PCR เชิงปริมาณและวิธีการตรวจจับ PCR แบบดิจิตอล

A Technical Guide to PCR Technologies

บทนำ

สีย้อมหรือโพรบเรืองแสงจะรวมอยู่ในส่วนผสม PCR เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของแอมพลิฟายเออร์ DNA ในขณะที่ปฏิกิริยาดำเนินต่อไป มีการกล่าวถึงวิธีการตรวจจับที่ได้รับความนิยมหลายวิธีซึ่งได้รับการยอมรับเป็นอย่างดีในการวัดแม่แบบโดยอ้อมใน qPCR ในบทนี้ นอกจากนี้ยังมีการแสดงให้เห็นว่าโพรบแบบติดฉลากคู่และสีย้อมติดดีเอ็นเอบางชนิดทำงานได้ดีใน PCR แบบดิจิตอล (DPCR) 

Section Overview

• บทนำ
• สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA
• โพรบ
• เครื่องดับเพลิง
• Nucleic Acid Analogs
• สรุป

ใช้สารบัญทางด้านขวาเพื่อไปยังส่วนอื่นๆของ คู่มือทางเทคนิคในเทคโนโลยี PCR

สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA

ดีเอ็นเอดับเบิลควั่น (DDNA) ผูกพันสีทำหน้าที่เป็น intercalating และ/หรือร่องย่อยผูกตัวแทนและปล่อยเรืองแสงตรวจจับเมื่อผูกกับ dsDNA แต่มีพื้นหลังต่ำมากเมื่อฟรีในการแก้ปัญหา ดังนั้นความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วนของปริมาณแอมพลิฟายเออร์ที่มีอยู่ สีย้อมติดดีเอ็นเอสองเส้นเป็นที่นิยมเนื่องจากเป็นตัวเลือกการตรวจจับต้นทุนต่ำและไม่จำเป็นต้องพิจารณาการออกแบบเพิ่มเติม

SYBR^® Green I Dye

สีย้อมนี้เป็นสีย้อมที่มีผลผูกพัน dsDNA ที่ได้รับความนิยมมากที่สุดและมีประวัติอันยาวนานในการใช้ชีววิทยาโมเลกุล เมื่อฟรีในการแก้ปัญหาที่มีเพียงดีเอ็นเอเดียวที่ควั่น (ssDNA) อยู่ SYBR สีเขียวฉันย้อมจะส่งสัญญาณของความเข้มต่ำ (รูปที่ 5.1 ตารางที่ 5.1) เมื่อ PCR ดำเนินไปและปริมาณของ dsDNA เพิ่มขึ้นสีย้อมจะเชื่อมโยงกับแอมพลิฟายเออร์มากขึ้นและด้วยเหตุนี้ความเข้มของสัญญาณจึงเพิ่มขึ้น (ดูภาพเคลื่อนไหวบน Web Pag esigma.com/sybr-animation ต่อไปนี้) อย่างไรก็ตามเนื่องจากสีย้อมยึดติดกับผลิตภัณฑ์ที่ขยายทั้งหมดโดยไม่มีการแบ่งแยกสิ่งประดิษฐ์เช่นที่เป็นผลมาจากไพรเมอร์ไดเมอร์หรือการผูกมัดที่ไม่เฉพาะเจาะจงของไพรเมอร์ยังมีส่วนช่วยในการเรืองแสงโดยรวม ซึ่งอาจทำให้ยากต่อการหาปริมาณที่แม่นยำโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ความเข้มข้นของแม่แบบต่ำ อย่างไรก็ตามการวิเคราะห์เส้นโค้งละลายหลัง PCR สามารถช่วยระบุความจำเพาะของปฏิกิริยา 1 (รูปที่ 5.2) 

รูปที่ 5.1 SYBR สีเขียว I รอบสีย้อมระหว่างสถานะที่ไม่ถูกผูกไว้ (ถูกตัด) และสถานะที่ถูกผูกไว้ (การหลอมผ่านส่วนขยาย) เมื่อปฏิกิริยาดำเนินไปและความเข้มของสัญญาณเพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณของแอมพลิฟายเออร์เพิ่มขึ้น

