12B) a rozvětvené ionizovatelné lipidy (306Oi10, FTT). Na základě současného pokroku ve výzkumu a klinického stavu jsou odbouratelné páteře a zvýšené větvení/ocasy dvě nejpříznivější strukturní vlastnosti pro budoucí vývoj ionizovatelných lipidů. SM-102 a ALC-0315 mají společné vlastnosti, včetně terciárního aminu, rozvětvených ocásků a esterových linkerů. Oba navíc vykazují prodloužené alifatické větve, díky čemuž se podobají víceocasým strukturám. Kromě bezpečnosti a účinnosti budou ve specifických aplikacích hrát důležitou roli ionizovatelné lipidy nové generace s dalšími funkcemi, jako je cílení a imunitní regulace. V současné době tvoří více než polovinu LNP ionizovatelné lipidy cílené na játra, slezinu, plíce, srdce, ledviny, slinivku břišní a další orgány. Stále existují obrovské příležitosti pro inovace, které umožní realizovat širší perspektivy použití RNA terapie.¹³

Obrázek 3. Kuželovité iontové páry tvořené aniontovými endozomálními fosfolipidy a protonizovanými ionizovatelnými lipidy mohou narušit strukturu dvojvrstvy a podpořit tak únik z endozomu. Na základě svých strukturních vlastností lze ionizovatelné lipidy dodávající RNA rozdělit na nenasycené (obsahující nenasycené vazby), víceocasé (obsahující více než dva ocasy), polymerní (obsahující polymer nebo dendrimer), biodegradabilní (obsahující biodegradabilní vazby) a rozvětvené (obsahující rozvětvené ocasy). Přetištěno se svolením z odkazu 13, copyright 2021 Springer Nature.

Předpisový design LNPs

Složení komerčně dostupných LNP jsou si velmi podobná. Složení LNPS se skládá z 35-50 % z ionizovatelných lipidů a zbývajících 10-20 % tvoří neutrální lipidy, 35-40 % cholesterol a 0,5-2,5 % PEG. Kromě ionizovatelných lipidů jsou možné i další inovace, například nahrazení cholesterolu ß-sitosterolem. ß-sitosterol dává LNPs polyedrický tvar, který je příznivý pro únik z endosomu. Optimalizované LNPs vykazovaly rovnoměrnou distribuci částic, polyedrickou morfologii a rychlou roztaženou difúzi, což zlepšilo transfekci genů.¹⁴ Kromě toho jsou neutrální fosfolipidy nahrazeny kationtovými nebo aniontovými fosfolipidy, aby se reguloval zeta potenciál LNPs a dosáhlo se orgánově selektivního doručení LNPs.¹⁵ Vyvíjejí se také další typy fosfolipidů a PGE, aby se zlepšila doručovací schopnost LNP. Obrázek 4 ukazuje reprezentativní struktury složek LPN.

Obrázek 4. Reprezentativní struktury složek LNP. Zásadní vliv na účinek LNP má jejich složení, předepsaný poměr a technologie přípravy. LNP obvykle obsahují čtyři složky, a to ionizovatelné kationické lipidy, fosfolipidy, cholesterol a PEGylované lipidy. Ty se mohou samy sestavovat do nanosložek LNPs metodou ředění etanolem. Zde jsou uvedeny reprezentativní sloučeniny pro každou složku.

Způsob podání LNP

Různé způsoby podání LNP významně ovlivní distribuci LNP v orgánech, délku exprese mRNA a typy buněk, které LNP přijímají, což vede k různým terapeutickým účinkům. Intravenózní a intramuskulární injekce LNP byly klinicky aplikovány, zatímco jiné způsoby podání jsou stále předmětem klinických a preklinických studií. Yuhong Xu a spol. podávali LNPs intramuskulárně, subkutánně a intravenózně a výsledky ukázaly, že LNPs se při intravenózní injekci hromadí hlavně v játrech a exprese luciferázy v játrech dosahuje vrcholu po 4 h a rychle klesá během 48 h. LNPs podávané intramuskulárně se mohou nacházet v místě injekce, ale exprese genu je patrná i v játrech. LNP injikované subkutánně se zdržovaly v místě vpichu a vyvolávaly slabší expresi mRNA.¹⁶ Kathryn A. Whitehead a spol. vybrali pro přípravu tří LNP 396Oi10, 200Oi10 a 514Oi10. Ve srovnání s intravenózní injekcí (IV) intraabdominální injekce (IP) významně zvýšila účinnost a specifičnost doručení mRNA cílené na pankreas a pomohla zlepšit doručení a specifičnost.¹⁷ Také James E. Dahlman a kol. na základě propracovaného návrhu receptur zkonstruovali LNP nazvaný Nebulized Lung Delivery 1 (NLD1) pro další analýzu. Porovnáním relativních velikostí různých DLS píků vědci zjistili, že NLD1 je po nebulizaci stabilnější než 7C3, cKK-E12 a MC3. Nakonec byl NLD1 po nebulizaci stabilní a dobře snášený a účinnost transfekce plic byla vyšší.¹⁸ Pro podávání LNP byly použity i jiné cesty podávání léčiv. Niren Murthy a kol. podali LNP intrauterinní injekcí myším plodům a dosáhli účinné transfekce v játrech, srdci, ledvinách, plicích, gastrointestinálním traktu a mozku, přičemž úroveň transfekce přesahovala 5 %. Tato strategie je slibná pro prevenci a léčbu různých onemocnění plodu.¹⁹

