การเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์ PCR

คู่มือทางเทคนิคของ PCR Technologies

ในหน้านี้

• การปรับสภาพ PCR ให้เหมาะสม
  
• กำลังตรวจสอบการออกแบบไพรเมอร์
• ปรับความเข้มข้นของโพรบให้เหมาะสม
• การเพิ่มประสิทธิภาพส่วนประกอบปฏิกิริยาและการวิเคราะห์มัลติเพล็กซ์
• การเพิ่มประสิทธิภาพ ความเข้มข้นของ Mg2+
• ตรวจสอบการเลือกฟลูออโรฟิลและควินเชอร์
• แนวทางการเพิ่มประสิทธิภาพของ PCR การถอดความแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ (RT-qPCR)
• Assay Evaluation

การปรับสภาพ PCR ให้เหมาะสม

การเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์เป็นสิ่งสำคัญแม้ว่าจะใช้การวิเคราะห์ที่ได้รับการออกแบบไว้ล่วงหน้าและได้รับมาในเชิงพาณิชย์ก็ตาม การปรับให้เหมาะสมเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อให้แน่ใจว่าการวิเคราะห์มีความละเอียดอ่อนตามที่จำเป็นและมีความเฉพาะเจาะจงกับเป้าหมายที่สนใจ ตัวอย่างเช่นการตรวจหาเชื้อโรคหรือการจัดทำโปรไฟล์นิพจน์ของ mRNAs ที่หายากต้องการความไวสูงการตรวจจับ SNP ต้องการความจำเพาะสูงและปริมาณไวรัสต้องการทั้งความจำเพาะสูงและความไวสูง การวิเคราะห์ที่ต้องการความจำเพาะสูงจะมีความเสี่ยงเป็นพิเศษเมื่อดำเนินการโดยไม่มีการเพิ่มประสิทธิภาพและการควบคุมที่เพียงพอ ในทำนองเดียวกันเมื่อมีการตรวจจับชิ้นงานหลายชิ้นพร้อมกันในปฏิกิริยามัลติเพล็กซ์เงื่อนไขการวิเคราะห์จะต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมเพื่อตรวจจับชิ้นงานทั้งหมดอย่างเท่าเทียมกัน การตรวจสอบให้ข้อมูลที่จำเป็นในการพิสูจน์การใช้งานอย่างต่อเนื่องของการวิเคราะห์ในโครงการวิจัยต่อไป¹

มีหลายปัจจัยที่สามารถเปลี่ยนแปลงได้เพื่อให้ได้ประสิทธิภาพการวิเคราะห์ที่ดีที่สุดและนำไปสู่ความไวโมเลกุลความจำเพาะและความแม่นยำที่สูงขึ้น การวิเคราะห์ที่ซื้อจากผู้ให้บริการเชิงพาณิชย์ที่มีทักษะยังคงต้องการการตรวจสอบภายในห้องปฏิบัติการที่ใช้งานอยู่ การอ้างสิทธิ์ที่เกี่ยวข้องกับประสิทธิภาพของการวิเคราะห์ควรได้รับการตรวจสอบภายใต้เงื่อนไขของการศึกษารวมถึงตัวอย่างการทดสอบน้ำยาเฉพาะและเครื่องมือที่เลือก

การวิเคราะห์ที่ได้รับการออกแบบมาเพื่อให้ตรงตามเกณฑ์การออกแบบที่ต้องการทั้งหมด (การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR)มีแนวโน้มที่จะทำงานได้ดีภายใต้สภาวะที่หลากหลาย อย่างไรก็ตามการวิเคราะห์ทั้งหมดจะมีชุดของสภาวะที่เหมาะสมที่สุดและขึ้นอยู่กับอุปกรณ์รีเอเจนต์ที่เลือก (เงื่อนไขบัฟเฟอร์) ความเข้มข้นของไพรเมอร์และ/หรืออุณหภูมิการหลอม (_ตา) ความเข้มข้นของแมกนีเซียมและอัตราการเพิ่มขึ้น เนื่องจากเป็นเรื่องปกติที่จะทำการทดสอบบนเครื่องมือที่เลือกและภายใต้เงื่อนไขบัฟเฟอร์มาตรฐานขั้นตอนการเพิ่มประสิทธิภาพส่วนใหญ่จะมุ่งเน้นไปที่การปรับเปลี่ยนจลนศาสตร์ที่มีผลผูกพันของไพรเมอร์โดยใช้ความเข้มข้นของไพรเมอร์หรืออุณหภูมิหลอม (TA)/อุณหภูมิหลอม_(TM)

ไม่ว่าเป้าหมายจะเป็น DNA (QPCR) หรือ RNA (RT-qPCR) ขั้นตอนเบื้องต้นต่อไปนี้จะช่วยให้มั่นใจว่าการวัดปริมาณจะประสบความสำเร็จ:

• กำลังตรวจสอบการออกแบบไพรเมอร์
  
• การเพิ่มความเข้มข้นของไพรเมอร์
  
• การเพิ่มประสิทธิภาพอุณหภูมิการหลอมรองพื้น
• ปรับความเข้มข้นของโพรบให้เหมาะสม
  
• การเพิ่มประสิทธิภาพส่วนประกอบปฏิกิริยาและเงื่อนไขมัลติเพล็กซ์
  
• การตรวจสอบประสิทธิภาพด้วยการวิเคราะห์เส้นโค้งมาตรฐานและเส้นโค้งละลาย

กำลังตรวจสอบการออกแบบไพรเมอร์

การตรวจสอบการออกแบบไพรเมอร์มีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อใช้ไพรเมอร์จากสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าหรือใช้การวิเคราะห์ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ การออกแบบไพรเมอร์สามารถตรวจสอบได้ในส่วนที่เกี่ยวกับแนวทางการออกแบบการวิเคราะห์ที่ระบุไว้ในการ ออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR เป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งที่จะต้องแน่ใจว่า:

• ไพรเมอร์มีความเคารพต่อลำดับเป้าหมายที่ต้องการ
  
• สีรองพื้นแบบกลับด้านถูกต้อง ตรวจสอบคำสั่งพื้นฐานของส่วนประกอบย้อนกลับ (usin ghtttp:// www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html) อย่างระมัดระวัง
  
• ตรวจพบสายเชื่อมต่อที่เหมาะสม
  
• หลีกเลี่ยง SNPs เว้นแต่จำเป็นสำหรับการวิเคราะห์
  
• oligos และ amplicon ไม่ได้นำมาใช้โครงสร้างรอง
  
• มีศักยภาพต่ำสำหรับ oligos ของปฏิกิริยาที่จะผสมกับแต่ละอื่นๆ

Primer dimer

ความสามารถของไพรเมอร์ในการผสมสีเข้าด้วยกันโดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงปลายปี 3 อาจนำไปสู่การยืดสีรองพื้นในระหว่าง PCR และการก่อตัวของผลิตภัณฑ์ที่เป็นอิสระตามเป้าหมายหรือที่เรียกว่าไพรเมอร์ไดเมอร์ เมื่อใดก็ตามที่มีการผลิตและขยายผลิตภัณฑ์ไพรเมอร์ไดเมอร์พวกเขาจะเบี่ยงเบนส่วนประกอบของปฏิกิริยาออกไปจากการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการซึ่งจะช่วยลดประสิทธิภาพและความไวในการวิเคราะห์ ดังนั้นไพรเมอร์ไดเมอร์จึงเป็นปัญหาในการเกิดปฏิกิริยาโดยใช้การตรวจจับสีย้อมทั้งที่ใช้โพรบและ SYBR Green I ด้วยการตรวจจับโดยใช้สีย้อมเช่น SYBR Green I ไพรเมอร์ไดเมอร์ยังมีผลต่อความจำเพาะของการวิเคราะห์เนื่องจากสีย้อมที่มีผลผูกพันดีเอ็นเอที่ไม่เฉพาะเจาะจงจะจับกับไพรเมอร์และถูกตรวจจับพร้อมกับผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ ดังนั้นจึงควรหลีกเลี่ยงไพรเมอร์ที่มีแนวโน้มที่จะเกิดเป็นไพรเมอร์ไดเมอร์

Primer dimer prediction

ในการตรวจสอบศักยภาพในการสร้างไพรเมอร์ - ไดเมอร์ให้ใช้ซอฟต์แวร์การออกแบบไพรเมอร์เพื่อวิเคราะห์การก่อตัวแบบดูเพล็กซ์ OligoArchitec ให้รายละเอียดเกี่ยวกับความแข็งแรงของการผสมด้วยตนเองและข้ามการผสมข้าม (รูปที่ 9.1) นักประ ΔG ≥ขั้ว 3’ที่เกิดขึ้นจากการผสมสีรองพื้นกับตัวเองหรือกับคู่ของมันจะต้องอ่อนแอมาก (μ m – 2.0 kcal, รูปที่ 9.1)

คุณจะลดไพรเมอร์ไดเมอร์ได้อย่างไร ?

