Sanger-Sequenzierung - Schritte und Methode
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Die Sanger-Sequenzierung, auch bekannt als "Kettenabbruchmethode", ist eine Methode zur Bestimmung der Nukleotidsequenz der DNA. Die Methode wurde 1977 von dem zweifachen Nobelpreisträger Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt, daher auch der Name Sanger-Sequenzierung.
Zur Übersicht über die allgemeine Struktur der DNA siehe Abbildung 2.
Wie funktioniert die Sanger-Sequenzierung?
Die Sanger-Sequenzierung kann manuell oder, was häufiger der Fall ist, automatisiert mit einem Sequenziergerät durchgeführt werden (Abbildung 1). Jede Methode folgt drei grundlegenden Schritten, die im Folgenden beschrieben werden.
Abbildung 1.Drei grundlegende Schritte der automatisierten Sanger-Sequenzierung.
Schritte der Sanger-Sequenzierung
Bei der Sanger-Sequenzierung gibt es drei Hauptschritte.
1. DNA-Sequenz für Kettenabbruch-PCR
Die interessierende DNA-Sequenz wird als Vorlage für eine spezielle Art von PCR genannt Kettenabbruch-PCR. Die PCR mit Kettenabbruch funktioniert genauso wie die Standard-PCR, jedoch mit einem wesentlichen Unterschied: Es werden modifizierte Nukleotide (dNTPs), so genannte Dideoxyribonukleotide (ddNTPs), hinzugefügt. Im Verlängerungsschritt der Standard-PCR fügt die DNA-Polymerase dNTPs zu einem wachsenden DNA-Strang hinzu, indem sie die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der freien 3'-OH-Gruppe des letzten Nukleotids und dem 5'-Phosphat des nächsten katalysiert (Abbildung 2).
Bei der Kettenabbruch-PCR mischt der Anwender ein geringes Verhältnis von kettenabbrechenden ddNTPs zu den normalen dNTPs in die PCR-Reaktion. ddNTPs fehlt die 3'-OH -Gruppe, die für die Bildung der Phosphodiesterbindung erforderlich ist; wenn die DNA-Polymerase daher ein ddNTP zufällig einbaut, wird die Verlängerung abgebrochen. Das Ergebnis der PCR mit Kettenterminierung sind Millionen bis Milliarden von Oligonukleotidkopien der interessierenden DNA-Sequenz, die an einer zufälligen Länge (n) durch 5'-ddNTPs terminiert sind.
In manueller Sanger-Sequenzierung werden vier PCR-Reaktionen angesetzt, denen jeweils nur eine einzige Art von ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP und ddCTP) beigemischt wird.
Bei der automatisierten Sanger-Sequenzierung werden alle ddNTPs in einer einzigen Reaktion gemischt, und jedes der vier dNTPs hat eine eigene Fluoreszenzmarkierung.
2. Größentrennung durch Gelelektrophorese
Im zweiten Schritt werden die kettenendständigen Oligonukleotide durch Gelelektrophorese nach Größe getrennt. Bei der Gelelektrophorese werden die DNA-Proben in ein Ende einer Gelmatrix geladen und ein elektrischer Strom angelegt. Da die DNA negativ geladen ist, werden die Oligonukleotide in Richtung der positiven Elektrode auf der gegenüberliegenden Seite des Gels gezogen. Da alle DNA-Fragmente die gleiche Ladung pro Masseneinheit haben, wird die Geschwindigkeit, mit der sich die Oligonukleotide bewegen, nur durch die Größe bestimmt. Je kleiner ein Fragment ist, desto weniger Reibung erfährt es bei seiner Bewegung durch das Gel, und desto schneller bewegt es sich. Das Ergebnis ist, dass die Oligonukleotide vom kleinsten zum größten Fragment angeordnet sind und das Gel von unten nach oben durchlaufen.
Bei der manuellen Sanger-Sequenzierung werden die Oligonukleotide aus jeder der vier PCR-Reaktionen in vier separaten Lanes eines Gels angeordnet. So kann der Benutzer feststellen, welche Oligonukleotide den einzelnen ddNTPs entsprechen.
Bei der automatisierten Sanger-Sequenzierung werden alle Oligonukleotide in einer einzigen Kapillargel-Elektrophorese im Sequenziergerät ausgeführt.
3. Gel-Analyse & Bestimmung der DNA-Sequenz
Im letzten Schritt wird einfach das Gel ausgelesen, um die Sequenz der eingegebenen DNA zu bestimmen. Da die DNA-Polymerase die DNA nur in der Richtung von 5' nach 3', ausgehend von einem vorgegebenen Primer, synthetisiert, entspricht jedes terminale ddNTP einem bestimmten Nukleotid in der ursprünglichen Sequenz (z. B., das kürzeste Fragment muss am ersten Nukleotid vom 5'-Ende enden, das zweitkürzeste Fragment muss am zweiten Nukleotid vom 5'-Ende enden usw.) Daher können wir durch Auslesen der Gelbanden von der kleinsten zur größten die 5'- bis 3'-Sequenz des ursprünglichen DNA-Strangs bestimmen.
Bei der manuellen Sanger-Sequenzierung liest der Benutzer alle vier Spuren des Gels auf einmal von unten nach oben ab und verwendet die Spur, um die Identität des terminalen ddNTP für jede Bande zu bestimmen. Befindet sich beispielsweise die unterste Bande in der Spalte, die ddGTP entspricht, dann endet das kleinste PCR-Fragment mit ddGTP, und das erste Nukleotid vom 5'-Ende der ursprünglichen Sequenz hat eine Guaninbase (G).
