Kwantyfikacja DNA i RNA

Dokładne określenie stężenia kwasu nukleinowego i wydajności jest ważne dla dalszych zastosowań, w tym transfekcji, klonowania, PCR i sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Aplikacje te często mają określone docelowe stężenie kwasu nukleinowego dla optymalnej wydajności. Niedokładna kwantyfikacja może zwiększyć zmienność w dalszych testach i wpłynąć na jakość wyników. Kwantyfikację DNA i RNA można przeprowadzić przy użyciu dowolnej z poniższych metod:

• absorbancja UV (gęstość optyczna)
• Pomiar fluorescencji przy użyciu barwników wiążących kwasy nukleinowe
• .Elektroforeza w żelu agarozowym
• qPCR

Ilościowe oznaczanie DNA przy użyciu absorbancji UV

Najczęstszą techniką stosowaną do określania zarówno stężenia, jak i czystości kwasów nukleinowych jest absorbancja. Pomiary absorbancji mogą być wykorzystane do oszacowania stężenia DNA lub RNA w oczyszczonych próbkach. W tej metodzie próbka kwasu nukleinowego jest umieszczana w kuwecie kwarcowej, która jest następnie umieszczana w spektrofotometrze UV. Spektrofotometry o małej objętości, takie jak urządzenie NanoDrop™, spektrofotometr DeNovix DS-11 i spektrofotometr Blue-Ray Bio EzDrop, umożliwiają analizę próbek o objętości zaledwie 1 µL przy użyciu podstawek. Światło UV jest przepuszczane przez próbkę przy określonej długości ścieżki, a stężenie kwasów nukleinowych można bezpośrednio obliczyć, mierząc wartości absorbancji przy 260 nm względem próby ślepej przy użyciu równania Beera-Lamberta:

A = εcl

gdzie:

A = absorbancja UV
ε = współczynnik ekstynkcji zależny od długości fali
c = stężenie kwasu nukleinowego
l = droga światła (cm)

Współczynniki ekstynkcji*:

• dsDNA (czysty): 0,020 (µg/mL)^-1 cm^-1
• ssDNA (czysty): 0,027 (µg/mL)^-1 cm^-1
• ssRNA (czyste): 0,025 (µg/mL)^-1 cm^-1

*Należy zauważyć, że ten wzór jest ważny tylko dla dużych cząsteczek kwasów nukleinowych o proporcjonalnym składzie nukleotydów, takich jak genomowe DNA lub plazmidy. W przypadku oligonukleotydów i innych krótkich cząsteczek kwasów nukleinowych, takich jak miRNA, współczynnik ekstynkcji należy obliczyć na podstawie sekwencji oligonukleotydu.

Aby poprawić dokładność, pomiar A₂₆₀ jest często korygowany o zmętnienie (mierzone absorbancją przy 320 nm) przy użyciu następującego równania:

Stężenie (µg/ml) = (A₂₆₀ pomiar - A₃₂₀ pomiar) x współczynnik konwersji kwasu nukleinowego** x współczynnik rozcieńczenia

**Współczynnik konwersji dla dsDNA: 50 µg/ml
**Współczynnik konwersji dla ssDNA: 37 µg/ml
**Współczynnik konwersji dla ssRNA: 40 µg/ml

Całkowitą wydajność można następnie uzyskać, mnożąc stężenie kwasu nukleinowego przez końcową całkowitą objętość oczyszczonej próbki.

Wydajność DNA (µg) = stężenie DNA × całkowita objętość próbki (mL)

Pomiary absorbancji, zanieczyszczenia i czystość kwasów nukleinowych

Cząsteczki inne niż DNA lub RNA mogą absorbować światło w zakresie 260 nm. Aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi obecne w białkach absorbują światło przy 280 nm, co może wpływać na pomiary absorbancji przy 260 nm. Ponadto obecność guanidyny i innych soli chaotropowych lub rozpuszczalników, które są powszechnie stosowane w metodach oczyszczania DNA i RNA na bazie krzemionki do wiązania, absorbują światło przy 230 nm i mogą prowadzić do wyższych pomiarów absorbancji 260 nm poprzez krzyżowanie. Sugeruje to, że jeśli obecne są zanieczyszczenia, a liczba A₂₆₀ jest używana do obliczania wydajności, ilość DNA może być zawyżona.