ควรหลีกเลี่ยงไพรเมอร์ที่มีทั้งเทอร์มินัล ΔG < – 2.0 kcal และ 3 '-end แบบขยายได้ (ทับซ้อน 5 ') การหรี่ไฟโดยรวมที่แรงที่สุดควรไม่เสถียร (ΔG ≥– 6.0 กิโลแคลอรี) ในการหลีกเลี่ยงการใช้เครื่องปรับความเร็วรอบ 3 นิ้วที่มีความแรงในการทำงานสูงในขณะที่ยังคงรักษาความจำเพาะให้เลือกไพรเมอร์ที่มีสารตกค้าง 2 G หรือ C ในฐาน 5 ตัวสุดท้าย 1 G หรือ C ในฐาน 3ตัวสุดท้ายและ A หรือ T ที่ปลาย 3 (รูปที่ 9.1)

รูปที่ 9.1 การวิเคราะห์ไพรเมอร์สำหรับศักยภาพไพรเมอร์ - ไดเมอร์ ลำดับไพรเมอร์ได้รับการวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์การออกแบบ OligoArchitect เพื่อกำหนดความสามารถในการสร้างสำเนา มีการแสดงศักยภาพในการปรับตัวเองและปรับระดับสีข้ามเพื่อให้ได้ตัวเลือกสีรองพื้นที่ดีที่สุด multiplex qPCR จะให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดถ้าไพรเมอร์ทั้งหมดในปฏิกิริยามีอุณหภูมิหลอมเหลวที่คล้ายกัน (TM แตกต่าง≤ 2°C) และไม่ก่อให้เกิด 3 '-duplexes ที่แข็งแกร่ง (ΔG ≥– 2.0 กิโลแคลอรี)

การเพิ่มประสิทธิภาพความเข้มข้นของไพรเมอร์และอุณหภูมิการหลอม (_ตา)

เมื่อปรับสภาพการวิเคราะห์ให้เหมาะสมโดยใช้ความเข้มข้นของ _{สีรองพื้น} จะเลือก Ta คงที่ (ปกติจะเป็น 60°C) และเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุดสำหรับสีรองพื้นแต่ละตัวจะได้รับการจัดการอย่างอิสระ นี่เป็นสิ่งสำคัญเมื่อออกแบบการทดสอบที่จะทำงานใน multiplex เนื่องจากปฏิกิริยาทั้งหมดจะต้องทำงานที่อุณหภูมิหลอมเดียวกันและเป็นกลยุทธ์ที่สามารถใช้เพื่อช่วยเหลือการวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพไม่ดีซึ่งการออกแบบทางเลือกไม่สามารถใช้งานได้ วิธีการที่ง่ายกว่าทางเทคนิคคือการเลือกความเข้มข้นของไพรเมอร์คงที่แล้วเพิ่มประสิทธิภาพ _Ta เลือกผลลัพธ์ที่ดีที่สุดสำหรับไพรเมอร์เหล่านั้นในการรวมกัน วิธีนี้เป็นวิธีที่ควรใช้เมื่อใช้การวิเคราะห์หลายครั้งและการตรวจจับสีย้อมที่มีผลผูกพัน   กับ dsDNA เช่น SYBR ® Green I. อย่างไรก็ตามวิธีการนี้จำเป็นต้องใช้เครื่องมือที่สามารถเรียกใช้โปรแกรมปฏิกิริยาพร้อมกันโดยใช้ตัวเลือก Ta ที่แตกต่างกัน

การเพิ่มความเข้มข้นของไพรเมอร์

เมื่อใช้ qPCR ที่ใช้โพรบจะได้ผลลัพธ์ที่น่าพอใจโดยใช้ความเข้มข้นสุดท้ายของไพรเมอร์ทั้งสองที่ 500 นิวตันเมตรและโพรบที่ 250 นิวตันเมตรโดยเฉพาะอย่างยิ่งหากมีชิ้นงาน PCR มากและไม่จำเป็นต้องใช้ความไวสูงสุด ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่ค่อนข้างต่ำกว่าระหว่าง 200 นิวตันเมตรและ 400 นิวตันเมตรโดยทั่วไปจะดีกว่าเมื่อใช้การตรวจจับด้วยสีย้อม SYBR Green I เพื่อลดการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงและเมื่อเพิ่มประสิทธิภาพปฏิกิริยา multiplex ในการตรวจสอบว่าสภาวะมาตรฐานเหมาะสมสำหรับการใช้งานให้ทำการวิเคราะห์เส้นโค้งมาตรฐาน (ดู การประเมินการทดสอบ) หากการตรวจจับเป็นแบบเส้นตรงสามารถทำซ้ำได้และมีการไล่ระดับสีอยู่ระหว่าง– 3.2 และ– 3.5 ในช่วงความเข้มข้นเป้าหมายที่คาดว่าจะได้รับในตัวอย่างอาจไม่จำเป็นต้องเพิ่มความเข้มข้นของไพรเมอร์และโพรบให้มากขึ้น

ข้อบ่งชี้บางอย่างที่บ่งชี้ว่าการวิเคราะห์ไม่ได้รับการปรับให้เหมาะสมที่สุดคือไม่มีความสามารถในการทำซ้ำระหว่างการทำซ้ำและโดยทั่วไปแล้วไม่มีประสิทธิภาพและไม่ไวต่อความรู้สึก ประสิทธิภาพการทดสอบมักจะถูกทดสอบที่ช่วงของความเข้มข้นของไพรเมอร์ตัวอย่างเช่นจาก 50 – 800 นิวตันเมตรโดยใช้ไพรเมอร์แต่ละตัวที่ความเข้มข้นแต่ละ (รูปที่ 9.2สำหรับ โปรโตคอลแบบเต็มดูภาคผนวก A, โปรโตคอล ; การเพิ่มประสิทธิภาพของไพรเมอร์)

รูปที่ 9.2 ตัวอย่างการเพิ่มประสิทธิภาพไพรเมอร์ เค้าโครงของแถบทดสอบ 8 หลอด (ด้านบนและด้านซ้าย) และแผ่น PCR สำหรับการเจือจางและการจ่ายไพรเมอร์

การรวมกันของความเข้มข้นทำให้เกิด _{Cq ต่ำ} สุดการเปลี่ยนแปลงต่ำสุดในการทำซ้ำและเลือก NTC ลบ (รูปที่ 9.3)²

รูปที่ 9.3 ผลลัพธ์จากการเพิ่มประสิทธิภาพความเข้มข้นของไพรเมอร์ PCR จากการวิเคราะห์สีย้อม SYBR Green I ก) แนวทางที่กำหนดไว้แนะนำว่ามีการทดสอบความเข้มข้นของสีรองพื้นไปข้างหน้า (F) และถอยหลัง (R) ที่หลากหลาย ในตัวอย่างนี้ 50 Nm ถึง 600 Nm ได้รับการทดสอบร่วมกันเพื่อกำหนดความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ ในการทดลองนี้มีความแตกต่างอย่างมากใน Cq เนื่องจากความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นว่าสิ่งนี้สามารถส่งผลกระทบต่อข้อมูลขั้นสุดท้าย (ข้อมูลจาก Jens Stolte, EMBL) ได้อย่างไร ข) การทดลองนี้แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มประสิทธิภาพของการวิเคราะห์ที่ออกแบบมาอย่างดีและความแปรปรวนเนื่องจากความเข้มข้นของไพรเมอร์ ค่าผสมสีรองพื้นแบบเดินหน้าและถอยหลัง 400 นิวตันเมตรได้รับเลือกให้เหมาะสมที่สุดเนื่องจากค่าผสมนี้แสดงถึงความเข้มข้นของสีรองพื้นต่ำสุดที่ให้ค่า Cq แรกสุดในขณะที่ยังคงเส้นโค้ง sigmoidal ไว้

