[ข้ามไปยังเนื้อหา](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th) สินค้า รถเข็น0 THTH สินค้า [เข้าสู่ระบบ / ลงทะเบียน](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [ค้นหาคำสั่งซื้อ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/order-lookup) [สั่งซื้อด่วน](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/quick-order) รถเข็น0 [หน้าแรก](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th)[การประยุกต์ใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/applications/genomics/pcr)การแก้ไขปัญหา RT-PCR # การแก้ไขปัญหา RT-PCR ## ในหน้านี้ - [การพัฒนาโปรโตคอลการแก้ไขปัญหา](https://www.sigmaaldrich.com#developing) - [การปรับแต่งการออกแบบ Oligo](https://www.sigmaaldrich.com#oligos) - [การเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์ PCR](https://www.sigmaaldrich.com#inadequate) - [การออกแบบการวิเคราะห์ RT-PCR และ QPCR](https://www.sigmaaldrich.com#design) - [คุณภาพเทมเพลต RNA หรือ DNA](https://www.sigmaaldrich.com#template) - [โปรแกรม PCR การวิเคราะห์](https://www.sigmaaldrich.com#assay) - [Thermo Cycler ทำงานผิดปกติ](https://www.sigmaaldrich.com#instrument) - [Troubleshooting Examples: Diagnostic Tools](https://www.sigmaaldrich.com#troubleshooting) - [การแยกตัว/ละลายเส้นโค้ง](https://www.sigmaaldrich.com#dissociation) - [การแก้ไขปัญหากรณีศึกษา RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com#troubleshootingcase) - [สรุป—รายการตรวจสอบการแก้ไขปัญหา PCR](https://www.sigmaaldrich.com#summary) ## การพัฒนา PCR หรือ RT-PCR Troubleshooting Protocol ### สาเหตุที่เป็นไปได้ของข้อผิดพลาดและ/หรือปัญหาข้อผิดพลาดของผู้ปฏิบัติงาน มีความเป็นไปได้มากมายสำหรับข้อผิดพลาดของผู้ควบคุม แหล่งที่มาของข้อผิดพลาดเหล่านี้มักไม่สามารถระบุได้ ขั้นตอนแรกในขั้นตอนการแก้ไขปัญหาใดๆคือการตรวจสอบโปรโตคอลและทำการทดสอบซ้ำ การตรวจสอบโปรโต [](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction)คอล (ดูภาคผนวก A, โปรโตคอลของคู่มือนี้) และขอให้นักชีววิทยาโมเลกุลที่มีประสบการณ์ทบทวนแผนการทดลองเป็นสิ่งสำคัญ เรื่องราวข้อควรระวังของเพื่อนหลังปริญญาเอกที่วิ่ง PCR ที่ล้มเหลวหลายครั้งก่อนที่จะตระหนักว่า dNTPs หายไปจาก [ต้นแบบ PCR Mi](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-master-mix) xis เตือนว่าแม้แต่นักวิทยาศาสตร์ที่ทำงานมากเกินไปที่ดีที่สุดก็มีความเสี่ยงต่อข้อผิดพลาดง่ายๆ #### มาสเตอร์มิกซ์ ความผิดพลาดหรือปัญหากับส่วนผสมหลักของส่วนประกอบปฏิกิริยาอาจเป็นแหล่งที่มาของความล้มเหลวร้ายแรงของการขยายในตัวอย่างทั้งหมดและการควบคุมเชิงบวก ก่อนที่จะทำการทดสอบซ้ำให้ตรวจสอบส่วนประกอบทั้งหมดและความเข้มข้นของส่วนประกอบเหล่านั้น