เมื่อซับซ้อนกับ dsDNA

รูปที่ 5.2 ตัวอย่างการวิเคราะห์เส้นโค้งละลาย สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA จะมีผลสะท้อนกลับดังนั้นความเข้มของการเรืองแสงจะลดลงเมื่ออุณหภูมิปฏิกิริยาเพิ่มขึ้นสูงกว่าอุณหภูมิหลอม (TM) การวิเคราะห์ประเภทนี้ช่วยให้สามารถตรวจจับผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงซึ่งละลายในอุณหภูมิที่แตกต่างจากผลิตภัณฑ์เฉพาะได้

โพรบ

ในการใช้งานทั้งหมดของ qPCR ปฏิกิริยาการขยายจะถูกขับเคลื่อนโดยไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับ อย่างไรก็ตามระบบตรวจจับโพรบไม่ได้รวมสีย้อมฟรีแต่เป็นสี oligonucleotide ที่สาม (และบางครั้งที่สี่) ที่เชื่อมกับสีย้อมของผู้รายงานและ/หรือความละเอียดอ่อนของดับเพลิง

โพรบที่มีการติดฉลากคู่

Probes ที่ติดฉลากแบบคู่ (หรือที่เรียกว่า Hydrolysis หรือ TaqMan^{® probes)} ถูกนำมาใช้ในการทดสอบ nuclease 5^2,3ซึ่งเป็นเคมีตรวจจับโพรบที่ได้รับความนิยมมากที่สุด (รูปที่ 5.3และดูภาพเคลื่อนไหวของหน้าเว็บต่อไปนี้: sigma.com/probe-animation โพรบที่มีฉลากคู่เป็นโอลิโกโน ucleotide เดี่ยวที่ติดฉลากด้วยสีย้อมของผู้รายงานและความนุ่มนวลของดับเพลิง นักข่าวตั้งอยู่ที่ปลาย 5 และดับที่ปลาย 3 '.. ดับดูดซับการเรืองแสงธรรมชาติของผู้รายงานมักจะโดยการถ่ายโอนพลังงานชนิด Forster เรียกว่าการถ่ายโอนพลังงานสะท้อนแสง (FRET) หลังจากการขยายจากไพรเมอร์ไปข้างหน้าพอลิเมอเรสดีเอ็นเอของ Taq พบกับโพรบ กิจกรรม exonuclease 5 ' ที่มีอยู่ในพอลิเมอเรสดีเอ็นเอ Taq จากนั้นแยกนักข่าว 5 ' ออกจากดับ 3 ' (ตารางที่ 5.2 รูปที่ 5.3) ซึ่งให้สัญญาณเรืองแสงที่เป็นสัดส่วนกับผลตอบแทนของแอมพลิจูด

การทดสอบการตรวจสอบด้วยไฮโดรไลซิสนั้นมีความเฉพาะเจาะจงและแม่นยำสำหรับการวัดปริมาณของเป้าหมายจำนวนสำเนาต่ำ ความจำเพาะสามารถปรับปรุงได้มากยิ่งขึ้นโดยการรวมนิวคลีโอไทด์ที่ดัดแปลงเช่น กรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคไว้ในโพรบ (ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง) โพรบดัดแปลงกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคจะมีประโยชน์อย่างยิ่งในการแยกแยะระหว่างโพลิเมอร์นิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNPs) หรือลำดับที่คล้ายกันอื่นๆ Probes ที่มีป้ายกำกับคู่ต้องได้รับการออกแบบอย่างระมัดระวัง (การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR)และโดยทั่วไปแล้วจะมีราคาแพงกว่าสีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA นอกจากนี้ในขณะที่การขยายตัวของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงอาจยังคงไม่ถูกตรวจพบปฏิกิริยาด้านข้างอาจทำให้ปฏิกิริยาโดยรวมมีประสิทธิภาพน้อยลงดังนั้นการวิเคราะห์ที่มีโพรบอาจยังได้รับประโยชน์จากการเพิ่มประสิทธิภาพ (การทำให้บริสุทธิ์ตัวอย่างและการประเมินคุณภาพ)

รูปที่ 5.3 Mechanism of Dual-Labeled Probes. โพลิเมอร์ดีเอ็นเอของ Taq ขยายไพรเมอร์ที่อยู่บนเกลียวเดียวกับโพรบจนกว่าจะถึงตำแหน่งโพรบ กิจกรรม exonuclease โดยธรรมชาติไฮโดรไลซ์โพรบจาก 5 ' ถึง 3 ' ซึ่งปล่อยสีย้อมของผู้รายงานออกมาเป็นสารละลายและทำให้เกิดการเรืองแสงเพิ่มขึ้น สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่วัดได้จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณ DNA ของเป้าหมาย

