โครมาโตกราฟี Thin Layer ประสิทธิภาพสูง: วิธีการวิเคราะห์ลายนิ้วมือที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพสำหรับพืชสมุนไพร

Tiên Do, Melanie Broszat, Matthias Nold

บทความจากนักวิเคราะห์วิเคราะห์ - ฉบับที่ 2

Ginsenosides เป็น saponins triterpene Ginsenosides ส่วนใหญ่ประกอบด้วยโครงกระดูก dammarane (คาร์บอน 17 ตัวในโครงสร้างสี่วงแหวน) ที่มีน้ำตาลต่างๆ (เช่นกลูโคส, Rhamnose, ไซโลสและ arabinose) ที่ติดอยู่กับตำแหน่ง C - 3 และ C - 20

มีการระบุ Ginsenosides มากกว่า 30 ชนิดและแบ่งออกเป็นสองประเภท:

   • 20 (S) - โปรโตพานาซาดิอล (PPD) (Rb1, Rb2, Rb3, RC, Rd, Rg3, Rh2, RS1)
   • 20 (S) -protopanaxatriol (PPT) (Re, RF, Rg1, RG2, RH1) ความแตกต่างระหว่าง PPTs
     และ PPDs คือการปรากฏตัวของกลุ่มคาร์บอกซิลที่ตำแหน่ง C 6 ใน PPDs

รูปที่ 1

นอกจากนี้ยังมีการระบุหา ginsenosides ที่หายากหลายอย่างเช่น ocotillol saponin F11 (24 R-pseudoginsenoside) และ oleanane saponin RO pentacyclic (3,28 o-bissemoside) โสมเอเชีย (Panax ginseng) เป็นที่รู้จักกันทั่วไปว่าเป็นโสมที่แท้จริง

ในบทความนี้มีการนำเสนอวิธีการ HPTLC ที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ Ginsenosides โดยใช้อุปกรณ์ CAMAG, แผ่น MilliporSigma TLC มาตรฐานการวิเคราะห์และสารสกัดจากเอกสารอ้างอิง วัสดุอ้างอิงสารสกัดผลิตโดย HWI Analytik และจำหน่ายโดย MilliporeSigma เท่านั้น

การตรวจหา Ginsenosides ในลายนิ้วมือ HPTLC ของสายพันธุ์ Panax ที่แตกต่างกัน (รากและสารสกัดจากราก) จะได้รับโดยทำตามวิธี HPTLC ของ pH ยูโร Monograph,¹ USP DSC 2015 Monograph 2 และวิธีการของสมาคม HPTLC (สมาคมระหว่างประเทศเพื่อความก้าวหน้าของ HPTLC)³ โดยการเปรียบเทียบค่า RF และสีของสารอ้างอิงและโซนการจับคู่ในสารสกัดจากราก ขึ้นอยู่กับกฎระเบียบที่ปฏิบัติตามหนึ่งในสามวิธีการของการระบุตัวตนสามารถนำมาใช้

อุปกรณ์ CAMAG ที่แนะนำ:

เครื่องเก็บตัวอย่าง TLC อัตโนมัติ (ATS 4), ห้องพัฒนาอัตโนมัติ (ADC 2), TLC Visualizer 2 อุปกรณ์การแช่ Chromatogram 3 เครื่องทำความร้อนแผ่น TLC 3 และ VisionCATS

รีเอเจนต์การรับค่า:

Anisaldehyde 1 หรือกรดซัลฟูริก^2,3

ตัวอย่าง:

0.015 กรัม/มล. สารสกัด (สารสกัดจาก HWI) ใน  methanol1 70  หมายเหตุ: การเบี่ยงเบนจากวิธีที่ 2 และ 3 สำหรับการเตรียมตัวอย่าง

มาตรฐาน:

สารละลายมาตรฐานของ Ginsenosides ได้รับการเตรียมในความเข้มข้น 0.5 mg/mL ในเมทานอล

หมายเหตุ: การเบี่ยงเบนจากวิธีที่ 3 สำหรับโวลุ่มแอปพลิเคชัน

โครมาโตกราฟีตาม USP < 203 > ⁴:

ระยะหยุดนิ่ง: HPTLC Si 60 F254 20 x 10 ซม. (MilliporeSigma)

การประยุกต์ใช้ตัวอย่าง: 4 µL แต่ละสารละลายทดสอบและมาตรฐาน 2 µL ถูกนำไปใช้เป็นแถบ 8 มม., 8 มม. จากขอบล่าง, 20 มม. จากขอบซ้าย^{1, 3}

หมายเหตุ: การเบี่ยงเบนจากวิธีที่ 3 สำหรับการเตรียมตัวอย่างและปริมาณการใช้สารละลายอ้างอิงและการทดสอบ

4 µL แต่ละสารละลายทดสอบและ 4 μ m ของมาตรฐานจะถูก µL ไปใช้เป็นแถบ 8 มม., 8 มม. จากขอบล่าง, 20 มม. จากขอบด้านซ้าย²

