카나비노이드 표준물질(CRMs): 시험 정확도 및 추적성

Sarah Aijaz, Sr. R&D Manager, Reference Materials, Zoe Ruan, Principal Scientist, Sunil Badal, Senior Scientist, Uma Sreenivasan, Head of Reference Materials R&D

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 12

초록

참조 물질은 대마초 작업 흐름에서 핵심적인 역할을 합니다. 결과의 정확도는 참조 물질의 정확도에 달려 있습니다. 당사는 교정 및 정량 분석, 시스템 적합성 연구, 정성적 스크리닝에 사용하기 위한 다양한 카나비노이드 인증 참조 물질(CRMs) 포트폴리오를 개발했습니다.

서론

대마초 및 헴프의 카나비노이드 정량 분석 또는 효능 검사에 대한 관심은 대마 식이 보조제 및 레크리에이션 제품의 상업화가 확대됨에 따라 지속적으로 증가하고 있습니다. 대부분의 미국 주에서는 의료용 마리화나를 합법화했으며 일부 주에서는 레크리에이션 용도도 허용하고 있지만, 연방 차원에서는 여전히 불법으로 분류되어 일급 마약으로 지정되어 있습니다. 미국에서 대마 작물 재배는 2018년 미국 농업 개선법(일명 2018년 농장법)에 의해 연방 차원에서 합법화되었습니다. 2021년 1월 19일 발표된 미국 농무부(USDA)의 대마 생산 최종 규정에서는 식물 재료의 건조 중량 기준 총 테트라하이드로칸나비놀(THC) 함량이 0.3% 미만일 때만 법적으로 대마로 정의됩니다. 총 THC 함량은 Δ-9 THC와 그 생합성 전구체인 테트라하이드로칸나비놀산(THCA)의 합으로 간주됩니다. 이는 THC가 THCA의 탈카르복실화 후 생성되는 분해 생성물이기 때문입니다. 샘플링된 식물 재료의 THC 함량이 0.3%를 초과할 경우 대마 생산자는 해당 전체 로트를 폐기해야 하며, 이는 심각한 재정적 파장을 초래할 수 있습니다. 총 THC 함량이 1%를 초과하는 식물 재료 생산은 과실 위반으로 규정되며, 생산자의 USDA 대마 재배 허가 정지 또는 취소로 이어질 수 있습니다. 이러한 영향은 정확한 카나비노이드 분석 검사의 중요성을 강조합니다. 그러나 최종 규칙은 분석 변동성의 중요성을 인정하며, THC 검사 결과와 관련된 측정 불확도(MU)를 보고하도록 시험소에 요구합니다. 이는 "허용 가능한 대마 THC 수준"이 MU를 반영할 수 있도록 하기 위함입니다.1

임시 최종 규정(IFR)에서 농산물 마케팅 서비스(AMS)는 대마 검사 실험실이 ISO/IEC 17025 인증을 획득해야 할 잠재적 요건에 대한 의견을 요청했습니다. 그러나 필요한 모든 대마 검사를 수용할 수 있는 실험실 역량이 현재 부족하다는 의견이 제기되어 이 요건은 최종 규정에 포함되지 않았습니다. 시험소는 특정 성능 기준을 충족하고 목적에 부합하는 시험 방법을 사용해야 하지만, 현재 연방 차원의 시험소 승인 절차는 마련되어 있지 않으며 주별 요구사항도 크게 상이합니다. 허용되는 분석 시험 방법론은 GC-FID 또는 UV/MS 검출기를 동반한 HPLC이며, 해당 방법은 AOAC 표준 방법 성능 요건 2019.003.2를 충족해야 합니다. AOAC는 식물 재료 내 카나비노이드 정량화를 위한 공식 방법 2018.11을 발표했으며, 이는 엄격한 승인 절차를 거쳤고 매우 신뢰할 수 있는 방법으로 인정받고 있습니다.3 미국약전(USP)은 의료용 대마초 검사에 있어 품질 관리 강화 및 관행의 조화가 필요함을 지적하고, 이러한 격차 해소에 도움이 되는 중요한 품질 속성 고려 사항을 발표했습니다.4 NIST는 실험실이 자체 검사의 비교 가능성과 역량을 평가할 수 있도록 숙련도 시험과 유사한 대마초 품질 보증 프로그램을 제공합니다.5 이러한 지침과 자원이 마련되었음에도 불구하고, 업계는 서로 다른 실험실에서 얻은 결과가 일관되지 않다는 지속적인 문제를 인정하고 있습니다.