หากเป้าหมายหนึ่งในปฏิกิริยามัลติเพล็กซ์มีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าเป้าหมายอื่นๆหรือหากคู่ไพรเมอร์หนึ่งให้ _{Cq ที่ต่ำ} กว่าอีกคู่หนึ่งการขยายเป้าหมายนั้นอาจมีอิทธิพลเหนือปฏิกิริยาโดยใช้ส่วนประกอบปฏิกิริยาขึ้นก่อนที่เป้าหมายอื่นๆจะสามารถตรวจจับได้ การปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์อาจช่วยให้การขยายตัวของชิ้นงานทั้งหมดมีความสมดุลมากขึ้น เพื่อตรวจสอบว่าการปรับดังกล่าวจะเป็นประโยชน์หรือไม่ให้เตรียมเส้นโค้งมาตรฐาน (ดู การประเมินผลการทดสอบ) ที่ครอบคลุมช่วงของเป้าหมายที่คาดไว้สำหรับคู่รองพื้นแต่ละคู่เพียงอย่างเดียว (singleplex) และด้วยไพรเมอร์ทั้งหมดรวมกัน (multiplex) หากปฏิกิริยา multiplex และ singleplex ให้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันความเข้มข้นของไพรเมอร์จะเหมาะสม ในทางกลับกันการปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์ให้เหมาะสมมีแนวโน้มที่จะปรับปรุงผลลัพธ์หากความไวไม่สามารถยอมรับได้ในปฏิกิริยามัลติเพล็กซ์ ลดความเข้มข้นของไพรเมอร์สำหรับคู่ไพรเมอร์ที่ส่งผลให้  ค่า Cq ต่ำและ/หรือเพิ่มความเข้มข้นสำหรับผู้ที่ให้  ค่า Cq สูงภายในช่วง 50 – 500 นิวตันเมตร

การเพิ่มประสิทธิภาพอุณหภูมิการหลอมรองพื้น

โดยทั่วไปแล้วการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณจะดำเนินการโดยใช้โปรแกรมการขี่จักรยานอุณหภูมิสองหรือสามขั้นตอนซึ่งโดยปกติจะมีรอบ 35 – 40 รอบ ปฏิกิริยาแบบสองขั้นตอนระหว่างอุณหภูมิสองระดับโดยปกติจะเป็น 95°C (โดยทั่วไปคือ 10 – 15 วินาที) และ 60°C (โดยทั่วไปคือ 30 – 60 วินาทีหรือ 5 – 10 วินาทีภายใต้สภาวะที่รวดเร็ว) เลือกปฏิกิริยาอุณหภูมิแบบสองขั้นตอนเมื่อรันการวิเคราะห์ Probe (TaqMan หรือ Hydrolysis) ที่มีป้ายกำกับแบบ Dual เนื่องจากการยืดตัวของอุณหภูมิที่ต่ำกว่าจะส่งเสริมกิจกรรม exonuclease ของ DNA polymerase และไม่สนับสนุนการเคลื่อนที่ของโพรบ นี่จะเป็นโปรโตคอลสภาพการขี่จักรยานที่ได้รับความนิยมสำหรับการทำการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันภายใต้พารามิเตอร์เดียวกัน อย่างไรก็ตามข้อเสียของการใช้วิธีการสองขั้นตอนคือการลดตัวเลือกที่อาจเกิดขึ้นสำหรับการออกแบบไพรเมอร์และจำกัดการเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบเพื่อความเข้มข้นของไพรเมอร์เพียงอย่างเดียวเนื่องจากไม่มีการเพิ่มประสิทธิภาพการหลอม (ตา)

ควรใช้โปรโตคอลการขี่จักรยานสามขั้นตอนเมื่อลำดับเป้าหมายมีความซับซ้อนและไพรเมอร์ที่เลือกนั้นยากที่จะปรับให้เหมาะสมหรือระบบการตรวจจับที่ใช้อยู่ไม่ขึ้นอยู่กับการใช้โพรบไฮโดรไลซิส วงจรกลยุทธ์สามขั้นตอนระหว่าง: 95°C (โดยทั่วไปคือ 10 วินาที) อุณหภูมิการหลอม (ระหว่าง 55°C และ 65°C โดยทั่วไปคือ 10 – 20 วินาทีหรือ 5 วินาทีภายใต้สภาวะที่รวดเร็ว) และ 72°C (โดยทั่วไปคือ 20 – 30 วินาทีหรือ 15 – 20 วินาทีภายใต้สภาวะที่รวดเร็ว) ในกรณีนี้ _Ta อาจได้รับการปรับให้เหมาะสมเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการวิเคราะห์ต่อไปโดยใช้โปรโตคอลต่อไปนี้:

• เริ่มต้นที่ระดับต่ำสุดของ  ช่วง Ta ที่จะทดสอบซึ่งกำหนดโดย _Ta of the primers และเพิ่มระดับอุณหภูมิทีละขั้นทีละน้อย (โดยปกติจะทดสอบระหว่าง 55°C และ 65°C) เครื่องมือบางอย่างมีบล็อกไล่ระดับสีที่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพอุณหภูมิในการวิ่งครั้งเดียว
  
• ทดสอบแต่ละผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาสำหรับความจำเพาะโดยการวิเคราะห์เส้นโค้งละลายหลัง PCR หรืออิเล็กโตรโฟเรซิสเจล agarose ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
  
• อุณหภูมิการหลอมที่ดีที่สุดคืออุณหภูมิที่ส่งผลให้เกิด _{Cq ต่ำสุด}NTC เชิงลบการวิเคราะห์เส้นโค้งละลายเผยให้เห็นการตรวจจับผลิตภัณฑ์เฉพาะและความสามารถในการทำซ้ำสูงระหว่างปฏิกิริยาที่ทำซ้ำ

หากอุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไปปฏิกิริยาจะไม่เฉพาะเจาะจง อย่างไรก็ตามหากอุณหภูมิสูงเกินไปความสามารถในการบีบตัวอาจส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพการเกิดปฏิกิริยาส่งผลให้ขาดการขยายหรือ  ค่า Cq สูงมากอัตราผลตอบแทนที่ไม่ดีมากและความสามารถในการทำซ้ำต่ำ

ตัวอย่างของการปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมจะแสดงใน รูปที่ 9.4 ในกรณีนี้ (รูปที่ 9.4A)ปฏิกิริยาที่เหมือนกันถูกวิ่งบนบล็อก PCR แบบไล่ระดับเพื่อให้อุณหภูมิการหลอมอยู่ระหว่าง 47.8°C และ 71.7°C การหลอมที่  อุณหภูมิ 64.8°C และ 61.7°C จะส่งผลให้ค่า Cq เหมือนกันแต่อุณหภูมิที่ต่ำกว่าเล็กน้อยจะให้ผลผลิตที่สูงขึ้นตามหลักฐานจากการเรืองแสงที่จุดปลายที่สูงขึ้นและปฏิกิริยาที่มีประสิทธิภาพสูงขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (ระบุโดยการไล่ระดับของพล็อตการขยาย) การกำหนดประสิทธิภาพอย่างสมบูรณ์จำเป็นต้องมีการประเมินเส้นโค้งมาตรฐาน (ดู การประเมินผลการทดสอบ) หรือการใช้อัลกอริธึมการกำหนดประสิทธิภาพของหลอดเดียว^3,4 ส่วนที่สองของรูป (รูปที่ 9.4B)แสดงการเปรียบเทียบระหว่างพฤติกรรมของไพรเมอร์ภายใต้เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาที่เหมือนกันแต่ในรีเอเจนต์ผสมที่แตกต่างกัน ที่นี่เป็นที่ชัดเจนว่าองค์ประกอบบัฟเฟอร์มีผลต่อความสามารถในการทำซ้ำของการวิเคราะห์และช่วงของอุณหภูมิที่ได้รับข้อมูลที่มีเสถียรภาพ สุดท้ายการวิเคราะห์อิสระสองครั้งได้รับการออกแบบให้เป็นยีนเป้าหมายเดียวกันและถูกปรับให้เหมาะสมในแต่ละบัฟเฟอร์ ดังที่แสดงใน รูปที่ 9.4Cแต่ละบัฟเฟอร์ต้องมีอุณหภูมิที่เหมาะสมแตกต่างกันเพื่อให้ได้  ข้อมูล Cq ที่เทียบเคียงได้จากคู่รองพื้นสองคู่ (อุณหภูมิ 61.7°C ใน LuminoCt และ 58.4°C ใน KiCqStart)