หากมีการใช้น้ำยาชุดใหม่จะเป็นการป้องกันที่มีประโยชน์ในการรันน้ำยาชุดใหม่ก่อนที่จะเริ่มใช้งานในชุดการทดลองที่สำคัญ  เมื่อเปลี่ยนผลิตภัณฑ์หลักผสมเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องตระหนักว่าการวิเคราะห์บางอย่างมีความไวเป็นพิเศษต่อการจัดองค์ประกอบบัฟเฟอร์/อุณหภูมิการหลอม(Ta)/การผสมความเข้มข้นของไพรเมอร์ การเปลี่ยนแปลงสิ่งใดสิ่งหนึ่งเหล่านี้อาจส่งผลให้เกิดประสิทธิภาพที่แตกต่างกัน ดังนั้นให้ตรวจสอบการวิเคราะห์ทั้งหมดในการผสมมาสเตอร์ที่เลือกและบนเครื่องมือที่ต้องการทั้งหมดก่อนที่จะทำการเปลี่ยนแปลงที่รุนแรง นอกจากนี้ยังจำเป็นต้องทบทวนคำแนะนำที่มาพร้อมกับส่วนผสมหลักแต่ละชนิดเนื่องจากระบุเงื่อนไขที่แนะนำซึ่งเหมาะสำหรับเอนไซม์กลไกการสตาร์ทร้อนและส่วนประกอบบัฟเฟอร์ที่กำหนด   ปัญหาJumpStart ™ Taq ReadyMix ™ไม่ทำงานเช่นเดียวกับ ผลิตภัณฑ์ที่คล้ายกันจากซัพพลายเออร์รายอื่น สาเหตุที่เป็นไปได้ - การบ่มเบื้องต้นที่ไม่ถูกต้องที่อุณหภูมิ 95°C เป็นเวลา 15 นาทีถูกใช้เป็น โปรโตคอล Hot Start/Denaturation ก่อนการปั่นจักรยาน (การใช้ โปรโตคอล Hot Start มาตรฐาน ที่ไม่เหมาะสมโดยทั่วไปจะใช้สำหรับเอนไซม์ที่ไม่มีการกระตุ้นทางเคมี) - เงื่อนไขการปรับแต่งสีรองพื้นแตกต่างกันเล็กน้อยระหว่าง ReadyMixes Diagnostic Test - ตรวจสอบโปรไฟล์เทอร์โมไซเคิล - ตรวจสอบสภาพปฏิกิริยาที่เหมาะสมที่สุดสำหรับไพรเมอร์ โซลูชัน - การบ่มเชื้อครั้งแรกที่อุณหภูมิ 3 นาทีที่ 94°C เพียงพอที่จะเปิดใช้งาน JumpStart Taq การบ่มนานขึ้นจะทำให้เอนไซม์หยุดทำงานบางส่วน ( โปรโตคอล Hot Start เฉพาะสำหรับแอนติบอดีหยุดใช้งาน JumpStart Taq) - ปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์หรืออุณหภูมิการหลอม (ตา) ปัญหาPCR ReadyMix ใช้ได้กับ PCR แต่ไม่ใช่สำหรับ qPCR แต่ ผลิตภัณฑ์ที่เทียบเท่ากันจากซัพพลายเออร์รายอื่นใช้งานได้ดี สาเหตุที่เป็นไปได้ - REDTaq® ReadyMix ถูกใช้สำหรับ qPCR แบบเรียลไทม์ - ReadyMix ที่ไม่มีสีย้อมอ้างอิงถูกใช้บน เครื่องมือที่มีข้อกำหนดสีย้อมอ้างอิงหรือ มีความเข้มข้นที่ไม่เหมาะสมรวมอยู่ด้วย - ReadyMix ที่ออกแบบมาสำหรับใช้กับโพรบถูกใช้โดยไม่มี โพรบในปฏิกิริยา Diagnostic Test - ตรวจสอบตัวเลือก ReadyMix และสีของส่วนผสม qPCR โซลูชัน - ใช้ ReadyMixes ที่เหมาะสมสำหรับการใช้งาน PCR ที่ต้องการ สีย้อมสีแดง จะรบกวนการตรวจจับการเรืองแสงในเครื่องมือ qPCR ส่วนใหญ่ เป็นการปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการเพื่อให้แน่ใจว่ามีการเตรียมส่วนผสมหลักของปฏิกิริยาเพียงพอสำหรับตัวอย่างทั้งหมดที่จะใช้ร่วมกัน ตรวจสอบให้แน่ใจว่าส่วนประกอบทั้งหมดได้รับการละลายและผสมอย่างดีและส่วนผสมหลักของการทดลองผสมกันอย่างดีก่อนที่จะแบ่งตัวอย่าง ซึ่งเกี่ยวข้องกับบัฟเฟอร์ 2 × บางส่วนเช่น KiCqStart® ที่มีความหนืดมากกว่าบัฟเฟอร์ PCR