หมายเหตุ: การเบี่ยงเบนจากวิธีที่ 2 สำหรับการเตรียมตัวอย่าง

การพัฒนาตัวทำละลาย: เอทิลอะซิเตท - น้ำ - บิวทานอล 1: 50: 25 (v/v/v) - ชั้นบน¹

Dichloromethane - เอทานอล - น้ำ 70: 45: 6.5 (v/v/v)²

คลอโรฟอร์ม - เอทิลอะซิเตท - เมทานอล - น้ำ 1: 2: 22: 15 (v/v/v/v) 40³

การพัฒนา: ใน ADC 2 ที่มีห้องไม่อิ่มตัวและหลังจากปรับสภาพที่ความชื้นสัมพัทธ์ 33% เป็นเวลา 10 นาทีโดยใช้สารละลายอิ่มตัวของแมกนีเซียมคลอไรด์¹

การพัฒนาจะดำเนินการกับ ADC 2 อิ่มตัวเป็นเวลา 20 นาทีด้วยตัวทำละลายที่กำลังพัฒนา (กระดาษกรอง) ก่อนการพัฒนาจานจะถูกปรับสภาพเป็นเวลา 10 นาทีถึงความชื้นสัมพัทธ์ 33% (ด้วยสารละลายอิ่มตัวของ MgCl2)^{2 3}

ระยะการพัฒนา: 70 มม. (จากขอบล่าง)^{1 2}80 มม. (จากขอบล่าง)³

การอบแห้งแผ่น: 5 นาทีในกระแสของอากาศเย็น

การแปลงค่า: แผ่นถูกแช่ (ความเร็วในการแช่: 3 ซม./ วินาที, เวลาแช่ภาพ: 0 s) เป็นตัวทำปฏิกิริยาแอนไอซาล ดีไฮด์ (ส่วนผสมของ 0.5 มล. o FP -anisaldehyde กรดอะซิติกน้ำแข็ง 10 มล. เมทานอล 85 มล. และกรดซัลฟิวริก 5 มล.) ด้วยอุปกรณ์แช่โครมาโตแกรม 3 และให้ความร้อนเป็นเวลา 5 นาทีที่ 105°C¹

แผ่นจะจุ่มลงในน้ำ (ความเร็วในการจุ่ม: 3 ซม./ วินาที, เวลาแช่ภาพ: 0 s) เป็นตัวทำปฏิกิริยากรดซัลฟูริก (ร้อยละ 10 ในเมทานอล) ด้วยอุปกรณ์แช่โครมาโตแกรม 3 และให้ความร้อนเป็นเวลา 5 นาทีที่ 100°C^{2 3}

การประเมินผล: เอกสารภายใต้วิธีที่ 3 มีแสงสีขาว 100°C    2 2 3 และ UV 366 nm 2 3 หลังจากการสร้างอนุพันธ์ด้วย TLC Visualizer 1

ผลลัพธ์และการอภิปราย:

HPTLC โครมาโตแกรมของมาตรฐาน Ginsenoside และ  สารสกัดจาก Panax Ginsen Groot

โครมาโตแกรม HPTLC หลังจากการแปลงค่า แทร็ค

1 - 17: Ginsenosides, แทร็ก 18: Protopanaxadiol, แทร็ก 19:  สารสกัดจาก Panax ginsen Groot (หมายเลขบทความ: 05115001 batch: หมายเลขรุ่น: HWI01294)

วิธีที่ 1 According to the Ph. ยูโร

โครมาโตแกรม HPTLC ภายใต้แสงสีขาวหลังจากการแปลงค่า

วิธีที่ 2 ตามวิธีการโสม Tienshi จาก

โครมาโตแกรม HPTLC ภายใต้รังสียูวี 366 นาโนเมตรและภายใต้แสงสีขาวหลังจากการสร้างอนุพันธ์

วิธีที่ 3 ตามที่สมาคม HPTLC

โครมาโตแกรม HPTLC ภายใต้รังสียูวี 366 นาโนเมตรและภายใต้แสงสีขาวหลังจากการสร้างอนุพันธ์

HPTLC โครมาโตแกรมของพืชที่มี Ginsenosides (สายพันธุ์ Panax ที่แตกต่างกัน)

พี. โสม, พี. quinquefolium, พี. notoginseng, พี. japonicus, พี. vietnamensi รากและสารสกัดจากรากถูกรวบรวมและวิเคราะห์     สารสกัดจาก P. Ginsen Groot (หมายเลขบทความ: 0511 - 50-01 ชุด: HWI01294) ถูกใช้เป็นวัสดุอ้างอิงทางพฤกษศาสตร์เพื่อระบุโสมเอเชีย (ควรมี Ginsenoside RF และ F11 ขาด)