Obrázek 5. Způsoby podání přípravků LNP-mRNA. LNP lze podávat intravenózní injekcí, intramuskulární injekcí, subkutánní injekcí, intradermální injekcí a aspirací. Copyright Springer Nature Limited.

Perspektivy

V posledním desetiletí se vývoj LNP výrazně rozšířil. V současné době jsou k dispozici tři komerčně dostupné LNP a několik klinických a preklinických studií týkajících se LNP. Očekává se, že v příštích několika letech vstoupí na trh stále větší počet LNP. Tento článek shrnuje současný stav LNP v posledních letech a několik zásadních klíčových bodů, kterými se bude řídit budoucí výzkum a vývoj LNP.

Především jsou klíčem k úspěchu LNP účinné nosiče. Ačkoli kationtové lipidy nemusí být pro doručování mRNA tak dobré jako ionizovatelné lipidy, neměly by být opuštěny. K vývoji kationtových lipidů může přispět modifikace povrchu, optimalizace předpisu a strategie míchání s ionizovatelnými lipidy. Za druhé, při vývoji nových lipidových molekul by měly být plně zohledněny tři složky lipidů a chemická struktura nosiče by měla být upravena pro výzkum a vývoj s cílem navrhnout účinný, bezpečný a orgánově selektivní nosič. Zatřetí, při výzkumu a vývoji LNP je rovněž důležitý návrh receptur a volba způsobu podání. Mnoho pomocných sloučenin může zlepšit stabilitu LNPs a účinnost doručení LNPs k mRNA. Zároveň má cesta podání LNP také zásadní vliv na jejich účinnost. Je třeba se zabývat úpravou předpisu LNP, protože LNP čelí různým překážkám při různých způsobech podání.

Nakonec, každá část výzkumu a vývoje LNP je nezbytná a celek je větší než součet částí. Výzkumníci by měli správně navrhnout chemickou strukturu nosiče, doladit složení LNP podle předpisu a zvolit vhodnou cestu podání podle vlastních cílů výzkumu a vývoje.

Poděkování

Tato studie byla podpořena Národním klíčovým programem výzkumu a vývoje v Číně (2021YFE0206600), Programem podpory vědy a technologií provincie S'-čchuan (2021YFSY0008 a 2020YJ0238), Fondem translační medicíny Západočínské nemocnice (CGZH19002) a fondem 1.3.5 Projekt pro obory excelence Západočínské nemocnice, Sichuan University (ZYGD18020/ZYJC18006).

REFERENCE

1. Regev-Yochay G, Gonen T, Gilboa M, Mandelboim M, Indenbaum V, Amit S, Meltzer L, Asraf K, Cohen C, Fluss R, et al. 2022. Efficacy of a Fourth Dose of Covid-19 mRNA Vaccine against Omicron. N Engl J Med. 386(14):1377-1380. https://doi.org/10.1056/nejmc2202542

2. Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA. 2021. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov. 20(11):817-838. https://doi.org/10.1038/s41573-021-00283-5

3. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. 2022. The replacement of helper lipids with charged alternatives in lipid nanoparticles facilitates targeted mRNA delivery to the spleen and lungs. Journal of Controlled Release. 345819-831. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2022.03.046

4. Cheng Q, Wei T, Farbiak L, Johnson LT, Dilliard SA, Siegwart DJ. 2020. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing. Nat. Nanotechnol.. 15(4):313-320. https://doi.org/10.1038/s41565-020-0669-6