วงจรความร้อน PCR แบบเรียลไทม์ส่วนใหญ่จะมีช่องการตรวจจับหลายช่องซึ่งช่วยให้สามารถเลือกฉลากโพรบได้อย่างยืดหยุ่น การเลือกสีย้อมของผู้รายงานที่เข้ากันได้กับช่องการตรวจจับของอุปกรณ์เป็นสิ่งสำคัญและตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีตัวกรองและการปรับเทียบที่ถูกต้อง เมื่อทำการมัลติเพล็กซิ่งจะต้องมีการรวมตัวของผู้รายงานที่แตกต่างกันมากที่สุดเท่าที่จะทำได้เพื่อลดการพูดไขว้แบบออปติคัล ผู้สื่อข่าวทั่วไปได้แก่: Fam, hex, TxRd (Sulforhodamine 101 X) และ Cyanine 5 ภายใต้สภาวะที่เหมือนกันเป็นเรื่องปกติที่จะสังเกตความแตกต่างของความเข้มของการปล่อยไอเสียจากผู้สื่อข่าวที่แตกต่างกัน ด้วยเหตุนี้จึงขอแนะนำให้วิเคราะห์ข้อมูลจากการรวมตัวของผู้รายงานแต่ละรายอย่างอิสระ (โดยใช้การตั้งค่าเกณฑ์ที่แตกต่างกันตามความเหมาะสมสำหรับการปล่อยโพรบ)

โมเลกุลบีคอน (Molecular Beacons)

Beacons โมเลกุล (หรือที่เรียกว่าโพรบ hybridization) เป็นโพรบเดี่ยวที่ยึดอยู่ในการก่อตัวของวงแบบกิ๊บ (นิวคลีโอไทด์ 20 –ตัว) โดยลำดับลำต้นเสริม (นิวคลีโอไทด์ 4 – 6ตัว) ที่ปลายแต่ละด้าน 25 (รูปที่ 5.4) ห่วงกิ๊บติดผมเป็นส่วนเสริมของแม่แบบและลำดับก้านไฮโดรเจนผูกมัดช่วยให้ดับ 3 ' เพื่อระงับการเรืองแสงของนักข่าว 5 ' (ตารางที่ 5.3) เมื่อโพรบมีอิสระในการแก้ปัญหา

รูปที่ 5.4 Mechanism of Molecular Beacons. โมเลกุลบีคอนผสมพันธุ์กับลำดับเป้าหมายเฉพาะของพวกเขาทำให้โครงสร้างกิ๊บห่วงเปิดแยกนักข่าว 5 จากดับ 3 ' เนื่องจากตัวดับไม่อยู่ใกล้กับผู้รายงานอีกต่อไปการปล่อยฟลูออเรสเซนต์จึงเกิดขึ้น กลไกการตรวจจับของ Molecular Beacons ไม่ได้ขึ้นอยู่กับการเสื่อมสภาพในระหว่างการเกิดปฏิกิริยาซึ่งแตกต่างจากโพรบที่ติดฉลากแบบคู่ สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่วัดได้จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณ DNA ของเป้าหมาย

 

LightCycler Probe หรือระบบ FRET (หรือที่เรียกว่าโพรบ dualhybridization) ประกอบด้วยโพรบ oligonucleotides ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์เดี่ยว^{5,6 คู่} (รูปที่ 5.5) โพรบ Oligo Probe 1 มีป้ายกำกับที่ปลาย 3 ' ด้วยสีย้อมฟลูออโรโพรบของผู้บริจาคและ Oligo Probe 2 มีป้ายกำกับที่ปลาย 5 ' ด้วยสีย้อมฟลูออโรโพรบที่มีอยู่ไม่กี่ตัว (ตารางที่ 5.4) กลุ่มไฮดรอกซิลฟรี 3’ของ Oligo Probe 2 จะต้องถูกบล็อกด้วยกลุ่มฟอสเฟตเพื่อป้องกันการขยายตัวของ DNA polymerase