วิธีที่ 1 According to the Ph. ยูโร

HPTLC โครมาโตแกรมภายใต้แสงสีขาวหลังจากการแปลงค่า

ติดตาม 1: Ginsenoside RF (ลูกศรสีเขียว); 2: Ginsenoside F11 (ลูกศรสีแดง); 3: พี. สารสกัดจาก Ginsen Groot (  หมายเลขบทความ: 0511 - 50-01 ชุด: HWI01294, Ginsenoside RF เน้นด้วยลูกศรสีเขียว); 4: รากโสม (ginsenoside RF เน้นด้วยลูกศรสีเขียว); 5 พี. quinquefoliu mroot extract (โสมอเมริกัน Ginsenoside F11 เน้นด้วยลูกศรสีแดง);
6: P quinquefoliu mroot (โสมอเมริกัน Ginsenoside F11 เน้นด้วยลูกศรสีแดง);  7 P. notoginsen สารสกัดจากราก ;
8: พี. notoginsen ราก ; 9: พี. japonica ราก ; 10: พี. vietnamensi ราก ; 11: รากโสมเวียดนามป่า

วิธีที่ 2 ตามวิธีการโสม Tienshi จาก

โครมาโตแกรม HPTLC ภายใต้รังสียูวี 366 นาโนเมตรและภายใต้แสงสีขาวหลังจากการสร้างอนุพันธ์

วิธีที่ 3 ตามที่สมาคม HPTLC

โครมาโตแกรม HPTLC ภายใต้รังสียูวี 366 นาโนเมตรและภายใต้แสงสีขาวหลังจากการสร้างอนุพันธ์

วิธีที่ 2 และ 3 พารามิเตอร์:

HPTLC โครมาโตแกรมภายใต้แสงสีขาวและ UV 366 นาโนเมตรหลังจากการสร้างอนุพันธ์ด้วย Ginsenoside RF (ลูกศรสีเขียว) และ Ginsenoside F11 (ลูกศรสีแดง)

ติดตาม 1 : พี. สารสกัดจาก Ginsen Groot (หมายเลขบทความ: 05115001 batch: HWI01294, Ginsenoside RF เน้นด้วยลูกศรสีเขียว); 2: p ginsen groot (ginsenoside RF เน้นด้วยลูกศรสีเขียว); 3: p quinquefoliu mroot extract (โสมอเมริกัน Ginsenoside F11 เน้นด้วยลูกศรสี     แดง); 4: P quinquefoliu mroot (โสมอเมริกัน Ginsenoside F11 เน้นด้วยลูกศรสีแดง); 5 P.  notoginsen   สารสกัดจากราก ; 6: พี. notoginsen ราก ; 7: พี. japonica ราก ; 8: พี. vietnamensi ราก ;
9: รากโสมเวียดนามป่า

วิธีการที่แสดงทั้งหมดเหมาะสำหรับการตรวจจับ Ginsenosides ในสายพันธุ์ Panax ที่แตกต่างกัน Ginsenoside RF เป็นเอกลักษณ์ของโสมเอเชียในขณะที่ F11 พบเฉพาะในโสมอเมริกัน ดังนั้นอัตราส่วน RF/F11 จึงถูกใช้เป็นเครื่องหมาย phytochemical เพื่อแยกแยะโสมอเมริกันจากโสมเอเชีย ในวัสดุอ้างอิงทางพฤกษศาสตร์ที่ใช้ ( สารสกัดจาก Panax ginsen Groot, หมายเลขบทความ: 0511 50 01) การปรากฏตัวของ RF และการขาด F11 สามารถยืนยันได้ด้วยวิธีการทั้งหมดและจึงเหมาะสำหรับการระบุโสมเอเชีย

วิธีที่ 1 และ 2 มี  ข้อได้เปรียบ  ในการ  ที่  พวกเขาเป็นไปตาม monographs อย่างเป็นทางการในเภสัชตำรับ (ph. ยูโร RESP USP) วิธีที่ 3 เป็นวิธีอื่นที่สมาคม HPTLC ให้ไว้ วิธีการนี้ได้รับการปรับปรุงสำหรับการแยก RF และ F11 เพื่อให้แยกแยะโสมอเมริกันและเอเชียได้ดีขึ้น การสร้างอนุพันธ์ด้วยตัวทำปฏิกิริยากรดซัลฟูริก (วิธีที่ 2 และ 3) นำไปสู่โซนสีที่แตกต่างกันภายใต้ UV 366 nm ซึ่งมีประโยชน์สำหรับการระบุตัวตน

ข้อมูลอ้างอิง

1. 2008. Ginseng root: Monograph in Ph. Eur. 8.0. European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare.. 01. Strasbourg: France.

2. 2017. Tienchi Ginseng Root and Rhizome Dry Extract: Monograph in USP 40-NF35. United States Pharmacopeial Convention. USA: Rockville, MD.

3. 2016. HPTLC identification method for Panax ginseng, HPTLC Association (www.hptlc-association.org).

4. 2016. High-Performance Thin-Layer Chromatography Procedure for Identification of Articles of Botanical Origin in USP 39-NF34. United States Pharmacopeial Convention.. USA: Rockville, MD.