รูปที่ 9.4 การเพิ่มประสิทธิภาพของไพรเมอร์โดยใช้ Ta a) ช่วงของอุณหภูมิการหลอมได้รับการทดสอบสำหรับปฏิกิริยาที่เหมือนกัน การหลอมที่อุณหภูมิ 64.8°C และ 61.7°C จะส่งผลให้ค่า Cq เหมือนกันและมีความสามารถในการทำซ้ำสูงระหว่างการทำซ้ำแต่อุณหภูมิที่ต่ำกว่าเล็กน้อยจะให้ผลผลิตที่สูงขึ้น b) มีการสร้างปฏิกิริยาสองอย่างที่เหมือนกันในน้ำยาผสมที่แตกต่างกัน (LuminoCt ® SYBR ® Green qPCR ReadyMix ™หรือ KiCqStart ® SYBR ® Green qPCR ReadyMix ™) และการไล่ระดับอุณหภูมิสีรองพื้น อุณหภูมิที่เหมาะสมแตกต่างกันในแต่ละส่วนผสมและมีการเปลี่ยนแปลงน้อยลงระหว่างข้อมูลเมื่อปฏิกิริยาถูกเรียกใช้ในตัวทำปฏิกิริยา KiCqStart c) คู่สีรองพื้นสองคู่กับเป้าหมายเดียวกัน (KS และออกแบบโดยใช้ Beacon Designer, BD) ถูกเรียกใช้ในการผสมปฏิกิริยาที่แตกต่างกัน สามารถเห็นได้ว่าอุณหภูมิการหลอมที่ดีที่สุดแตกต่างกันในน้ำยาที่แตกต่างกัน (61.7°C ใน LuminoCt และ 58.4°C ใน KiCqStart) เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันจากไพรเมอร์

แม้ว่าการวิเคราะห์เชิงพาณิชย์ส่วนใหญ่จะมาพร้อมกับเงื่อนไขการวิเคราะห์ PCR มาตรฐานการวิเคราะห์แต่ละครั้งอาจได้รับประโยชน์จากการเพิ่มประสิทธิภาพเพิ่มเติมเพื่อระบุเงื่อนไขที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการผสมไพรเมอร์เฉพาะ ซึ่งอาจเกิดจากไดเมอร์รองพื้นการขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงหรือประสิทธิภาพการตอบสนองที่ดีกว่าในสภาวะเริ่มต้นที่เลือก เมื่อเสร็จสิ้นการเพิ่มประสิทธิภาพควรคำนวณประสิทธิภาพการวิเคราะห์โดยใช้เงื่อนไขที่เลือกในการวัดชุดของมาตรฐานและเตรียมเส้นโค้งมาตรฐาน (การประเมินการทดสอบ) เป็นไปได้ว่าแม้หลังจากการปรับให้เหมาะสมแล้วประสิทธิภาพอาจยังต่ำกว่าที่เหมาะสมที่สุดและในกรณีที่เลวร้ายที่สุดอาจต้องมีการวิเคราะห์ใหม่

ผู้ใช้ควรกำหนดช่วงของค่าประสิทธิภาพที่ยอมรับได้ก่อนที่จะเริ่มกระบวนการปรับให้เหมาะสม ตามหลักการแล้วประสิทธิภาพควรอยู่ที่ > 95% อย่างไรก็ตามสามารถทำการวัดที่แม่นยำด้วยการวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพน้อยกว่า 90% และด้วยการออกแบบระดับรองพื้นลำดับเป้าหมายอาจกำหนดให้ไม่สามารถขยายชิ้นงานได้ด้วยประสิทธิภาพที่สูงขึ้น อย่างไรก็ตามเมื่อใช้การวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพลดลงมีความเป็นไปได้ว่าความเที่ยงตรงและขีดจำกัดของการตรวจจับจะได้รับผลกระทบ ภายใต้สถานการณ์เหล่านี้จำเป็นต้องใช้ดุลยพินิจที่เหมาะสมเมื่อตีความและรายงานข้อมูล¹

ปรับความเข้มข้นของโพรบให้เหมาะสม

สามารถใช้โพรบขนาด 250 นิวตันเมตรความเข้มข้นสุดท้ายในการวิเคราะห์ส่วนใหญ่ได้ อย่างไรก็ตามหากไม่จำเป็นต้องใช้ความไวสูงสุดอาจทำให้โพรบมีความเข้มข้นต่ำลงซึ่งจะช่วยลดต้นทุนการวิเคราะห์ได้ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขการตรวจสอบให้ทดสอบที่ความเข้มข้นหลายตั้งแต่ 50 ถึง 500 นิวตันเมตรสุดท้ายร่วมกับความเข้มข้นที่เหมาะสมของไพรเมอร์และความเข้มข้นต่ำสุดของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายที่คาดว่าจะรวมอยู่ในการทดลองขั้นสุดท้าย  สามารถใช้โพรบที่มีความเข้มข้นต่ำที่สุดที่ช่วยให้สามารถตรวจจับที่มีความไวมากที่สุด (Cq ≤ 30 ที่มีความสามารถในการทำซ้ำได้ดีที่สุด)

การเพิ่มประสิทธิภาพส่วนประกอบปฏิกิริยาและการวิเคราะห์มัลติเพล็กซ์

มีการทดสอบบางอย่างที่ไวต่อสภาวะบัฟเฟอร์/ปฏิกิริยา สำหรับการทดสอบเหล่านี้การปรับเปลี่ยนบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาเพิ่มเติมโดยการเพิ่มประสิทธิภาพของ MgCl 2 ความเข้มข้นการเพิ่มตัวเพิ่ม PCR (Mueller ในเทคโนโลยี PCR; นวัตกรรมปัจจุบัน, 2013⁵) หรือการปรับอัตราการเพิ่มของเครื่องมืออาจส่งผลให้ประสิทธิภาพการทำงานดีขึ้น นอกเหนือจากแนวทางการเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์ที่ระบุไว้ในส่วนก่อนหน้านี้ปัจจัยเหล่านี้มีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อเพิ่มประสิทธิภาพปฏิกิริยา multiplex