검사 실험실의 교정 표준 정확도는 시험 결과 정확도에 직접적인 영향을 미치는 핵심 요소입니다. 실험실은 교정용으로 사용할 적합한 원료 또는 용액 기반 기준물질을 제조하거나 구입해야 합니다. 카나비노이드 인증 기준물질(CRMs)의 가용성은 검사 실험실이 비용 효율적인 자체 교정용 기준물질을 제작할 수 있게 하여, 이를 통해 시험 정확도와 재현성 수준을 높이는 데 기여합니다.

참조 물질 생산자에 특화된 ISO 17034와 시험 실험실에 특화된 ISO/IEC 17025는 CRM의 제조 및 시험에 대한 표준화를 제공합니다. CRM은 ISO 인증 생산자가 제조한 모든 물질 중 SI 측정 단위에 대한 최고 수준의 정확도와 추적성을 가진 것으로 간주됩니다.6,7 USP는 의료용으로 제공되는 대마초 관련 참조 표준을 선별하여 제공합니다. 그러나 국가 계량 연구소에서 제조한 카나비노이드 기준 물질은 존재하지 않습니다. 다만 NIST에서 현재 대마 식물 및 오일 기준 물질을 개발 중입니다.⁵

우리는 대마초 검사 산업을 지원 하기 위해다양한 카나비노이드 CRM 포트폴리오를 설계 및 제조했습니다. 이 제품들은 적절한 희석제에 용해된 단일 또는 다중 분석물로 제공되며, 암갈색 불꽃 밀봉 앰플에 포장됩니다. 저장 및 운송 중 분석물의 안정성을 보장하기 위해 적절한 취급 및 공정 관리가 시행되었습니다. 각 분석물의 농도는 ISO 17034 및 ISO/IEC 17025에 따라 인증됩니다. 농도 불확실도는 계산되어 동봉된 분석증명서(CoA)에 인증 농도와 함께 보고됩니다. 대마초 검사 실험실은 자체 방법의 불확실도 계산 시 이 미확장 불확실도 값을 적용해야 합니다.

카나비노이드 표준물질(CRM)의 제조 및 인증

Cerilliant^® CRM 제조에 사용된 칸나비노이드 원료는 모두 자체 합성되었으며, ISO 17034 및 ISO/IEC 17025에 따라 설계된 사전 결정된 시험 계획에 의해 인증되었습니다. 각 칸나비노이드의 동일성은 1H-NMR및 고해상도 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 통해 확인되었습니다. 각 원료의 효능 또는 질량 분율은 질량 균형 순도 계수(MBPF)로 지정되었으며, 이는 방정식 1을 사용하여 분석물의 질량에서 불순물의 질량을 차감하여 계산되었습니다. 불순물은 휘발성, 무기성 및 유기성 불순물을 고려한 다양한 기법을 통해 측정되었습니다. 잔류 수분 함량은 칼 피셔 전량법으로 측정하였다. 기타 잔류 휘발성 함량은 헤드스페이스 가스 크로마토그래피-화염 이온화 검출기(HS-GC-FID)로 측정하였으며, 잔류 무기물 함량은 잔류물 연소법(황산회)으로 측정하였다.

유기 불순물은 고성능 액체 크로마토그래피-자외선 검출법(HPLC-UV)으로 측정되었으며, 두 가지 직교법(orthogonal method)의 평균값으로 보고되었다. 두 방법의 직교 선택성은 서로 다른 크로마토그래피 고정상 및 이동상을 통해 확립되었다. 유기 불순물 분석 시 적절한 경우 확인 기법으로 GC-FID가 사용되었다. 일부 사례에서는 MBPF 확인 기법으로 정량적 1H-NMR도활용되었다.

방정식 1. 질량 균형 순도 계수 계산.

어디:

wt% 용매 = 불확실성을 포함한 잔류 용매 함량, _uOVI
wt%_H₂O = 불확실성을 포함한 잔류 수분 함량, _uKF
wt% Inorganics = 불확실성을 포함한 잔류 무기물 함량, _uROI
ChromPurity = 불확실성을 포함한 크로마토그래피 순도, _ucp