Aby ocenić zanieczyszczenie białkami, należy określić stosunek absorbancji przy 260 nm (absorbancja kwasu nukleinowego) i 280 nm (absorbancja pierścieni aromatycznych w aminokwasach białkowych, chociaż fenol będzie również absorbował przy 280 nm). Wysokiej jakości DNA będzie miało stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ 1,7-2,0. Wysokiej jakości RNA będzie miało stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ ~2,0.

Czystość DNA (zanieczyszczenia białkowe) = A₂₆₀ odczyt ÷ A₂₈₀ odczyt

Do oceny zanieczyszczeń chemicznych można wykorzystać stosunek absorbancji przy 260 nm i 230 nm. Wiadomo, że pozostałości soli chaotropowych i rozpuszczalników organicznych, które mogą hamować PCR, absorbują światło w zakresie 230 nm. Stosunek A₂₆₀/A₂₃₀ powinien wynosić 1,5 dla zastosowań wrażliwych na zakłócenia chemiczne, w tym testów opartych na enzymach, takich jak qPCR i sekwencjonowanie. Im niższy stosunek, tym większa ilość związków organicznych lub soli chaotropowych w preparacie.

Czystość DNA (zanieczyszczenia chemiczne) = A₂₆₀ odczyt ÷ A₂₃₀ odczyt

Fluorometryczne metody kwantyfikacji

Metody fluorometryczne są powszechnie uważane za jedne z najczulszych dostępnych metod kwantyfikacji kwasów nukleinowych. Metody te wykorzystują barwniki fluorescencyjne, które interkalują i wiążą rowki kwasu nukleinowego, wiążą DNA lub RNA niespecyficznie lub selektywnie wiążą materiał nukleinowy. Różnice w charakterystyce widmowej fluoroforów związanych z kwasem nukleinowym umożliwiają następnie określenie stężenia próbki.

Każdy barwnik kwasu nukleinowego ma określoną długość fali wzbudzenia i emisji. Próbka DNA lub RNA jest mierzona za pomocą fluorometru, a stężenie kwasu nukleinowego jest następnie obliczane poprzez porównanie emisji fluorescencji próbki z krzywą fluorescencji wygenerowaną przy użyciu wzorców o znanym stężeniu kwasu nukleinowego. Różne typy próbek (genomowe DNA, plazmidowe DNA itp.) wymagają własnych krzywych standardowych. Podobnie jak w przypadku metod absorbancji, obliczone stężenia należy w razie potrzeby skorygować o współczynnik rozcieńczenia.

Rozważania przy wyborze fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego do oznaczania ilościowego:

• Specyficzność: różne barwniki są zoptymalizowane do pomiaru dsDNA, ssDNA, RNA lub małych RNA (np. miRNA) w oparciu o ich mechanizm działania, miRNA) w oparciu o ich mechanizm wiązania i właściwości spektralne - upewnij się, że wybrałeś barwnik fluorescencyjny, który wiąże się z celem zainteresowania


• Czułość: wysoce czułe barwniki fluorescencyjne pozwalają na użycie mniejszej ilości próbki lub pomiar bardzo niskich stężeń kwasu nukleinowego


• Zakres dynamiczny: niektóre odczynniki mogą być używane do wykrywania kwasu nukleinowego w niskich stężeniach, ale mogą tracić liniowość przy wyższych stężeniach; odczynnik, który ma być użyty, musi być odpowiedni dla oczekiwanego zakresu stężeń próbek


• Objętość próbki: jeśli objętość próbki jest ograniczona, należy zwrócić uwagę na objętość próbki wymaganą przez odczynnik lub zestaw


• Format próbki: niektóre odczynniki i zestawy zostały zoptymalizowane do pomiarów w pojedynczych probówkach lub kuwetach, podczas gdy inne są przeznaczone do stosowania w mikropłytkach w celu uzyskania większej przepustowości


• Filtry aparatury: sprawdź, czy twój fluorometr ma odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji dla wybranego barwnika