เพิ่ม ความเข้มข้นของ MG 2 ขึ้นไป

แมกนีเซียมมีบทบาทหลายอย่างใน PCR ซึ่งเป็นไอออนตัวนับประจุบวกที่จำเป็นสำหรับ dNTP และปัจจัยร่วมสำหรับโพลิเมอร์ทั้งหมด ไอออนแบบ Divalent ส่งผลอย่างมากต่อการผสมข้ามสาย DNA การเพิ่มความเข้มข้นของแมกนีเซียมจะเพิ่มความเสถียรหรืออุณหภูมิหลอมละลายของดีเอ็นเอดูเพล็กซ์ หลังจากระดับแมกนีเซียมสูงจะเพิ่มความสัมพันธ์ของไพรเมอร์กับการผสมข้ามพันธุ์รวมถึงเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นกับการผสมรองพื้นผิดพลาดและการมีปฏิสัมพันธ์กับไพรเมอร์ไพรเมอร์ ดีเอ็นเอดูเพล็กซ์สีรองพื้นผิดพลาดกลายเป็นพื้นผิวสำหรับดีเอ็นเอพอลิเมอเรสซึ่งส่งผลต่อการสร้างผลิตภัณฑ์ด้านข้างและการตบประสิทธิภาพของ PCR ดังนั้นความเข้มข้นของ MgCl 2 จึงมีผลกระทบต่อทั้งความจำเพาะและผลผลิตของ PCR เนื่องจากแมกนีเซียมมีผลต่อการผสมของไพรเมอร์กับเป้าหมายกระบวนการของพอลิเมอดีเอ็นเอ Taq เช่นเดียวกับอัตราการย่อยสลายโดยความนุ่มนวลของ exonuclease เมื่อใช้สำหรับการดักจับโพรบใน qPCR ดังนั้น MgCl 2 ที่ไม่เพียงพอทำให้ได้ผลผลิตที่ไม่ดีเนื่องจากอัตราการทำโพลิเมอร์ดีเอ็นเอต่ำพอลิเมอเรสการยึดเกาะของไพรเมอร์ที่ถูกบุกรุกและการดักจับโพรบที่ไม่มีประสิทธิภาพ หากความเข้มข้นของ MgCl 2 สูงเกินไปความจำเพาะของปฏิกิริยาจะลดลงเนื่องจากจะนำไปสู่ความเสถียรที่ดีขึ้นของการผสมรองพื้นแบบไม่เฉพาะเจาะจง

ในทางตรงกันข้ามกับการวิเคราะห์ PCR แบบทั่วไปที่ใช้ MgCl 2 ความเข้มข้นมาตรฐาน 1.5 – 2 มม. การวิเคราะห์ QPCR ของโพรบไฮโดรไลซิสต้องการความเข้มข้นสูงกว่าประมาณ 3 – 5 มม. เพื่อให้ได้การถ่มของโพรบที่มีประสิทธิภาพ การปรากฏตัวของ MgCl 2 ยังเพิ่มอัตราการผสมดีเอ็นเอทำให้สามารถผสมข้ามพันธุ์ได้อย่างมีประสิทธิภาพในระหว่างสภาพการขี่จักรยานอย่างรวดเร็วที่ใช้โดยเครื่องมือจำนวนมาก การเพิ่มประสิทธิภาพของ MgCl 2 ความเข้มข้นจะมีความสำคัญมากขึ้นเมื่อใช้ปฏิกิริยา multiplex

เกลือเช่น KCL หรือ (NH₄)₂ดังนั้น₄ จะเปลี่ยน DNA duplex _TM แต่ผลที่ได้จะน้อยมากสำหรับการเกิด monovalent เหล่านี้

รูปที่ 9.5 ผลของความเข้มข้นของแมกนีเซียม

เอฟเฟ็กต์ที่แสดงใน รูปที่ 9.5จะถูกขยายเมื่อทำ PCR แบบมัลติเพล็กซ์ การแสดงปฏิกิริยาหลายครั้งพร้อมกันจะเป็นการแข่งขันสำหรับน้ำยาและทำให้สภาวะที่ดีที่สุดต่ำกว่ารุนแรงขึ้นทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในประสิทธิภาพของ PCR

อัตราทางลาด

มีโอกาสน้อยมากที่ปฏิกิริยาที่ยากลำบากต้องมีการปรับเปลี่ยนเพิ่มเติม เมื่อตัวเลือกอื่นๆทั้งหมดหมดแล้วอาจสามารถกู้คืนสถานการณ์ที่สูญหายได้โดยการทดสอบเชิงประจักษ์และการปรับเปลี่ยนอัตราการลาด PCR

ตรวจสอบการเลือกฟลูออโรฟิลและควินเชอร์

เมื่อทำการวิเคราะห์แบบ multiplex สิ่งสำคัญคือต้องเพิ่มการแยกสเปกตรัมของการปล่อยหลายๆครั้งจากฟลูออโรฟอรอเรสที่แตกต่างกันเพื่ออำนวยความสะดวกในการแยกสัญญาณและการวิเคราะห์ข้อมูล ดังนั้นฟลูออโรฟอรอเรสที่มีความกว้างของผ้าพันแผลที่แคบและได้รับการแก้ไขอย่างดีซึ่งแยกออกจากกันอย่างกว้างขวางจึงมีประโยชน์สำหรับการใช้งานแบบมัลติเพล็กซ์ อย่างไรก็ตามในความเป็นจริงการเลือกฟลูออโรโพเรจะถูกจำกัดโดยระบบออปติคอลของเครื่องมือ PCR เชิงปริมาณและวิธีการตรวจจับ PCR แบบดิจิตอล ประกอบด้วยข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเลือกฟลูออ โรophores และเครื่องดับเพลิง

แนวทางการเพิ่มประสิทธิภาพของ PCR การถอดความแบบย้อนกลับเชิงปริมาณ (RT-qPCR)

เมื่อทำ RT-qPCR ไม่เพียงแต่จะต้องพิจารณาแนวทางสำหรับ QPCR มาตรฐานตามที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้และปรับ RT ให้เหมาะสมตามที่ได้กล่าวถึงในการ ถอดสคริปต์ย้อนกลับแต่ยังต้องจัดการกับประเด็นต่อไปนี้ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับขั้นตอน RT:

• ตรวจสอบคุณภาพ RNA (การทำให้บริสุทธิ์ตัวอย่างและการประเมินคุณภาพ)
  
• ยืนยันว่า Primers Span หรือ Flank Long Introns (การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR)
  
• เพิ่มประสิทธิภาพการถอดเสียงย้อนกลับ (การถอดเสียงย้อนกลับ)
  
• ตรวจสอบข้อมูลการควบคุม No-Reverse Transcriptase (No-RT)

ยืนยันว่า primers Span หรือ Flank Long Introns

ในขณะที่ gDNA ส่วนใหญ่ถูกกำจัดออกจากตัวอย่างในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ RNA ไม่มีขั้นตอนใดที่จะกำจัดดีเอ็นเอทั้งหมด เนื่องจาก PCR สามารถขยายดีเอ็นเอโมเลกุลเดียวได้ดีเอ็นเอที่ปนเปื้อนจึงถูกขยายออกไปรวมทั้งอาร์เอ็นเอเมื่อใช้ RT-qPCR ถ้า mRNA เป้าหมายค่อนข้างอุดมสมบูรณ์ (หลายร้อยหรือหลายพันสำเนาต่อเซลล์) สัญญาณที่เกิดจากการขยายตัวปนเปื้อนของดีเอ็นเอจะน้อยเมื่อเทียบกับผลิตภัณฑ์จาก RNA; อย่างไรก็ตามหาก mRNA เป้าหมายมีปริมาณมากหรือหายาก (< 100 สำเนา/เซลล์) สัญญาณที่เกิดจากการขยายดีเอ็นเออาจนำไปสู่การประมาณค่าระดับ mRNA ที่สูงอย่างผิดพลาด เพื่อหลีกเลี่ยงการขยายดีเอ็นเอในระหว่าง RT-qPCR หากเป็นไปได้ให้ใช้ไพรเมอร์ที่ไม่ได้อยู่ในลำดับ mRNA หรือที่อยู่ในทางแยก exon-exon (การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR)

ถ้ายีนที่สนใจไม่มีอินทรอนถ้าไม่ทราบตำแหน่งอินทรอน หรือหากไม่มีไพรเมอร์ที่เหมาะสมที่มีช่วงหรือการบุกรุกปีกอาจจำเป็นต้องย่อย RNA ที่มี DNase ที่ปราศจาก RNase หรือเกรดการขยายตัว I. ข้อมูลจากการควบคุมที่ไม่มี RT สามารถใช้เพื่อตรวจสอบว่าจำเป็นต้องย่อยอาหารด้วย DNase หรือไม่

ตรวจสอบข้อมูลการควบคุม No-Reverse Transcriptase (No-RT)