5. Duan X, Zhang Y, Guo M, Fan N, Chen K, Qin S, Xiao W, Zheng Q, Huang H, Wei X, et al. 2023. Sodium alginate coating simultaneously increases the biosafety and immunotherapeutic activity of the cationic mRNA nanovaccine. Acta Pharmaceutica Sinica B. 13(3):942-954. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.08.015

6. Chen K, Fan N, Huang H, Jiang X, Qin S, Xiao W, Zheng Q, Zhang Y, Duan X, Qin Z, et al. 2022. mRNA Vaccines Against SARS‐CoV‐2 Variants Delivered by Lipid Nanoparticles Based on Novel Ionizable Lipids. Adv Funct Materials. 32(39): https://doi.org/10.1002/adfm.202204692

7. Qin S, Tang X, Chen Y, Chen K, Fan N, Xiao W, Zheng Q, Li G, Teng Y, Wu M, et al. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases. Sig Transduct Target Ther. 7(1): https://doi.org/10.1038/s41392-022-01007-w

8. Elia U, Ramishetti S, Rosenfeld R, Dammes N, Bar-Haim E, Naidu GS, Makdasi E, Yahalom-Ronen Y, Tamir H, Paran N, et al. 2021. Design of SARS-CoV-2 hFc-Conjugated Receptor-Binding Domain mRNA Vaccine Delivered via Lipid Nanoparticles. ACS Nano. 15(6):9627-9637. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c10180

9. Hajj KA, Ball RL, Deluty SB, Singh SR, Strelkova D, Knapp CM, Whitehead KA. 2019. Branched‐Tail Lipid Nanoparticles Potently Deliver mRNA In Vivo due to Enhanced Ionization at Endosomal pH. Small. 15(6): https://doi.org/10.1002/smll.201805097

10. Zhang D, Atochina-Vasserman EN, Maurya DS, Liu M, Xiao Q, Lu J, Lauri G, Ona N, Reagan EK, Ni H, et al. 2021. Targeted Delivery of mRNA with One-Component Ionizable Amphiphilic Janus Dendrimers. J. Am. Chem. Soc.. 143(43):17975-17982. https://doi.org/10.1021/jacs.1c09585

11. Qiu M, Tang Y, Chen J, Muriph R, Ye Z, Huang C, Evans J, Henske EP, Xu Q. 2022. Lung-selective mRNA delivery of synthetic lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary lymphangioleiomyomatosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 119(8): https://doi.org/10.1073/pnas.2116271119

12. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6(12):1078-1094. https://doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0

13. Han X, Zhang H, Butowska K, Swingle KL, Alameh M, Weissman D, Mitchell MJ. An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat Commun. 12(1): https://doi.org/10.1038/s41467-021-27493-0

14. Kim J, Jozic A, Lin Y, Eygeris Y, Bloom E, Tan X, Acosta C, MacDonald KD, Welsher KD, Sahay G. 2022. Engineering Lipid Nanoparticles for Enhanced Intracellular Delivery of mRNA through Inhalation. ACS Nano. 16(9):14792-14806. https://doi.org/10.1021/acsnano.2c05647

15. Wang X, Liu S, Sun Y, Yu X, Lee SM, Cheng Q, Wei T, Gong J, Robinson J, Zhang D, et al. 2023. Preparation of selective organ-targeting (SORT) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18(1):265-291. https://doi.org/10.1038/s41596-022-00755-x

16. Di J, Du Z, Wu K, Jin S, Wang X, Li T, Xu Y. 2022. Biodistribution and Non-linear Gene Expression of mRNA LNPs Affected by Delivery Route and Particle Size. Pharm Res. 39(1):105-114. https://doi.org/10.1007/s11095-022-03166-5

17. Melamed JR, Yerneni SS, Arral ML, LoPresti ST, Chaudhary N, Sehrawat A, Muramatsu H, Alameh M, Pardi N, Weissman D, et al. 2023. Ionizable lipid nanoparticles deliver mRNA to pancreatic β cells via macrophage-mediated gene transfer. Sci. Adv.. 9(4): https://doi.org/10.1126/sciadv.ade1444

18. Lokugamage MP, Vanover D, Beyersdorf J, Hatit MZC, Rotolo L, Echeverri ES, Peck HE, Ni H, Yoon J, Kim Y, et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5(9):1059-1068. https://doi.org/10.1038/s41551-021-00786-x

19. Gao K, Li J, Song H, Han H, Wang Y, Yin B, Farmer DL, Murthy N, Wang A. 2023. In utero delivery of mRNA to the heart, diaphragm and muscle with lipid nanoparticles. Bioactive Materials. 25387-398. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.02.011