제안된 제품에 대한 적절한 취급 기술, 보관 조건, 적합한 농도 및 희석제를 결정하기 위해 제형 연구를 수행하였다. 최종 CRM 설계는 제형 연구 결과를 바탕으로 이루어졌다. 각 용액은 분석 대상 물질 및 희석제의 중량 측정을 통해 제조되었으며, 농도는 방정식 2를 사용하여 실제 측정 질량, 분석 대상 물질의 순도 보정, 용액의 측정 질량 및 20°C에서 순수 희석제의 밀도를 바탕으로 결정되었습니다. 점성이 있거나 유리질, 취급이 어려운 원료의 경우, 최종 희석 전에 저장용액을 제조하고 분석적으로 검증하였습니다. 모든 질량 측정은 적격하고 교정된 분석 저울을 통해 국제 단위계(SI)로 추적 가능하며, 공기 중 계량에 대한 관례적 기준으로 보고되었습니다. 각 용액의 질량은 용액의 밀도로 나누어 부피로 변환하였습니다. 밀도 측정은 밀도계로 수행되었으며, 교정을 통해 상위 표준에 추적 가능합니다. 각 분석물의 준비된 농도는 부피당 질량 단위로 보고되며, 확장 불확도와 지정된 신뢰 구간이 함께 제시됩니다. 용액은 1mL 이상의 충전 용량을 가진 암갈색 앰풀에 분주된 후 아르곤 분위기에서 불꽃 밀봉 처리하였습니다.

방정식 2. 중량법으로 제조된 교정용 표준물질(CRM)에 대한 인증 농도 계산

어디:

C = 공인 재산 가치(), 용액 내 분석물의 질량/부피 단위 농도
_mv+a = 분석물 + 바이알의 질량
_mv = 빈 바이알의 질량
_mf+s = 플라스크 + 용매의 질량
_mf = 빈 플라스크 질량
d = 용액의 밀도
p = 순도 보정, 100/질량 균형 순도 계수 (분석물 기준)
U = 할당된 결합 확장 측정 불확도

각 CRM의 농도, 균일성 및 순도는 HPLC-UV 분석 검사를 통해 검증되었습니다. 무작위 가중 계층화 표본 추출 계획에 따라 배치 전체에서 밀봉 앰플을 선정하여 시험했으며, 중요 공정 지점에서는 더 높은 비율의 시료를 채취했습니다. 농도는 독립적으로 준비된 교정 용액과의 비교를 통해 검증되었으며, 시료의 반복 분석 평균값으로 계산되었습니다. 앰풀 내 및 앰풀 간 균질성은 시료의 반복 분석 상대 표준편차를 통해 검증되었습니다. 정확도 및 균질성 허용 기준에는 분석 측정의 불확실성 기여도와 분석용 시료 준비 과정에서의 이송 및 증발 손실로 인한 변동성이 포함되었습니다.

단기 운송 안정성은 냉동고(-25~-10°C), 냉장고(2~8°C), 실온(15~30°C) 및 스트레스 온도(40°C ±2°C)에서 수행된 온도 스트레스 연구를 통해 확립되었습니다. 각 저장 조건에서 지정된 시점에 각 용액 표준품의 앰풀 1개를 꺼내 분석 시까지 초저온 저장고로 이동시켰습니다. 스트레스 온도에서 저장된 앰풀은 HPLC-UV를 통해 순도 및/또는 농도를 평가했습니다.

CRM의 장기 안정성은 제조 후 14개월 동안 평가되었습니다. 이는 용액의 순도와 농도에 대한 실시간 연구를 위해 HPLC-UV 분석을 사용하여 수행되었습니다. 이러한 연구는 이후 제품의 전체 유통 기한 동안 지속적으로 수행됩니다.

결과 및 논의

ISO는 기준물질(RM)을 균질하고 안정적이며 의도된 측정 용도에 적합한 물질로 정의한다. CRM은 RM에 대한 요구사항 외에도 추가 요건을 충족해야 한다. CRM 특성 분석법은 계측학적으로 유효해야 하며 인증된 특성값의 측정 단위에 추적 가능해야 한다.8 ISO 가이드라인은 CRM 제조업체가 이러한 요건을 충족하는 방식에 대해 어느 정도 유연성을 부여한다.

결과적으로 인증 과정은 단순한 크로마토그래피 순도 분석을 통한 효능 부여부터 포괄적인 MBPF(최대 허용 불순물) 접근법까지 제조사마다 크게 다를 수 있습니다. 대마초 검사 실험실은 이를 유의하고 CRM의 분석 증명서(CoA)를 검토하여 의도된 용도에 적합한지 확인해야 합니다. 표 1은크로마토그래피 순도만 사용할 경우 발생할 수 있는 문제점을 보여줍니다. 카나비놀의 크로마토그래피 순도는 99.5%이지만, 잔류 용매와 물의 존재로 인해 MBPF가 부여한 효능은 96.0%입니다.