Oznaczanie ilościowe DNA i RNA metodą elektroforezy żelowej

Ponieważ elektroforeza w żelu agarozowym oddziela DNA i RNA od innych zanieczyszczeń, ta metoda kwantyfikacji eliminuje niektóre problemy związane z obliczeniami opartymi na pomiarach absorbancji. W elektroforezie w żelu agarozowym próbka wyizolowanego DNA lub RNA jest ładowana do studzienki żelu agarozowego, który jest umieszczany w polu elektrycznym. Ujemnie naładowany kwas nukleinowy migruje w kierunku anody, oddzielając fragmenty DNA i RNA według rozmiaru i kształtu. Dodatkową zaletą elektroforezy w żelu agarozowym jest możliwość wizualizacji zanieczyszczających pasm i ścinanych zanieczyszczeń w próbce. Stężenie i wydajność kwasu nukleinowego można określić poprzez porównanie intensywności pasm próbki ze standardami o znanej ilości. Ponieważ DNA i RNA absorbują światło przy 260 nm, intensywność można zmierzyć za pomocą transiluminatora UV. Wyższą czułość można uzyskać poprzez znakowanie próbek kwasów nukleinowych i wzorców barwnikiem kwasów nukleinowych, takim jak bromek etydyny lub SYBR® Green i pomiar intensywności przy określonej długości fali dla tego barwnika. Jeśli próbka nierozcieńczonego DNA o objętości 2 µL załadowana na żel ma taką samą intensywność jak wzorzec 100 ng, wówczas stężenie próbki wynosi 50 ng/µL (100 ng ÷ 2 µL). Standardy używane do oznaczania ilościowego powinny być tej samej wielkości co analizowany kwas nukleinowy próbki i podobnie oznakowane.

Rysunek 1. Elektroforeza przygotowanego DNA w żelu agarozowym. Pierwsze cztery pasy pokazują większe ścinanie lub zanieczyszczenia kwasem nukleinowym o niskiej masie cząsteczkowej w preparacie.

Kwantyfikacja metodą PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Real-time PCR lub ilościowa PCR (qPCR) wykorzystuje sondy fluorometryczne, które wiążą docelowe DNA podczas fazy annealingu PCR lub barwniki fluorescencyjne, które wiążą dwuniciowe DNA. Specjalistyczne termocyklery wyposażone w moduły detekcji fluorescencji są wykorzystywane do monitorowania sygnału fluorescencji podczas amplifikacji. Zmierzona fluorescencja jest proporcjonalna do całkowitej ilości DNA. Krzywa standardowa służy do określenia ilości docelowego DNA w badanych próbkach. Możliwe jest również zastosowanie cyfrowych metod PCR do ilościowego oznaczania DNA bez krzywej standardowej.

W przypadku ilościowego oznaczania RNA, matrycą PCR jest komplementarny DNA (cDNA), który uzyskuje się poprzez odwrotną transkrypcję RNA.

Jedną z kluczowych zalet PCR w czasie rzeczywistym jest możliwość ilościowego oznaczania określonych sekwencji docelowych w oparciu o ilość amplifikowalnego kwasu nukleinowego. Może to być korzystne w ilościowym określaniu genomowego DNA, gdzie ilości ściętego DNA i mniejszych fragmentów DNA i RNA obecnych w próbce są ignorowane w pomiarze. Inne korzyści obejmują wykrywanie inhibitorów w mieszaninie reakcyjnej i nieodłączną specyficzność sond fluorometrycznych.

Rysunek 2. Ilościowy PCR (qPCR) przeprowadzono przy użyciu barwnika fluorescencyjnego SYBR Green i 10-krotnych rozcieńczeń matrycy.

Wnioski

Odpowiednia metoda kwantyfikacji DNA lub RNA powinna być wybrana w oparciu o wiele czynników, w tym dostępność sprzętu, zamierzone dalsze zastosowanie i wydajność. Niektóre metody kwantyfikacji mają dodatkową zaletę polegającą na umożliwieniu określenia czystości biologicznej i chemicznej próbki. Należy zachować ostrożność przy porównywaniu wydajności różnych metod, ponieważ obecność zanieczyszczeń może prowadzić do zakłóceń w pomiarach, powodując zawyżenie lub zaniżenie wydajności.