ไม่ว่าไพรเมอร์จะอยู่ในช่วงหรือภายในด้านข้างก็ตามความจำเพาะของการวิเคราะห์ RT-qPCR ควรได้รับการทดสอบในปฏิกิริยาควบคุมที่ไม่มี reverse transcriptase (ไม่มีการควบคุม RT) เพื่อประเมินการขยายที่อาจเกิดขึ้นจากการปนเปื้อน DNA ตามที่อธิบายไว้ใน การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCRลำดับดีเอ็นเอที่มีอินทรอนสั้น (≤1 kb) อาจถูกขยายได้สำเร็จใน RT-PCR ยีนจำนวนมากมีสำเนาเพิ่มเติมหรือ pseudogenes ที่ขาดหนึ่งหรือมากกว่าอินทรอน ดังนั้นการมีส่วนร่วมของดีเอ็นเอต่อข้อมูลที่ได้จากการวิเคราะห์ RT-PCR ควรได้รับการทดสอบโดยการทำปฏิกิริยาที่มีตัวอย่าง RNA แต่ไม่มีเอนไซม์ RT ควบคู่ไปกับปฏิกิริยาที่มีทั้งเอนไซม์ RNA และ RT (รูปที่ 9.6) การขยายดีเอ็นเอถือว่าเป็นที่ยอมรับใน qPCR ถ้า  ค่า Cq สำหรับปฏิกิริยาที่ไม่มี RT มีอย่างน้อย 5 รอบมากกว่าที่มีปฏิกิริยากับ RT6 อย่างไรก็ตามหากมีรอบน้อยกว่า 5 รอบระหว่าง  ค่า Cq สำหรับปฏิกิริยาที่มีและไม่มี RT การขยายดีเอ็นเออาจส่งผลต่อการวัดปริมาณ mRNA

รูปที่ 9.6 การประเมินการควบคุมแบบไม่มี RT ผลิตภัณฑ์ RT-PCR ที่ผลิตในบริเวณที่มี (+) หรือไม่มี (–) ของเอนไซม์ RT ถูกแยกออกเป็นส่วนๆบนเจล agarose 2% ที่มีส่วนผสมของ ethidium bromide ใน TBE ไพรเมอร์สำหรับเป้าหมาย mRNA ในด้านข้าง 1 kb อินทรอน เป้าหมาย mRNA ใน B สอดคล้องกับยีนหลายตัวซึ่งอย่างน้อยหนึ่งตัวเป็น pseudogene ที่ขาดการบุกรุกระหว่างไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ RT-PCR และดังนั้นจึงให้ผลิตภัณฑ์ที่มีขนาดเท่ากันโดยมีและไม่มีเอนไซม์ RT

เมื่อการปนเปื้อนดีเอ็นเอของอาร์เอ็นเอส่งสัญญาณสำคัญไปยังการทดลองอาร์เอ็นเอควรถูกย่อยด้วย DNase เกรด RNase หรือเกรดขยาย I ก่อน RT-qPCR เพื่อให้ได้ปริมาณ mRNA ที่เชื่อถือได้ โปรดทราบว่าการย่อย DNase ในคอลัมน์ (ขั้นตอนที่เสนอให้กับชุดทำให้บริสุทธิ์ RNA ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดจำนวนมากซึ่งการย่อย DNase จะดำเนินการในขณะที่ RNA ถูกผูกไว้กับคอลัมน์ซิลิกา) มีประสิทธิภาพน้อยกว่าในการกำจัดดีเอ็นเอมากกว่าการย่อยอาหารในสารละลายหลังจาก eluting RNA จากคอลัมน์ ดังนั้นการย่อย DNase ในคอลัมน์ (OC) อาจไม่เพียงพอสำหรับ RT-qPCR (รูปที่ 9.7) การควบคุม No-RT ควรดำเนินการกับ RNA ที่ย่อยด้วย DNase เพื่อตรวจสอบว่าการย่อยอาหารสำเร็จและเพียงพอ ในตัวอย่างที่แสดงใน รูปที่ 9.7การย่อย OC DNase เพียงพอที่จะตรวจจับ mRNA เป้าหมายได้อย่างน่าเชื่อถือ มันจะไม่เพียงพอที่จะวัดค่า mRNA ที่มีปริมาณน้อยกว่ามากหากต้องการความไวมากขึ้น

โปรดทราบว่าเซลล์และเนื้อเยื่อประเภทต่างๆรวมถึงสภาวะการเจริญเติบโตที่แตกต่างกันจะสร้าง mRNA ที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันอย่างมาก นอกจากนี้วิธีการทำให้บริสุทธิ์ RNA ที่แตกต่างกันยังให้ผลดีเอ็นเอปนเปื้อนในปริมาณที่แตกต่างกัน ดังนั้นควรทำปฏิกิริยาที่มีและไม่มีการถอดสคริปต์ย้อนกลับอย่างน้อยหนึ่งครั้งกับวัสดุเริ่มต้นใหม่แต่ละชนิดวิธีการเตรียม RNA หรือการวิเคราะห์

รูปที่ 9.7 การเปรียบเทียบการย่อย DNase ในคอลัมน์ (OC) กับการย่อย DNase หลังการเตรียม RNA ทั้งหมดได้รับการจัดเตรียมจากตับเมาส์ 30 มก. ด้วยชุด GenElute ™ Total RNA Kit หรือขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์คอลัมน์จากซัพพลายเออร์ทางเลือกทั้งสองตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตัวอย่าง RNA สองตัวอย่างได้รับการจัดเตรียมด้วยผลิตภัณฑ์ DNase ในคอลัมน์ของผู้ผลิตที่เกี่ยวข้องและสองชิ้นได้รับการเตรียมโดยไม่ต้องย่อย DNase หลังจากการทำให้บริสุทธิ์, อะลิควอทของสี่ตัวอย่าง RNA ที่เตรียมโดยไม่ต้อง DNase ในคอลัมน์ถูกย่อยด้วยเกรดขยายของเรา DNase I ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สัดส่วนที่เท่ากันของทั้งหมดถูกใช้ใน RT-qPCR ขั้นตอนเดียว แสดงผลของการเรืองแสงของตัวอย่าง RNA สองตัวอย่าง ผลที่คล้ายคลึงกันได้รับจากผลิตภัณฑ์ของผู้ผลิตทั้งสองรายและเฉพาะขั้นตอนที่ต้องการการรักษา DNAse หลังการทำให้บริสุทธิ์เอา gDNA ออกทั้งหมด

Assay Evaluation

เมื่อการวิเคราะห์ได้รับการปรับให้เหมาะสมเพื่อให้สามารถระบุสภาวะที่มีความอ่อนไหวมากที่สุดได้แล้วสิ่งสำคัญคือต้องระบุความจำเพาะของการวิเคราะห์ประสิทธิภาพและช่วงไดนามิกทางเทคนิค

ระบุความจำเพาะโดยใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งละลาย

ความจำเพาะสามารถกำหนดได้โดยการใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งหลอมละลาย การทำเส้นโค้งละลายต้องมีการผสมสีย้อมของผู้รายงานเช่น SYBR Green I Dye หรือการใช้โพรบที่ไม่มีไฮโดรไลซ์เช่น Molecular Beacon หรือ Scorpions^® Probe (ดู วิธีการตรวจ PCR เชิงปริมาณและ Digital PCR Detection) หลังจากที่มีการผลิตแอมพลิฟายเออร์ในระหว่าง qPCR จะต้องบ่มที่อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นโดยปกติจะอยู่ระหว่าง 55°C ถึง 95°C อย่างไรก็ตามผู้ใช้ควรตรวจสอบว่าจุดหลอมละลายทางทฤษฎีของแอมพลิฟายเออร์อยู่ในช่วงนี้เนื่องจากจะขึ้นอยู่กับขนาดและเนื้อหา GC _{TM, การทดลอง} จะแตกต่างกันเล็กน้อยระหว่างการรันและรีเอเจนต์ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากความผันแปรใน MgCl 2 และความเข้มข้นของไอออนอื่นๆ