인증 방법 외에도 모든 CoA에는 운송 중 안정성과 제품 유통기한 내 장기 안정성을 입증하는 데이터가 포함되어야 합니다. 그림 1A는불안정한 시제품 제형에 대한 온도 스트레스 연구 사례로, 저장 온도와 시간이 증가함에 따라 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있습니다. 최종 안정 제형인 제품 C-218()은 최적화된 희석제 선택, 물질 취급 및 제형 공정 관리를 통해 개발되었습니다. 그림 1B는C-218()의 모든 분석물 농도가 4주까지 다양한 저장 온도에서 안정적으로 유지되며, 40°C에서 보관된 시료에서만 분해가 관찰됨을 보여줍니다. 그림 1C는대표 분석물인 CBDA와 THCA-A에 대한 동일한 가속 안정성 데이터를 선 그래프로 표시한 것으로, 최대 6개월까지의 추가 실시간 안정성 데이터를 보여줍니다. 제품의 유통기한 전반에 걸쳐 지속적인 실시간 안정성이 평가됩니다.

그림 1. 원형(A) 및 최종 완성된(B) 산성 카나비노이드 혼합물의 온도 스트레스 연구를 나타내는 막대 그래프. 다양한 온도에서 보관된 시간에 따른 농도 변화를 막대로 표시: fz: 냉동고 (-25~-10°C), R: 냉장고 (2~8°C), RT: 실온 (15~30°C) 및 40 (±2) °C. 하단 그래프(C)는 품번 C-218의 CBDA 및 THCA-A가 다양한 온도에서 6개월간 저장 시 농도 변화를 나타냅니다.

CRM 분석증명서(CoA)는 측정 불확도를 결정하는 데 사용된 방법을 보고해야 합니다. 그림 2는중량법으로 제조된 표준 용액의 인증 농도와 관련된 불확도 원인에 대한 예시 피쉬본 다이어그램을 보여줍니다. 방정식 3은불확도 전파 계산식을 나타냅니다. 불확도 계산에 사용된 방법은 생산 공정 변수와 위험 요소를 식별하고 통계적 분석을 결합하여 ISO 17034 및 ISO 가이드 35에 따라 수립되었습니다. 불확실성은 커버리지 계수 k=2를 사용하여 약 95% 신뢰 구간에서의 확장 불확실성으로 표현됩니다. 여기에는 순도 계수, 물질 밀도, 저울, 계량 절차, 용액 표준의 균질성 및 안정성의 불확실성이 포함됩니다. 인증된 농도의 불확실성은 CoA에서 부피당 질량 단위로 명시됩니다.

그림 2. 인증 농도에 대한 측정 불확실성 기여도 피쉬본 다이어그램

방정식 3. 표준물질의 인증 농도에 대한 불확실도 계산(동질성 및 안정성 항 포함)

_ucert = 인증된 특성값의 표준 불확도
_uchar= 표준 용액 표준품 조제 불확도이며, 분석체 질량 균형 순도 계수(pf) 특성을 위한 _{상향 불확도(upf} ), 질량 측정을 위한 _{미세 불확도(um} ), 용매 밀도를 위한 하향 불확도( _ud )를 포함한다.

_ubb = 병 간 균일성의 표준 불확도
_ustab = 안정성에 대한 표준 불확실도

참조물질(CRM)의 불확도 값을 결정하는 과정에는 질량 측정, 밀도 측정, 검증, 균질성 및 안정성을 포함한 표준 물질 제조 공정의 모든 측면에 대한 기술적 연구가 포함됩니다. 해당 연구는 다양한 공정 조건 하에서의 반복 측정을 포함하며, 밀도 및 질량 측정에 대한 표준 불확도를 확립합니다. 또한 연구를 통해 계량 및 분배에 대한 검증된 공정 제어 방법을 제공합니다. 균질성 불확도 기여도는 특정 배치의 분배 과정에서 중요한 시점에 채취한 시료의 농도 정확도 데이터에 대한 통계적 분석을 통해 평가됩니다. 안정성 불확도 기여도는 온도 스트레스 또는 실시간 안정성 데이터로부터 평가됩니다.