Bei der automatisierten Sanger-Sequenzierung liest ein Computer jede Bande des Kapillargels der Reihe nach aus, wobei er die Identität jedes endständigen ddNTP durch Fluoreszenz anzeigt. Kurz gesagt, ein Laser regt die fluoreszierenden Markierungen in jeder Bande an, und ein Computer erkennt das daraus entstehende Licht. Da jedes der vier ddNTPs mit einer anderen Fluoreszenzmarkierung versehen ist, kann das emittierte Licht direkt mit der Identität des terminalen ddNTP in Verbindung gebracht werden. Das Ergebnis ist ein so genanntes Chromatogramm, das den Fluoreszenzpeak jedes Nukleotids entlang der Länge der DNA-Vorlage zeigt.
Abbildung 2.Schematische Darstellung der DNA-Struktur. Die DNA ist ein Molekül, das aus zwei Strängen besteht, die sich umeinander winden und eine Doppelhelix bilden. Jeder Strang besteht aus einer Reihe von Molekülen, den Desoxyribonukleotiden (dNTPs).
Jedes dNTP enthält eine Phosphatgruppe, eine Zuckergruppe und eine von vier Stickstoffbasen [Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) oder Cytosin (C)]. Die dNTPs sind durch kovalente Phosphodiesterbindungen zwischen dem Zucker eines dNTP und der Phosphatgruppe des nächsten linear aneinandergereiht; dieses sich wiederholende Zucker-Phosphat-Muster bildet das Zucker-Phosphat-Rückgrat.
Die stickstoffhaltigen Basen der beiden getrennten Stränge sind durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen miteinander verbunden und bilden die doppelsträngige DNA-Helix.
Wie man die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung liest
Das richtige Lesen der Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung hängt davon ab, welcher der beiden komplementären DNA-Stränge von Interesse ist und welcher Primer verfügbar ist. Wenn die beiden DNA-Stränge A und B sind und Strang A von Interesse ist, der Primer aber besser für Strang B geeignet ist, sind die ausgegebenen Fragmente identisch mit Strang A. Ist dagegen Strang A von Interesse und der Primer besser für Strang A geeignet, ist die Ausgabe identisch mit Strang B. Dementsprechend muss die Ausgabe in Strang A zurückverwandelt werden.
Wenn also die interessierende Sequenz "TACG" lautet und der Primer für diesen Strang am besten geeignet ist, wird die Ausgabe "ATGC" sein und muss daher in "TACG" zurückverwandelt werden. Wenn der Primer jedoch besser für den komplementären Strang ("ATGC") geeignet ist, lautet die Ausgabe "TACG", was die korrekte Sequenz ist.
Kurz gesagt, bevor Sie beginnen, müssen Sie wissen, was Sie anstreben und wie Sie dorthin gelangen wollen! In diesem Sinne ist hier ein Beispiel für das erste Beispiel (TACG -> ATGC -> TACG). Wenn die Didesoxynukleotide mit T = gelb, A = rosa, C = dunkelblau und G = hellblau markiert sind, erhält man die kurzen Sequenzen Primer-A, Primer-AT, Primer-ATG und Primer-ATGC. Nachdem die Fragmente durch Elektrophorese getrennt wurden, liest der Laser die Fragmente in der Reihenfolge ihrer Länge (rosa, gelb, hellblau und dunkelblau) und erstellt ein Chromatogramm. Der Computer wandelt die Buchstaben um, so dass die endgültige Sequenz das korrekte TACG ist.
Sanger Sequencing vs. PCR
Sanger Sequencing vs. PCR
Sanger-Sequenzierung und PCR verwenden ähnliche Ausgangsmaterialien und können in Verbindung miteinander verwendet werden, aber keines kann das andere ersetzen.
PCR wird verwendet, um die DNA in ihrer Gesamtheit zu amplifizieren. Dabei können zwar zufällig Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen (z. B. kann die DNA-Polymerase abfallen), aber das Ziel ist es, die gesamte DNA-Sequenz zu vervielfältigen. Zu diesem Zweck bestehen die "Zutaten" aus der Ziel-DNA, Nukleotiden, DNA-Primern und DNA-Polymerase (insbesondere Taq-Polymerase, die die für die PCR erforderlichen hohen Temperaturen überstehen kann).
Im Gegensatz dazu besteht das Ziel der Sanger-Sequenzierung darin, jede mögliche DNA-Länge bis zur vollen Länge der Ziel-DNA zu erzeugen. Deshalb sind neben den PCR-Ausgangsmaterialien auch die Dideoxynukleotide notwendig.
Sanger-Sequenzierung und PCR können bei der Erzeugung des Ausgangsmaterials für ein Sanger-Sequenzierungsprotokoll zusammengeführt werden. Mit Hilfe der PCR können viele Kopien der zu sequenzierenden DNA erstellt werden.
Das Sanger-Protokoll wird effizienter, wenn man von mehr als einer Vorlage ausgehen kann. Wenn die Zielsequenz 1.000 Nukleotide lang ist und es nur eine Kopie der Vorlage gibt, wird es länger dauern, die 1.000 markierten Fragmente zu erzeugen. Wenn es jedoch mehrere Kopien der Vorlage gibt, wird es theoretisch weniger Zeit in Anspruch nehmen, alle 1.000 markierten Fragmente zu erzeugen.
Verwandte Produkte
Response not successful: Received status code 500
Um weiterzulesen, melden Sie sich bitte an oder erstellen ein Konto.
Sie haben kein Konto?Um unseren Kunden ein besseres Nutzungserlebnis zu bieten, wurde diese Seite maschinell übersetzt. Unser Ziel ist es, eine möglichst originalgetreue maschinelle Übersetzung zur Verfügung zu stellen. Eine solche Übersetzung ist jedoch nicht perfekt. Wenn Sie mit dem maschinell übersetzten Inhalt nicht zufrieden sind, wechseln Sie bitte zur englischen Webseite.