การเปลี่ยนแปลงของการเรืองแสงจะถูกกำหนดและลงจุดเป็นอัตราการเปลี่ยนแปลงของการเรืองแสงเทียบกับอุณหภูมิ เนื่องจาก SYBR Green I เป็นสีย้อมที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่เชื่อมโยงกับ DNA ที่มีสองชั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องตรวจสอบว่า qPCR ผลิตเฉพาะผลิตภัณฑ์ที่ต้องการเมื่อใช้เคมีตรวจจับนี้ สามารถใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งเพื่อกำหนดจำนวนและขนาดโดยประมาณของผลิตภัณฑ์ได้ การทดสอบที่มีความจำเพาะสูงจะส่งผลให้เกิดจุดสูงสุดในการละลายเพียงครั้งเดียวที่อุณหภูมิสูงในปฏิกิริยาที่มีเฉพาะเป้าหมายที่ไม่มีอะไรหรือน้อยมากที่ตรวจพบในการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต (รูปที่ 9.8A) หากเส้นโค้งละลายมีจุดสูงสุดมากกว่าหนึ่งจุดดังเช่นใน รูป 9.8 Band 9.8Cข้อมูลประจำตัวของผลิตภัณฑ์สามารถตรวจสอบเพิ่มเติมได้โดยการแก้ไขข้อมูลเหล่านี้บนเจล agarose ที่ย้อมสี ethidium bromide ดังที่แสดงใน รูปที่ 9.8 Dand 9.8Eปฏิกิริยา B และ C มีไพรเมอร์ - ไดเมอร์หรือผลิตภัณฑ์อื่นที่ไม่เฉพาะเจาะจงมากเกินไป การลดความเข้มข้นของไพรเมอร์มักจะช่วยลดปริมาณผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง หากผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงยังคงถูกตรวจจับในปริมาณมากโดยมีระดับสีรองพื้นต่ำควรออกแบบสีรองพื้นใหม่

รูปที่ 9.8 การประเมินเส้นโค้งละลาย ละลายหรือแยกออกเส้นโค้งแสดงยอดที่คมชัดของผลิตภัณฑ์เฉพาะที่ > 80°C ด้วยผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงน้อยมากที่อุณหภูมิต่ำกว่า (A) หรือปริมาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงผลิตภัณฑ์ละลายต่ำกว่า (B และ C) D ถึง F แสดงผลิตภัณฑ์ PCR จากตามที่แสดงบนเส้นโค้งละลาย A ถึง C ตามลำดับแก้ไขในเจล Agarose 2% ที่มีส่วนผสมของ ethidium bromide

ตัวอย่างของการวิเคราะห์เส้นโค้งละลายที่เปิดเผย gDNA และการปนเปื้อนของไพรเมอร์ไดเมอร์ NTC ของ RNA แสดงใน รูปที่ 9.9 ใน รูปที่ 9.9Aผลิตภัณฑ์เฉพาะจะเห็นได้จากปฏิกิริยาการทดสอบและผลิตภัณฑ์ที่มีขนาดเล็กกว่าละลายที่อุณหภูมิต่ำกว่ามีอยู่ใน NTC นี่เป็นตัวบ่งชี้การก่อตัวของไพรเมอร์ - ไดเมอร์ในกรณีที่ไม่มีเทมเพลต นี่เป็นเรื่องปกติและเป็นเพียงข้อกังวลเมื่อผลิตภัณฑ์ไพรเมอร์เหล่านี้ปรากฏอยู่ในตัวอย่างการทดสอบตามที่แสดงใน รูปที่ 9.8 ตัวอย่างใน รูปที่ 9.9 แสดงการตรวจหายีน gDNA ที่ยังไม่ผ่านกระบวนการในตัวอย่าง DNA โดยใช้การวิเคราะห์เดียวกัน (ในกรณีนี้ไพรเมอร์จะอยู่ใน exons ที่ครอบคลุมอินทรอน) ซึ่งถูกใช้สำหรับการตรวจจับ mRNA ด้วย ผลิตภัณฑ์มีความโดดเด่นด้วยโปรไฟล์ละลายของพวกเขาด้วยผลิตภัณฑ์ gDNA ละลายที่อุณหภูมิสูงขึ้นเพราะสิ่งนี้ยังมีอินทราน

รูปที่ 9.9 ตัวอย่างของการวิเคราะห์เส้นโค้งละลายก) ไพรเมอร์ไดเมอร์ในการควบคุมเทมเพลตไม่มีและข) การขยายผ่านการบุกรุกของ gDNA

ความจำเพาะเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งเมื่อออกแบบการวิเคราะห์สำหรับการพิมพ์ยีน สิ่งเหล่านี้มักเป็นการตรวจสอบและต้องการการจำแนกความแตกต่างของฐานเพียงอย่างเดียวเช่นเมื่อแยกความแตกต่างระหว่าง Polymorphisms แบบ Single Nucleotide (SNPs) ในกรณีนี้จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องทดสอบโพรบแต่ละตัวในปฏิกิริยาเดียวกับเทมเพลตที่ทราบกันดีว่ามีลำดับที่ตรงกันและมีลำดับที่ไม่ตรงกัน

การกำหนดประสิทธิภาพและขีดจำกัดของการตรวจจับ

วิธีที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการวัดประสิทธิภาพการวิเคราะห์คือการสร้างเส้นโค้งมาตรฐานจากการเจือจางแบบอนุกรมของแม่แบบ ประสิทธิภาพการวิเคราะห์สามารถวัดได้เป็นปัจจัยของการไล่ระดับสีของเส้นโค้งมาตรฐาน มีการรันความเข้มข้นของตัวอย่างที่หลากหลายทำให้มั่นใจได้ว่าสิ่งเหล่านี้จะมีการเจือจางที่จำกัดดังนั้นจึงช่วยให้สามารถกำหนดช่วงไดนามิกของการวิเคราะห์ทางเทคนิคจากการทดลองเดียวกันได้

วัสดุเทมเพลตใดๆที่เหมาะสมเหมาะสมสำหรับการกำหนดประสิทธิภาพการวิเคราะห์ทางเทคนิคเหล่านี้ การเลือกวัสดุอ้างอิงมาตรฐานที่สามารถถ่ายโอนได้ช่วยให้สามารถตรวจสอบระหว่างห้องปฏิบัติการและภายในห้องปฏิบัติการได้ ดังนั้นขั้นตอนการตรวจสอบนี้สามารถดำเนินการกับ plasmid ที่เป็นเส้นตรงหรือถูกจับ (ดีเอ็นเอที่ถูกซ้อนทับไม่ได้ขยายอย่างมีประสิทธิภาพและส่งผลให้เกิดความสามารถในการทำซ้ำต่ำ) ชิ้นส่วนที่ถูกโคลนหรือสีสังเคราะห์ อย่างไรก็ตามจะต้องทราบว่าการตรวจสอบความถูกต้องของชิ้นงานเหล่านี้เป็นการวัดฟังก์ชันการวิเคราะห์และไม่รองรับความผันแปรที่เกิดจากความซับซ้อนของตัวอย่างทางชีวภาพ

การกำหนดช่วงไดนามิกทางเทคนิคและประสิทธิภาพของการวิเคราะห์จากเส้นโค้งมาตรฐานจะแสดงใน รูปที่ 9.10 ในตัวอย่างนี้เทมเพลตได้รับการเจือจางผ่านชุด 10 เท่าของ 11 บันทึกดังนั้นขีดจำกัดการตรวจจับทางทฤษฎีจะแสดงเป็น 3 สำเนา (ต่ำสุด _Cq)แม้ว่าความแม่นยำของการวัดนี้จะถูกกำหนดอย่างชัดเจนโดยความสามารถในการทำซ้ำซึ่งค่อนข้างต่ำที่รอบสูงดังกล่าว

รูปที่ 9.10 ตัวอย่างของความสามารถในการทำซ้ำสูงและการตรวจจับที่หลากหลายโดยใช้การเจือจางแบบอนุกรมของพลาสมาที่เป็นเส้นตรง มีการทำซ้ำแปดครั้งสำหรับการเจือจางแต่ละครั้งและการขยายเป้าหมายที่ตรวจพบโดยใช้สีย้อม SYBR Green I สามารถนับจำนวนได้ระหว่าง 3 × 1010 และ 3 สำเนา

