| Przyczyna | Rozwiązanie |
|---|
| Krew pobrana >24 godziny przed separacją | Użyj krwi pobranej od 2 do 6 godzin przed separacją. Krew pobrana w ciągu 24 godzin będzie trudniejsza do oddzielenia, a procent odzysku i żywotność będą niższe. |
| Krew uległa koagulacji z powodu braku antykoagulantu | Zaleca się stosowanie probówek próżniowych z odmierzoną ilością antykoagulantu. Użycie strzykawki (bez antykoagulantu) nie jest zalecane. |
| Krew uległa koagulacji z powodu niepełnego wymieszania | Sprawdź, czy probówki próżniowe z antykoagulantem są dobrze wymieszane po pobraniu krwi. |
| Używany antykoagulant nie nadaje się do stosowania w separacji Histopaque | Następujące antykoagulanty nadają się do stosowania z Histopaque:
- 15-30 jednostek heparyny na ml krwi pełnej
- 1.25-1,75 mg EDTA na ml krwi pełnej
ACA-A (Acid Citrate Dextrose formula A) może być stosowany jako antykoagulant. Po oddzieleniu, pasmo komórek jednojądrzastych będzie szersze niż w przypadku innych antykoagulantów. Jest to normalne i komórki mogą być użyte. |
| Próbka krwi jest zbyt ciepła i separacja została przeprowadzona zbyt szybko po pobraniu krwi | Zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami może być wynikiem tego, że krew nie ma temperatury pokojowej.
Po pobraniu krew powinna ostygnąć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30-45 minut. Jeśli zostanie użyta natychmiast po pobraniu, liczba pobranych komórek jednojądrzastych będzie niska. Procedury separacji są optymalne, gdy zarówno krew, jak i Histopaque mają temperaturę 18-20°C, z dopuszczalnym zakresem temperatur 18-26°C. |
| Próbka krwi rozcieńczona PBS o wysokim stężeniu soli | Historyczna technika separacji komórek stosowana z Histopaque obejmuje rozcieńczenie krwi PBS (1:1). Następnie stwierdziliśmy, że nie wszystkie preparaty PBS są odpowiednie do stosowania z Histopaque.
Roztwory zawierające 150 mM bufor fosforanowy i 150 mM chlorek sodu to roztwory PBS o stężeniu soli zbyt wysokim do stosowania z Histopaque. Wartości molowe PBS bliższe 10 mM fosforanu są bardziej odpowiednie do stosowania z Histopaque. Żywotność komórek pozostanie wyższa, gdy PBS o wysokim stężeniu soli zostanie zastąpiony odpowiednim podłożem do hodowli komórkowej. |
| Różnice w fizjologii krwi dawcy (gdy pojedyncza próbka ma gorszy odzysk) | Wysoki poziom lipidów, czynnik reumatoidalny, niedokrwistość i leczenie farmakologiczne są możliwymi przyczynami słabej separacji krwi konkretnego dawcy.
Jeśli osocze nie jest klarowne, wskazuje to na wysoki poziom lipidów. |
| Zanieczyszczenie próbki małego zwierzęcia innymi płynami lub ciałami stałymi | Krew uzyskana z krwawienia bezigłowego, np, poprzez pobranie próbki z ogona, jest często niedopuszczalna do użycia ze względu na obecność sierści i innych płynów ustrojowych w pobranej krwi. Często powoduje to uruchomienie kaskady krzepnięcia, powodując krzepnięcie.
Zaleca się uśmiercenie zwierzęcia i pobranie krwi przez aortę lub żyłę główną lub inne duże naczynie krwionośne. Alternatywnie, do pobierania krwi można użyć pediatrycznej rurki próżniowej. |
| Okluzja białych krwinek w próbkach o wysokim poziomie białych krwinek | Agregaty mogą tworzyć się, gdy czerwone krwinki wchodzą w kontakt z polisacharozą, powodując okluzję białych krwinek. Po uwięzieniu w tych agregatach białe krwinki przemieszczają się na dno probówki wirówki.
W przypadku rutynowych próbek krwi procent odzysku będzie często wyższy w przypadku nierozcieńczonej krwi. Jednak szpik kostny, krew pępowinowa i próbki od dawców z nienormalnie wysoką liczbą białych krwinek powinny być rozcieńczone, aby zmniejszyć rozmiar agregatów czerwonych krwinek i poprawić odzysk białych krwinek. |
| Nieprawidłowe rozcieńczenie krwi lub rozcieńczenie zanieczyszczonym PBS lub pożywką | .Gdy krew jest rozcieńczana przed załadowaniem na Histopaque®, istnieje prawdopodobieństwo, że bufor lub pożywka są niekompatybilne z Histopaque lub że PBS lub pożywka do hodowli komórkowej są zanieczyszczone.
Jeśli krew została rozcieńczona, a wydajność jest niska, należy powtórzyć eksperyment bez rozcieńczania próbki. |
| Rozcieńczanie przy użyciu pożywki do hodowli komórkowych zawierającej FBS lub inne białko nośnikowe | Podłoże do hodowli komórkowych bez FBS można zastąpić PBS podczas rozcieńczania próbek do użycia z Histopaque. Jeśli krew zostanie rozcieńczona pożywką do hodowli komórkowych zawierającą FBS, liczba odzyskanych komórek będzie niższa.
FBS można dodać do pożywki do hodowli w celu późniejszego płukania lub przechowywania po oddzieleniu komórek i co najmniej jednokrotnym płukaniu w celu usunięcia Histopaque. Po pierwszym płukaniu, dodanie białka takiego jak FBS do pożywki do płukania dodatkowo ochroni komórki przed uszkodzeniem. |
| Izolacja komórek z kożuszków przy użyciu Histopaque | Kożuszek jest przygotowywany poprzez pobranie krwi w odpowiednim antykoagulancie i odwirowanie. Czerwone krwinki opadną na dno probówki. Bezpośrednio na wierzchu warstwy czerwonych krwinek pojawi się szara warstwa. Ta szara warstwa to kożuch i reprezentuje wszystkie białe krwinki we krwi. Powyżej szarej warstwy będzie znajdować się osocze.
Płaszcze buffy przygotowane ze świeżej krwi nadają się do separacji przy użyciu Histopaque. Jeśli komórki mają kilka dni, np, jeśli kożuszki są uzyskane z oddanych jednostek krwi, komórki mogą nie zapewnić akceptowalnej wydajności.
Kożuszki muszą być rozcieńczone minimum 1:2 lub 1:4 przed załadowaniem do gradientu Histopaque. |
| Izolacja komórek z kożuszków przy użyciu probówek ACCUSPIN™ | Preparaty z kożuszków nie mogą być używane w probówkach ACCUSPIN. Probówki ACCUSPIN wymagają określonej ilości czerwonych krwinek do prawidłowego działania, a kożuszki nie zawierają wystarczającej ilości czerwonych krwinek do użycia w probówkach ACCUSPIN. |