รูปที่ 5.5 กลไกของโพรบ LightCycler FRET ในระหว่างขั้นตอนการอบอ่อนไพรเมอร์และโพรบทั้งสองจะผสมเข้ากับพื้นที่เป้าหมายเฉพาะของพวกเขาทำให้สีย้อมผู้บริจาคอยู่ใกล้กับสีย้อมตัวรับ (โพรบมักจะเว้นระยะห่าง 1 ถึง 5 นิวคลีโอไทด์) เมื่อผู้บริจาคตื่นเต้นกับแสงจากเครื่องมือ PCR แบบเรียลไทม์พลังงานจะถูกถ่ายโอนโดย FRET จากผู้บริจาคไปยังผู้ยอมรับ ตรวจพบความยาวคลื่นการปล่อยสีย้อมบนโพรบตัวรับ การเพิ่มขึ้นของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณ DNA เป้าหมาย

Scorpions^® Probes

 โพรบ Scorpions ® มีให้เลือกสองรูปแบบคือโพรบแบบชิ้นเดียวและโพรบแบบสองชิ้น Uni-probe ประกอบด้วยโครงสร้างแบบ stem-loop คล้ายกับ Molecular Beacon แต่สิ่งนี้แนบมากับไพรเมอร์ไปข้างหน้าด้วยตัวป้องกัน PCR ที่อยู่ระหว่างสองส่วน oligo⁷ (ตัวป้องกันป้องกันป้องกันไม่ให้ Taq DNA Polymerase ขยายไพรเมอร์ (รูปที่ 5.6A, ตารางที่ 5.5)

โครงสร้างสองหัวเป็นแบบดูเพล็กซ์กับนักข่าว 5 ' ลำดับการสอบสวนตัวบล็อก PCR และไพรเมอร์ไปข้างหน้าบนเส้นหนึ่งและตัวดับ 3 ' บนเส้นอื่นๆช่อดับเป็นสองเท่ากับสาระนักข่าว (รูปที่ 5.6B)

รูปที่ 5.6 กลไกของ Scorpions ® Probes โพรบแบบตัวเดียว A) จะมีส่วนประกอบโพรบทั้งหมดอยู่บนเกลียวเส้นเดียวในขณะที่โพรบแบบสองตัว B) จะมีองค์ประกอบโพรบอยู่บนเกลียวสองเส้น Scorpions ® Probes ทั้งสองรูปแบบประกอบด้วยไพรเมอร์ PCR ไปข้างหน้า สีรองพื้นแบบไปข้างหน้านี้จะถูกขยายให้กลายเป็นส่วนหนึ่งของแอมพลิฟายเออร์ที่เพิ่งสร้างขึ้นใหม่ ในระหว่างการหลอม/การขยายตัวลำดับการสอบสวนใน Scorpions ® จะผสมกับแม่แบบซึ่งจะแยกผู้รายงานออกจากตัวดับและส่งผลให้เกิดสัญญาณเรืองแสง เนื่องจากหางของ Scorpions ® และแอมพลิฟายเออร์เป็นส่วนหนึ่งของเกลียวเดียวกันการโต้ตอบการตรวจจับจึงเป็นภายในโมเลกุลและรวดเร็วกว่าระบบตรวจจับโพรบอื่นๆ โดยทั่วไปแล้วเทมเพลตจะได้รับเลือกให้อยู่ระหว่าง 5 และ 50 ฐานจากตอนท้ายของไพรเมอร์ Scorpions ® 3 ทั้ง Scorpions ® แบบที่วัดอุณหภูมิแบบ Uni-probe และแบบ Bi-probe จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์แบบย้อนกลับแยกต่างหาก

เครื่องดับเพลิง

ระบบตรวจจับโพรบส่วนใหญ่ต้องการความนุ่มนวลของตัวดับ บางส่วนของผู้ที่ใช้ในโครงสร้างโพรบเดิมเป็นตัวรับสีย้อมเรืองแสงเช่น TAMRA ซึ่งทำงานได้ดีกับ FAM แต่ไม่เหมาะสำหรับสีย้อมอื่นๆ ในฐานะที่เป็นสีย้อมของนักข่าว TAMRA ผลิตฟลูออเรสเซนซ์ดังนั้นจึงอาจส่งผลให้อัตราส่วนสัญญาณต่อเสียงรบกวนไม่ดี ด้วยเหตุนี้จึง มีการพัฒนาอุปกรณ์ดับเพลิงที่ปล่อยความร้อนแทนแสงเช่น Black Hole Quencher ® (BHQ ®) โดย Biosearch Technologies ทางเลือกของดับเข้มเป็นทางเลือกที่นิยมในการย้อมโมเลกุลให้ดับกว่าช่วงกว้างของความยาวคลื่นและเปิดความเป็นไปได้ของปฏิกิริยา multiplex ที่มีจำนวนมากของการรวมเป้าหมาย/สอบสวน