ประสิทธิภาพการวิเคราะห์จะถูกกำหนดโดยการวัดความไล่ระดับสีของเส้นโค้งมาตรฐานที่เป็นพล็อตของบันทึกความเข้มข้นของเป้าหมายเทียบกับ _Cq (รูปที่ 9.10) การวิเคราะห์ที่มีประสิทธิภาพร้อยละ 100 จะแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ (E = 2 และการไล่ระดับสีที่ระดับ– 3.323

     ประสิทธิภาพสามารถคำนวณได้ตามสมการ:

     ประสิทธิภาพ = 10^{(– 1/ความชัน)} – 1 หมายเหตุ: ซอฟต์แวร์สำหรับเครื่องมือจำนวนมากให้การวัดประสิทธิภาพเป็น
     เปอร์เซ็นต์ ค่านี้คือเปอร์เซ็นต์ของ E= 2 ดังนั้นประสิทธิภาพของ 95% เท่ากับ E = 1.9

     ความชัน = m และกำหนดจากเส้นโค้งมาตรฐานของสมการ y=MX+C

     C คือค่าตัดแกนทางทฤษฎีบนแกน y และให้ค่าการวัดสัมพัทธ์ของความไวของการวิเคราะห์

ความลาดเอียงระหว่าง– 3.1 ถึง– 3.6 ส่งผลให้ประสิทธิภาพระหว่าง 90 ถึง 110% และโดยทั่วไปแล้วจะได้รับการยอมรับแต่เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องพยายามให้ใกล้เคียงกับ 100% เนื่องจากการทดสอบจะอนุญาต ข้อมูลที่แสดงใน รูปที่ 9.1 1 เป็นภาพประกอบของช่วงปกติของความแปรผันในประสิทธิภาพและความไวของชุดการวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน ซึ่งจะแสดงให้เห็นว่าการรายงานข้อมูลเหล่านี้ในสิ่งพิมพ์^1,6-8มีความสำคัญเพียงใด

รูปที่ 9.11 ตัวอย่างของการกำหนดประสิทธิภาพและการเปรียบเทียบยีนอ้างอิงที่เป็นไปได้หลายยีน ดังที่เห็นได้เหล่านี้มีประสิทธิภาพและความไวที่แตกต่างกันมาก (ข้อมูลที่นักเรียนได้รับจากการเข้าร่วมเวิร์กช็อปขั้นสูงของ qpcr, EMBL)

มีการเสนอแนวทางทางเลือกในการคำนวณประสิทธิภาพเส้นโค้งมาตรฐาน วิธีการเหล่านี้รายงานประสิทธิภาพของปฏิกิริยาเดียวภายในหลอด วิธีการเหล่านี้อาศัยอัลกอริธึมในการจำลองเส้นโค้งของพล็อตการขยายและขึ้นอยู่กับจำนวนรอบที่มีการเรืองแสงเพิ่มขึ้น สิ่งเหล่านี้มีแนวโน้มที่จะประสบความสำเร็จมากที่สุดเมื่อทำการวัดโดยใช้สีย้อม ที่มีผลผูกพันดีเอ็นเอหรือ Scorpions ® Probes เนื่องจากการวิเคราะห์เหล่านี้ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนส์ต่อรอบมากขึ้น ในขณะที่วิธีการประเภทนี้อาจมีทางเลือกที่เหมาะสำหรับเส้นโค้งมาตรฐานแต่วิธีหลังยังคงเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการประเมินการวิเคราะห์ เนื่องจากเส้นโค้งมาตรฐานไม่เพียงให้การประมาณประสิทธิภาพเท่านั้นแต่ยังให้ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับช่วงไดนามิกการทำงานความไวและความสามารถในการทำซ้ำและใช้งาน^{ได้ง่ายขึ้น}ในแนวคิด 9

ค่าของ R²หรือความพอดีของข้อมูลบนเส้นโค้งตรงมาตรฐานเป็นการวัดความสามารถในการทำซ้ำและได้รับอิทธิพลจากความถูกต้องของการวางท่อและโดยช่วงไดนามิกของการทดสอบ ดังนั้นเมื่อประเมินการวิเคราะห์จึงจำเป็นต้องใช้การทำซ้ำทางเทคนิคอย่างน้อยสามครั้งสำหรับการเจือจางแต่ละครั้ง หาก R 2 คือ ≤0.985 การวิเคราะห์อาจไม่ให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้เนื่องจากความสามารถในการทำซ้ำระหว่างการทำซ้ำไม่ดี หากหนึ่งจุดหรือมากกว่าที่ระดับต่ำสุดของกรดนิวคลีอิกอินพุตถูกเลื่อนออกไปจากพื้นที่เชิงเส้นของพล็อตมีแนวโน้มที่ความเข้มข้นที่วัดได้จะเกินความไวในการวิเคราะห์ ถ้าหนึ่งหรือมากกว่าจุดที่จำนวนสำเนาสูงสุดของกรดนิวคลีอิกอินพุตถูกเลื่อนออกไปจากพื้นที่เชิงเส้นของพล็อตก็มีแนวโน้มที่ปฏิกิริยาจะอิ่มตัวและความเข้มข้นของเป้าหมายเกินช่วงการวิเคราะห์ที่มีประโยชน์ หรือหากมีจุดสุ่มหลายจุดที่อยู่เหนือหรือต่ำกว่าเส้นความแม่นยำในการปิเปตต์หรือการเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์อาจเป็นปัญหา ตรวจสอบว่าปลายปิเปตต์พอดีกับปิเปตต์อย่างถูกต้องและปริมาณที่จ่ายออกมานั้นสามารถทำซ้ำได้และตรวจสอบการปรับสีรองพื้นให้เหมาะสมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

เส้นโค้งมาตรฐานเป็นเครื่องมือที่จำเป็นสำหรับการตรวจสอบปฏิกิริยา multiplex การแสดงปฏิกิริยาหลายครั้งพร้อมกันทำให้เกิดการแข่งขันสำหรับน้ำยาและทำให้สภาวะที่ไม่เหมาะสมรุนแรงขึ้นทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในประสิทธิภาพของ PCR รูปที่ 9.1 2 แสดงให้เห็นถึงประเด็นนี้ เส้นโค้งประสิทธิภาพสำหรับชิ้นงานรองพื้น/โพรบสองชิ้นจะดำเนินการแยกกันแล้วทำการมัลติเพล็กซ์ กราฟแสดงให้เห็นว่าในขณะที่ปฏิกิริยาของแต่ละบุคคล (เส้นสีฟ้าเข้มและสีเขียว) ให้ประสิทธิภาพและความไวที่คล้ายกัน (ค่าแกน y) การใช้ปฏิกิริยาร่วมกันจะเปลี่ยนความไวและประสิทธิภาพของปฏิกิริยา multiplex อย่างมาก

รูปที่ 9.12 ปฏิกิริยา singleplex กับปฏิกิริยาเพล็กซ์

วัสดุ

ขออภัย เกิดข้อผิดพลาดที่ไม่คาดคิด

Response not successful: Received status code 500

ข้อมูลอ้างอิง

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, et al. 2009. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 55(4):611-622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

2. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006. SPUD: A quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytical Biochemistry. 351(2):308-310. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.01.051

3. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters. 339(1):62-66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4

4. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WMH, Karlen Y, Bakker O, van den Hoff MJB, Moorman AFM. 2009. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. 37(6):e45-e45. https://doi.org/10.1093/nar/gkp045

5. Nolan T, Bustin SA. 2013. PCR Technology: Current Innovations. 3. CRC Press.

6. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1(3):1559-1582. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236

7. Bustin SA. 2010. Why the need for qPCR publication guidelines??The case for MIQE. Methods. 50(4):217-226. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006

8. Huggett J, Bustin SA. 2011. Standardisation and reporting for nucleic acid quantification. Accred Qual Assur. 16(8-9):399-405. https://doi.org/10.1007/s00769-011-0769-y

9. Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, et al. 2013. Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods. 59(1):32-46. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.08.011