CRM은 동정, 정량, 시스템 적합성 및 방법 관리에 사용될 수 있습니다. 그림 3은17종의 카나비노이드를 포함하는 표준을 얻기 위한 CRM 희석 방식의 예시를 보여줍니다. 이는 초기 단계에서 시료 내 카나비노이드의 존재 여부를 평가하는 선별 도구로 활용될 수 있습니다. 관심 카나비노이드가 확인되면, 혼합물을 구성 성분의 예상 농도 범위를 아우르는 교정 곡선으로 희석하여 정량에 사용할 수 있습니다. 또는 단일 분석물 CRM을 사용하여 교정 곡선을 작성할 수도 있습니다. 그림 3에서는 5가지 CRM(제품 번호 C-218, C-219, C-153, C-154 및 C-171)과 대마 꽃 추출물로 제조한 17종 카나비노이드 혼합물의 HPLC-UV 크로마토그램 예시를 비교합니다.

그림 4는최대 허용 수준인 0.3%의 THC 검출을 위한 방법 성능을 보장하기 위한 시스템 적합성 시험으로 당사의 헴프 컴플라이언스 믹스(C-217)를 사용한 사례를보여줍니다. 동일한 방법으로 5 µg/mL의 카나비디올퀴논(CBDQ)을 함유한 별도의 용액을 분석했습니다. CBDQ는 CBD의 산화 분해 생성물 중 하나입니다. 중첩된 크로마토그램은 본 방법으로 THC와 CBDQ가 기준선 분리되었음을 보여줍니다. 다른 카나비노이드나 불순물이 THC와 함께 동시 용출될 경우 정량 오류가 발생합니다. 따라서 그림 4에 제시된 바와 같이, 이러한 목적을 위해 특별히 제조된 혼합물을 사용하여 정기적으로 방법 성능을 점검하는 것이 중요합니다.

그림 4. C-217 대마 적합 혼합물과 CBDQ를 함유한 시료의 HPLC-UV 크로마토그램 중첩도. THC와 CBDQ 간의 분해능을 보여줌.

결론

개별 카나비노이드 및 혼합물 기준물질(CRMs)을 개발하였습니다. 이는 대마초와 헴프 모두의 효능 프로파일링에 활용될 수 있습니다. 특히, 당사의 헴프 적합성 혼합물(Hemp Compliance Mix)은 헴프 내 THC 함량 분석을 위한 표준물질 준비를 간소화하기 위해 설계되었습니다. 본 문서에서 설명한 엄격한 공정 관리 및 제형 연구를 통해 안정적인 카나비노이드 혼합물을 제조하였습니다. 최적화된 원료 및 포장 공정을 통해 카나비노이드의 산화를 방지함으로써 장기 안정성을 지닌 CRM을 생산합니다. 실험실 간 시험 방법과 인증의 변동성을 고려할 때, 정확하고 추적 가능하며 적절히 인증된 CRM의 사용은 매우 중요합니다.

참고문헌

1. 2021. Establishment of a Domestic Hemp Production Program. [Internet]. 86 FR 5596, 5596-5691: Fed. Regist. Available from: https://www.federalregister.gov/d/2021-00967

2. AOAC SMPR^® 2019.003 Standard Method Performance Requirements (SMPRs) for Quantitation of Cannabinoids in Plant Materials of Hemp (Low THC Varieties Cannabis sp.). [Internet]. AOAC SMPR. Available from: https://www.aoac.org/wp-content/uploads/2019/10/SMPR-2019_003.pdf

3. AOAC 2018.11-2018 Quantitation of Cannabinoids in Cannabis Dried. AOAC Official Method.. [Internet]. AOAC Official Method of Analysis: Available from: http://www.aoacofficialmethod.org/index.php?main_page=product_info&products_id=3017

4. Sarma ND, Waye A, ElSohly MA, Brown PN, Elzinga S, Johnson HE, Marles RJ, Melanson JE, Russo E, Deyton L, et al. 2020. Cannabis Inflorescence for Medical Purposes: USP Considerations for Quality Attributes. J. Nat. Prod.. 83(4):1334-1351. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.9b01200

5. NIST Tools for Cannabis Laboratory Quality Assurance. May 1, 2019:[cited 10 Oct 2021]. Available from: https://www.nist.gov/programs-projects/nist-tools-cannabis-laboratory-quality-assurance

6. ISO 17034:2016. General requirements for the competence of reference material producers. ISO. [Internet]. Available from: https://www.iso.org/standard/29357

7. ISO/IEC 17025:2017. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. ISO. [Internet]. Available from: https://www.iso.org/standard/66912.html

8. ISO Guide 30:2015. Reference materials — Selected terms and definitions. ISO. [Internet]. Available from: https://www.iso.org/standard/46209.html