Onyx Quencher ™ (OQ ™) เป็นดับเพลิงที่เป็นกรรมสิทธิ์จาก Sigma-Aldrich มีเวอร์ชันแก้ไขดัดแปลงสี่เวอร์ชัน (OQA, OQB, OQC และ OQD) ตามที่แสดงใน ตารางที่ 5.6Onyx Quenchers ทั้งสี่เข้ากันได้กับสีย้อมนักข่าวยอดนิยมที่หลากหลาย

ข้อมูลที่แสดงใน รูปที่ 5 7 แสดงการขยายของแม่แบบเทียมที่ได้มาจาก oligo สังเคราะห์สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของการทดสอบเป้าหมาย Schistosoma mansoni⁸ การตรวจจับใช้โพรบที่ติดฉลาก FAM ที่มีตัวดับแบบมืดที่เทียบเท่ากัน, CDQ (A) หรือ OQA (B) จากข้อมูลเหล่านี้จะเห็นได้ชัดว่าทั้ง CDQ และ OQA มีประสิทธิภาพเทียบเท่ากับเรืองแสงพื้นหลังที่คล้ายกันและ  ค่า Cq ที่คล้ายกันสำหรับข้อมูลที่วิเคราะห์จากเทมเพลตที่มีความเข้มข้นเท่ากัน

โดยสรุป OQ เทียบเท่ากับประสิทธิภาพของ CDQ และที่สำคัญคือมีใบอนุญาตข้อจำกัดและค่าลิขสิทธิ์ฟรีสำหรับแอปพลิเคชันใดๆ ซึ่งทำให้ Onyx Quencher เป็นตัวเลือกที่ยอดเยี่ยมและคุ้มค่าสำหรับการพัฒนาชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์และน้ำยาสำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลที่มีโพรบ qPCR

รูปที่ 5.7 การเจือจางของ oligo เทียมถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ 250 นิวตันเมตรและแอมพลิฟายเออร์ที่ตรวจพบด้วยโพรบแบบสองฉลากที่ 200 นิวตันเมตร a) โพรบมีป้ายกำกับ FAM และดับด้วย CDQ หรือ OQA (ตามที่ระบุ) และแสดงข้อมูลการเรืองแสงดิบ b) โพรบถูกติดฉลากด้วย FAM และดับด้วย CDQ หรือ OQA และข้อมูลที่ได้รับการแก้ไขพื้นฐานจะปรากฏขึ้น ไม่มีความแตกต่างที่สำคัญระหว่างประสิทธิภาพของโพรบทั้งสอง

Nucleic Acid Analogs

สามารถใช้การดัดแปลงจำนวนมากเพื่อผลิต oligonucleotides ที่มีคุณสมบัติทางชีวเคมีที่เปลี่ยนแปลง การปรับเปลี่ยนเหล่านี้มักสอดคล้องกับ _TM ที่สูงกว่าซึ่งสามารถจัดการได้เพื่อให้มีความจำเพาะที่ดีขึ้น ซึ่งจะช่วยในการออกแบบการวิเคราะห์ในภูมิภาคที่มีลำดับความท้าทายหรือเมื่อจำเป็นต้องใช้ oligonucleotide เพียงครั้งเดียวในการตรวจหาหลายลำดับเช่นเซโรไทป์ทั้งหมดของไวรัส

Locked Nucleic Acid

กรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคเป็นฐานอะนาล็อก RNA (รูปที่ 5.8) ที่ให้ความไวและความจำเพาะที่เพิ่มขึ้นเมื่อรวมเข้ากับโพรบ⁹ โพรบที่มีฐานกรดนิวคลีอิกที่ล็อคไว้จะมีเสถียรภาพทางความร้อนมากขึ้นดังนั้นจึงสามารถเชื่อมต่อกับเทมเพลตได้มากขึ้น ฐานกรดนิวคลีอิกที่ล็อคแต่ละตัวอาจเพิ่ม _TM ของโพรบได้ถึง 8°C¹⁰ซึ่งทำให้กรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการวิเคราะห์การเลือกปฏิบัติ SNP¹¹ (การไม่ตรงกันของฐานเดียวมีผลต่อการทำให้เสถียรมากขึ้นในการก่อตัวแบบดูเพล็กซ์มากกว่าโดยไม่ต้องล็อค  กรดนิวคลีอิก), มัลติเพล็กซ์ (ช่วยให้การเพิ่มประสิทธิภาพ TM ง่ายขึ้น) และลำดับเป้าหมายที่มีปัญหา (โพรบกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคอาจสั้นลง ซึ่งจะช่วยให้พวกเขาได้รับการออกแบบเกี่ยวกับปัญหาเช่นภูมิภาคที่อุดมไปด้วย AT- หรือ GC ลำดับซ้ำหรือลำดับที่มีโครงสร้างรองที่สำคัญ) ไพรเมอร์ PCR ที่มีกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคยังพบว่ามีประโยชน์ในการใช้งานเช่น SNP genotyping¹²

กรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคยังให้การป้องกันการย่อยอาหารนิวไคลด์ทำให้เหมาะสำหรับการใช้ในร่างกาย¹³

รูปที่ 5.8 การเปรียบเทียบโครงสร้างนิวคลีอิกแอซิดและดีเอ็นเอนิวคลีโอไทด์ที่ถูกล็อค กรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคแตกต่างจากดีเอ็นเอในกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อคมี ribose กับสะพานเมทิลีนระหว่างออกซิเจน 2 และคาร์บอน 4 ซึ่ง ' ล็อค ' ไรโบเซสในการก่อตัวของเอ็นโด 3 ' ในขณะที่ดีเอ็นเอมี 2 '-deoxyribose ที่ไม่มีสะพานเมทิลีน

สรุป

มีข้อควรพิจารณาหลายประการเมื่อเลือกวิธีการตรวจจับสำหรับการประยุกต์ใช้งานเฉพาะ แม้ว่าสีย้อม SYBR Green I และการวิเคราะห์โพรบแบบติดฉลากคู่จะได้รับความนิยมและใช้งานได้ดีแต่ก็มีสถานการณ์ที่ระบบตรวจจับอื่นๆอาจได้รับความนิยมมากกว่า ตารางที่ 5 7 สามารถใช้เป็นแนวทางในระหว่างการพัฒนาการทดสอบในช่วงต้น

ช่องว่างระบุว่าไม่แนะนำให้ใช้วิธีการตรวจจับ X = ประสิทธิภาพที่ดีและ XX = ประสิทธิภาพที่ดีกว่า

ข้อมูลอ้างอิง

1. Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. 1997. Product Differentiation by Analysis of DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction. Analytical Biochemistry. 245(2):154-160. https://doi.org/10.1006/abio.1996.9916

2. Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88(16):7276-7280. https://doi.org/10.1073/pnas.88.16.7276

3. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. 1996. Real time quantitative PCR.. Genome Research. 6(10):986-994. https://doi.org/10.1101/gr.6.10.986

4. Tyagi S, Kramer FR. 1996. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14(3):303-308. https://doi.org/10.1038/nbt0396-303

5. Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP. 1997. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. BioTechniques. 22(1):130-138. https://doi.org/10.2144/97221bi01

6. Bernard PS, Ajioka RS, Kushner JP, Wittwer CT. 1998. Homogeneous Multiplex Genotyping of Hemochromatosis Mutations with Fluorescent Hybridization Probes. The American Journal of Pathology. 153(4):1055-1061. https://doi.org/10.1016/s0002-9440(10)65650-7

7. Whitcombe D, Theaker J, Guy SP, Brown T, Little S. 1999. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat Biotechnol. 17(8):804-807. https://doi.org/10.1038/11751

8. 2013. PCR Technologies: Current Innovations.. CRC Press.

9. Costa J, Ernault P, Olivi M, Gaillon T, Arar K. 2004. Chimeric LNA/DNA probes as a detection system for real-time PCR. Clinical Biochemistry. 37(10):930-932. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2004.05.020

10. Petersen M, Wengel J. 2003. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends in Biotechnology. 21(2):74-81. https://doi.org/10.1016/s0167-7799(02)00038-0

11. Johnson MP. 2004. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR. Nucleic Acids Research. 32(6):e55-e55. https://doi.org/10.1093/nar/gnh046

12. Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM. 2003. Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3? locked nucleic acid (LNA) primers. Hum. Mutat.. 22(1):79-85. https://doi.org/10.1002/humu.10228

13. Wahlestedt C, Salmi P, Good L, Kela J, Johnsson T, Hokfelt T, Broberger C, Porreca F, Lai J, Ren K, et al. 2000. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97(10):5633-5638. https://doi.org/10.1073/pnas.97.10.5633