ปกติ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Oligo Optimization Oligos อาจทำให้เกิดปัญหาหากเป็นลำดับที่ไม่ถูกต้องหรือออกแบบมาไม่ดีทำงานที่ความเข้มข้นต่ำกว่าที่เหมาะสม Ta ย่อยที่เหมาะสมหรือติดฉลากไม่เพียงพอหรือดับ (สำหรับโพรบ) การทดสอบที่ทำงานภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ oligo หรือการใช้การออกแบบที่ไม่ดีอาจทำให้ได้ข้อมูลบางอย่างแต่อาจไม่ได้สะท้อนถึงชีววิทยาของแท้ภายใต้การพิจารณา เมื่อได้รับ oligo lyophilized มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะ: 1. ตรวจสอบลำดับ 2. Ensure that all DNA is resuspended prior to use 3. ยืนยันว่าสารละลายมีความเข้มข้นตามที่คาดไว้ resuspend oligos โดยการให้ความร้อน oligo ถึง 90°C เป็นเวลา 5 นาทีแล้วผสมให้เข้ากัน รอบการละลายน้ำแข็งแบบแช่แข็งซ้ำๆอาจส่งผลต่อประสิทธิภาพการทำงานของ oligo ดังนั้น oligos ทั้งหมดที่ความเข้มข้นของสต็อก (โดยปกติ 100 μM) ควรจะเป็น aliquoted และเก็บไว้ที่ -20°C หรือ -80°C ในระยะยาว ในระหว่างขั้นตอนการแก้ไขปัญหาจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องตรวจสอบว่าลำดับที่ถูกต้องได้รับการสั่งซื้อโดยกลับไปที่ลำดับเป้าหมายและยืนยันว่ามีลำดับ oligo อยู่จริง ตรวจสอบให้แน่ใจว่าคุณภาพของ oligo ถูกต้องโดยติดต่อผู้ขาย oligo วัดความเข้มข้นในการทำงานของ oligo และตรวจสอบโมเลกุลฟลูออเรสเซนต์ด้วยสายตาเพื่อยืนยันว่ามีการติดฉลาก ทดสอบไพรเมอร์ของการวิเคราะห์โพรบใน ส่วนผสม SYBR ® Green I qPCR เพื่อตรวจสอบการขยาย พิจารณาการปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์หรือ Ta ให้เหมาะสม (ดูที่ [การปรับประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation)) เมื่อใช้โพรบเป็นครั้งแรกให้รวบรวมข้อมูลฟลูออเรสเซนต์สำหรับความยาวคลื่นที่อาจเกิดขึ้นให้มากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้เพื่อให้สามารถตรวจสอบการรั่วไหลของสัญญาณระหว่างช่องและสามารถตรวจจับความผิดพลาดในการติดฉลากได้ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การเพิ่มประสิทธิภาพ PCR ไม่เพียงพอ ผลของการเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบได้รับการอธิบายและแสดงให้เห็นใน [การเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบและการตรวจสอบ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) เมื่อการวิเคราะห์ล้มเหลวหรือทำงานได้ดีกว่าแต่ไม่มีข้อผิดพลาดในการออกแบบหรือขั้นตอนการดำเนินงานอาจได้รับประโยชน์จากการเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขการทดลอง เมื่อทำการแก้ไขปัญหาให้ทดสอบไพรเมอร์ที่ความเข้มข้นขั้นสุดท้าย 100 Nm, 500 Nm และ 900 Nm และ/หรือ Ta ระหว่าง 55°C ถึง 70°C (โดยใช้การไล่ระดับอุณหภูมิ) เพื่อระบุว่าการวิเคราะห์จะปรับปรุงด้วยการเพิ่มประสิทธิภาพเพิ่มเติมหรือไม่ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การออกแบบการวิเคราะห์ RT-PCR และ QPCR การออกแบบการวิเคราะห์ได้รับการอธิบายไว้ใน [การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) เมื่อแก้ไขปัญหาการวิเคราะห์ตรวจสอบให้แน่ใจว่าการออกแบบได้รับการตรวจสอบแล้ว ยืนยันว่าตำแหน่งไพรเมอร์ PCR/qPCR และแอมพลิฟายเออร์สอดคล้องกับโปรโตคอลการล่อน้ำมัน RT ตัวอย่างเช่นตรวจสอบให้แน่ใจว่าการวิเคราะห์ที่ใช้กับ cDNA ที่เตรียมไว้หลังจากการเตรียมรองพื้น oligo-DT นั้นอยู่ที่ 3’ของทรานสคริปท์ ตรวจสอบให้แน่ใจว่าข้อมูลลำดับมีความน่าเชื่อถือและมีการพิจารณาสายพันธุ์การต่อที่เหมาะสมและ SNPs ปัญหาการวิเคราะห์ไม่ไวต่อความรู้สึกและการขยายสัญญาณดู ผิดปกติ (รูปที่ 11 1 สาเหตุที่เป็นไปได้ - การออกแบบการวิเคราะห์ไม่เหมาะสม - โพรบติดฉลากไม่เพียงพอ - การวิเคราะห์ต้องการการปรับให้เหมาะสม Diagnostic Test - ตรวจสอบการออกแบบการวิเคราะห์ (ขอตรวจสอบการออกแบบโดย ทีมเทคนิคผลิตภัณฑ์ที่กำหนดเองของเรา) - ตรวจสอบการอ่านค่าการเรืองแสงพื้นหลังบนข้อมูลดิบ/ พล็อตหลายองค์ประกอบ - Verify optimization. โซลูชัน - ในตัวอย่างที่แสดงใน รูปที่ 11 1 1 การตรวจสอบการออกแบบการวิเคราะห์พบการออกแบบโพรบที่มีโครงสร้างรองที่สำคัญซึ่งจะนำไปสู่ผลกระทบที่สังเกตได้ (รูปที่ 11 บี) โซลูชันที่เหมาะสมคือ การออกแบบการวิเคราะห์ใหม่หากเป็นไปได้ เมื่อจำเป็นอย่างยิ่งการออกแบบที่ ต้องใช้ oligos ที่มีโครงสร้างรองอาจได้รับการช่วยเหลือโดยการเพิ่ม ปริมาณปฏิกิริยาสุดท้ายของ betaine หรือ DMSO ลงในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา และการเพิ่มประสิทธิภาพต่อไปได้น้อยกว่า 10 เปอร์เซ็นต์ ![การวิเคราะห์มีรายละเอียดพล็อตการขยายที่ผิดปกติโดยมีการเบี่ยงเบนที่เด่นชัดของเบสไลน์](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/pronounced-drift.jpg "การวิเคราะห์มีรายละเอียดพล็อตการขยายที่ผิดปกติโดยมีการเบี่ยงเบนที่เด่นชัดของเบสไลน์") __รูปที่ 11 1 ก__การวิเคราะห์มีรายละเอียดพล็อตการขยายที่ผิดปกติโดยมีการเบี่ยงเบนที่เด่นชัดของเบสไลน์ ![ลำดับของโพรบที่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ถูกป้อนลงในซอฟต์แวร์คาดการณ์การพับแบบพับ](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/sequence-for-the-probe.jpg "ลำดับของโพรบที่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ถูกป้อนลงในซอฟต์แวร์คาดการณ์การพับแบบพับ") __รูปที่ 11 1 บาท__ลำดับของโพรบที่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ถูกป้อนลงในซอฟต์แวร์คาดการณ์การพับแบบพับ เป็นที่ชัดเจนว่าโพรบสามารถใช้โครงสร้างพับที่มั่นคงในการแก้ปัญหาและอาจส่งผลให้เกิดปัญหาที่สังเกตได้ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)คุณภาพเทมเพลต RNA หรือ DNA ผลกระทบของคุณภาพเทมเพลตในประสิทธิภาพการทดสอบได้รับการอธิบายไว้ใน [การทำให้บริสุทธิ์ตัวอย่างและการประเมินคุณภาพ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/dna-and-rna-purification/sample-purification-and-quality-assessment) คุณภาพเทมเพลตประกอบด้วยการพิจารณาปริมาณความสมบูรณ์และการมีสารยับยั้ง จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าคุณภาพ RNA ตรงกับโปรโตคอล [การเตรียม RT](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription)ที่เหมาะสมที่สุด (ดูการถอดสคริปต์ย้อนกลับ) และใช้เทมเพลตคุณภาพดีที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ ในทำนองเดียวกันปริมาณของ RNA ที่เพิ่มลงในปฏิกิริยา RT จะต้องอยู่ภายในขอบเขตของโปรโตคอลและในหลายกรณีนี่ควรเหมือนกันสำหรับปฏิกิริยาทั้งหมด ReadyScript® เป็นข้อยกเว้นที่โดดเด่นสำหรับแนวทางนี้เนื่องจากการนำน้ำยาและโปรโตคอลนี้มาใช้จะให้ความเข้มข้น cDNA เชิงเส้นที่เป็นสัดส่วนกับปริมาณ RNA อินพุต เมื่อทำการแก้ไขปัญหาตัวอย่างที่ให้ปริมาณ Cq สูงกว่าที่คาดไว้ให้ ทำการทดสอบ SPUD หรือเจือจางตัวอย่างผ่านชุดการเจือจาง 1: 11 หรือ 1: 2 และทำการทดสอบซ้ำ (รูปที่ 1.1) เพื่อระบุตัวอย่างที่มีสารยับยั้ง ปัญหา  ข้อมูล Cq สำหรับการเจือจางของเส้นโค้งมาตรฐานจะมีระยะห่างไม่สม่ำเสมอ (รูปที่ 11 2 สาเหตุที่เป็นไปได้ - การออกแบบการวิเคราะห์ไม่เหมาะสมซึ่งนำไปสู่การล่อน้ำมันที่ไม่มีประสิทธิภาพ - มีข้อผิดพลาดในการเจือจางเทมเพลตสำหรับเส้นโค้งมาตรฐาน - ตัวอย่างมีสารยับยั้ง Diagnostic Test - ตรวจสอบCq ระหว่างการเจือจางแต่ละครั้ง (__ตารางที่ 11.1__ แสดง ข้อมูลการตีความ Δ รับ __รูปที่ 11.2__) - ตรวจสอบการออกแบบการวิเคราะห์ - ทำการทดสอบซ้ำกับการเจือจางแบบอนุกรมที่เตรียมไว้ใหม่ โซล  ูชัน - n ü ΔCqระหว่างการเจือจางข้อมูลแต่ละครั้ง__ที่แสดงในรูปที่ 11.2__ จะลดลงซึ่งจะมีแนวโน้มที่จะเป็น 3.3 รอบสำหรับ การเจือจาง 10 เท่า (__ตารางที่ 11.1__) ซึ่งแสดงว่าการขยายสัญญาณจะ มีประสิทธิภาพมากขึ้นเมื่อใช้เทมเพลตที่เจือจางซึ่งเป็นการตรวจสอบที่ สอดคล้องกับตัวอย่างที่มีสารยับยั้ง ![](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/10-fold-serial-dilution-of-a-dna-template.jpg) ![การขยายตัวของการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของแม่แบบ DNA](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/10-fold-serial-dilution-of-a-dna-template.jpg "การขยายตัวของการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของแม่แบบ DNA") __รูปที่ 11 2__การขยายตัวของการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของแม่แบบ DNA การทำซ้ำมีความแม่นยำแต่ n ü ΔCq ไม่สอดคล้องกันลดลงด้วยการเจือจางที่เพิ่มขึ้น ข้อมูลนี้ยังแสดงสัญญาณบวกในการควบคุมเทมเพลต NO (NTC) ที่ระบุการปนเปื้อนหรือการสร้างตัวปรับสีรองพื้นและการเจือจางน้อยกว่า 105 สำเนามีข้อมูลที่เหมือนกันกับ NTC | | | |-----------|---------------| | Dilution | Δวน Cq สูงสุด | | 107 → 106 | 5.4 | | 106 → 105 | 5.0 | | 105 → 104 | 3.6 | Table 11.1ความแตกต่างของ CQ ที่บันทึกไว้สำหรับการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของเทมเพลต (แสดงในรูปที่ 11 2 ปริมาณเทมเพลตยังเป็นสิ่งสำคัญที่ต้องพิจารณาอีกด้วย การใส่แม่แบบลงใน PCR มากเกินไปหรือน้อยเกินไปจะส่งผลให้เกิดปฏิกิริยาที่ล้มเหลวและแผนการขยาย qPCR ที่ผิดปกติ __รูปที่ 11.3__ แสดงปฏิกิริยาที่มีการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของแม่แบบ oligo เทียม การเจือจางที่ต่ำกว่ามีความเข้มข้นมากเกินไปสำหรับปฏิกิริยาที่จะมีประสิทธิภาพหรือสำหรับเครื่องมือในการประมวลผลข้อมูลพื้นฐานได้อย่างมีประสิทธิภาพ (__รูปที่ 11 3 ข__) ส่งผลให้เกิดการขยายที่ผิดปกติและข้อมูลที่ไม่น่าเชื่อถือ ![การขยายการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของเทมเพลตเทียมที่มีไพรเมอร์เฉพาะและโพรบที่ติดฉลาก FAM](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/artificial-template.jpg "การขยายการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของเทมเพลตเทียมที่มีไพรเมอร์เฉพาะและโพรบที่ติดฉลาก FAM") __รูปที่ 11 3 A)__การขยายการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าของเทมเพลตเทียมที่มีไพรเมอร์เฉพาะและโพรบที่ติดฉลาก FAM Cq ต่ำมากสำหรับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นแปลงการขยายไม่ได้เว้นระยะเป็นประจำและผิดปกติ b) แสดงข้อมูลดิบสำหรับแปลงขยายเหล่านี้ ปฏิกิริยาที่มีความเข้มข้นสูงสุดของชิ้นงานจะมีการเรืองแสงพื้นหลังที่สูงขึ้นอย่างมากและมีการเรืองแสงน้อยที่สุดผ่านปฏิกิริยา ## [](https://www.sigmaaldrich.com)โปรแกรม PCR การวิเคราะห์ เงื่อนไขการขี่จักรยาน PCR ต้องเหมาะสำหรับทั้งการทดลองและตัวทำปฏิกิริยา (เช่น ดู Master Mix) ไม่แนะนำให้ยอมรับการตั้งค่าอุปกรณ์เริ่มต้นโดยไม่มีการตรวจสอบ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)ความผิดปกติของไซโคลนความร้อน ความผิดพลาดของเครื่องมืออาจมีการโจมตีอย่างรุนแรงและอาจทำให้วินิจฉัยได้ยาก เพื่อป้องกันค่าใช้จ่ายในการซ่อมแซมที่มีราคาแพงตรวจสอบให้แน่ใจว่าผู้ปฏิบัติงานทุกรายได้รับการฝึกอบรมและดูแลอย่างเต็มที่ ความผิดพลาดของเครื่องมือบางอย่างทำให้เกิดความล้มเหลวร้ายแรงส่งผลให้ไม่มีการขยายหรือข้อมูลเรืองแสงในขณะที่บางอย่างบิดเบือนข้อมูลหรือรักษาตัวอย่างในลักษณะที่ไม่สม่ำเสมอสร้างความแตกต่างเทียมระหว่างตัวอย่างทางชีวภาพที่เหมือนกัน การใช้ตัวอย่างควบคุมที่มีการวิเคราะห์การควบคุมเป็นสิ่งที่ประเมินค่าไม่ได้สำหรับการแก้ไขปัญหา เมื่อสงสัยว่าอุปกรณ์มีความผิดปกติควรทำการทดสอบที่เชื่อถือได้และเหมาะสมที่สุดในทุกหลุม การตรวจสอบความสม่ำเสมอนี้จะเปิดเผยปัญหาที่เฉพาะเจาะจงกับภูมิภาคของเครื่องมือรวมถึงปัญหาการวิเคราะห์และเครื่องมือแยกต่างหาก ## [](https://www.sigmaaldrich.com)ตัวอย่างการแก้ไขปัญหา PCR แสดงการใช้เครื่องมือการวินิจฉัย หลังจากรัน PCR ที่วางแผนไว้เป็นอย่างดีแล้วจะมีเครื่องมือการวินิจฉัยหลายอย่างที่พร้อมใช้งานสำหรับการแก้ไขปัญหา: - ควบคุมตัวอย่างและการวิเคราะห์ - เจลจุดสิ้นสุด/SYBR สีเขียว I ย้อมรีเอเจนต์ - แพล๊อตขยาย (ตรวจสอบโปรไฟล์พล็อตซ้ำและการขยาย) - เส้นโค้งมาตรฐาน (เกรเดียนท์และ R2)/ ชุดการเจือจาง - จุดหลอมเหลว/การแยกตัว (SYBR Green I Dye, Molecular Beacons, Scorpions® Probes) - มุมมองข้อมูลดิบ/หลายองค์ประกอบ ### ควบคุมตัวอย่าง/ปฏิกิริยา ขอแนะนำให้ใช้ตัวควบคุมเป็นอย่างยิ่ง แทบจะเป็นไปไม่ได้เลยที่จะแก้ไขปัญหาการวิเคราะห์ที่ล้มเหลวโดยไม่มีข้อมูลจากชุดการควบคุมที่เหมาะสม Control Example Material Expected Result เหตุผลที่เป็นไปได้สำหรับ ผลลัพธ์ที่เป็นบวก เหตุผลที่เป็นไปได้สำหรับ ผลลัพธ์ที่เป็นลบ Positive sampleตัวอย่างที่มีรอยหยักเพื่อระบุ ลำดับการวิเคราะห์เช่น RNA/gDNA ที่แสดงออก/ มีรอยสักบวกถูกต้องAssay failure. ข้อมูลเชิงบวกใดๆจากตัวอย่างอื่นๆไม่น่าเชื่อถือ Positive assay controlกรดนิวคลีอิกใดๆที่เข้ากันได้กับการออกแบบการวิเคราะห์ PCR เช่น oligo-nucleotide เทียมหรือ plasmid conC ที่ได้รับ PCR ampliconบวกถูกต้องAssay failure. ข้อมูลเชิงบวกใดๆจากตัวอย่างอื่นๆไม่น่าเชื่อถือ Negative controlตัวอย่างทราบว่าไม่ควรมีลำดับการวิเคราะห์เช่น RNA/gDNA ที่ไม่ได้แสดง/ไม่มีส่วนผสมของเป้าหมายลบการวิเคราะห์ไม่เฉพาะเจาะจงหรือมีการปนเปื้อนของการควบคุมในระหว่างการเตรียม PCRถูกต้อง การควบคุมการวิเคราะห์เชิงลบจากการปนเปื้อน (ไม่มีการควบคุมเทมเพลต NTC)น้ำลบสีรองพื้นจะถูกปรับด้วยตนเองซึ่งส่งผลให้ผลิตภัณฑ์สีรองพื้นลดความร้อนหรือมีการปนเปื้อนของการควบคุมในระหว่างการเตรียม PCRถูกต้อง RT-Specific Controls Example Material Expected Result Reasosn ที่เป็นไปได้สำหรับ ผลลัพธ์ที่เป็นบวก เหตุผล Posgble สำหรับ ผลลัพธ์เชิงลบ ลบการควบคุมเอนไซม์ RT เชิงลบตัวอย่างอาร์เอ็นเอและส่วนประกอบทั้งหมดของการแก้ไข RT ยกเว้นเอนไซม์ RT ซึ่งควรดำเนินการกับตัวอย่างทั้งหมดให้มีความเป็นจริงโดยไม่มีลำดับที่ขยายภายใต้สภาวะ PCR โดยไม่จำเป็นต้องมี RT เช่นการปนเปื้อน gDNAลบตัวอย่างมี gDNA ปฏิกิริยากลายเป็นการตั้งค่าระยะเวลาที่ปนเปื้อน สีรองพื้นทำให้เกิดผลิตภัณฑ์รองพื้นรองพื้น วิเคราะห์ด้วย NTCถูกต้อง การพิมพ์เฉพาะทางพันธุกรรม Example Material Expected Result เหตุผลที่เป็นไปได้สำหรับผลลัพธ์ที่เป็นบวก เหตุผลที่เป็นไปได้สำหรับผลลัพธ์ที่เป็นลบ การวิเคราะห์เป้าหมายเชิงบวกเฉพาะเทมเพลต Wild Type (WT) ที่ตรวจพบด้วยการวิเคราะห์ WT และเป้าหมายที่กลายพันธุ์ถูกถอดออกด้วยการวิเคราะห์แบบกลายพันธุ์บวก ถูกต้อง - เกิดข้อผิดพลาดระหว่างการเตรียมการวิเคราะห์ - การวิเคราะห์ต้องการการออกแบบใหม่ - There is a problem with one of the component oligos. - การวิเคราะห์ต้องการการเพิ่มประสิทธิภาพเพิ่มเติม เป้าหมายเชิงลบเฉพาะของการวิเคราะห์เทมเพลต WT ถูกแยกด้วยการวิเคราะห์แบบกลายพันธุ์และเป้าหมายที่กลายพันธุ์ที่ตรวจพบด้วยการวิเคราะห์ WTลบ (หรือ CG ค่อนข้างสูง เมื่อเทียบกับการควบคุมเชิงบวก) - ปฏิกิริยามีการปนเปื้อนระหว่างการตั้งค่า - การวิเคราะห์ไม่เฉพาะเจาะจงและต้องการการปรับแต่งหรือการออกแบบใหม่ ถูกต้อง ทดสอบการควบคุม heterozygoteเทมเพลต heterozygote หรือการผสมผสานแบบ 1:1 ของ homozygote แต่ละตัวที่ตรวจพบด้วยการทดสอบ WT และด้วยการทดสอบแบบกลายพันธุ์บวกกับการวิเคราะห์ทั้งสองถูกต้อง - เกิดข้อผิดพลาดระหว่างการเตรียมการวิเคราะห์ - การวิเคราะห์ต้องการการออกแบบใหม่ - There is a problem with one of the component oligos. - การวิเคราะห์ต้องการการเพิ่มประสิทธิภาพเพิ่มเติม - วิเคราะห์ผลลัพธ์ควบคู่ไปกับการควบคุมเทมเพลต/การวิเคราะห์เดียว ปัญหาการควบคุมแบบบวกจะขยายแต่จะไม่มี ผลการขยายจากตัวอย่างที่ทราบว่ามีชิ้นงานอยู่ (รูปที่ 11 4 A) สาเหตุที่เป็นไปได้ - ความเข้มข้นของตัวอย่างไม่เหมาะสม - การยับยั้งในตัวอย่างทดสอบ Diagnostic Test - ทดสอบการขยายด้วยตัวอย่างเจือจาง ขัดขวางปฏิกิริยาที่มี ระดับต่ำของเป้าหมายภายนอกและการทดสอบสำหรับการขยายของ เป้าหมายภายนอก (ดู [การคัดลอกข้อมูลย้อนกลับ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription); ทำตาม SPUD Protocol, [ภาคผนวก](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction)A) โซลูชัน - เพิ่ม BSA ได้ถึง 0.3% ใน PCR (รูปที่ 11 4 บี) หรือฟอก กรดนิวคลีอิกอินพุตให้บริสุทธิ์ ![เทมเพลตที่ไม่เจือจางไม่สามารถขยายได้ในขณะที่การเจือจางแสดงประสิทธิภาพการขยายที่ดีขึ้น](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/undiluted-template.jpg "เทมเพลตที่ไม่เจือจางไม่สามารถขยายได้ในขณะที่การเจือจางแสดงประสิทธิภาพการขยายที่ดีขึ้น") __รูปที่ 11 4 A)__เทมเพลตที่ไม่เจือจางไม่สามารถขยายได้ในขณะที่การเจือจางแสดงประสิทธิภาพการขยายที่ดีขึ้น b) การเพิ่ม BSA 0.3% ลงในการผสม qPCR จะสนับสนุนการขยายจากเทมเพลตที่ไม่มีการเจือจาง การตรวจสอบการวิเคราะห์ที่ล้มเหลวอย่างสมบูรณ์อาจเป็นเรื่องยากเนื่องจากมีข้อมูลเพียงเล็กน้อยในการแก้ไขปัญหา เนื่องจากความล้มเหลวในการวิเคราะห์หลายอย่างเป็นผลมาจากข้อผิดพลาดร้ายแรงบางอย่างการตรวจสอบครั้งแรกควรเป็นการตรวจสอบการตั้งค่าการทดสอบแล้วทำซ้ำ PCR หากล้มเหลวกระบวนการแก้ไขปัญหาจะขึ้นอยู่กับข้อมูลเกี่ยวกับแต่ละส่วนประกอบของการทดสอบ (__รูปที่ 11-5__) ![ขั้นตอนการแก้ไขปัญหาเบื้องต้นสำหรับ PCR](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/basic-troubleshooting-process.jpg "ขั้นตอนการแก้ไขปัญหาเบื้องต้นสำหรับ PCR") __รูปที่ 11 5__ขั้นตอนการแก้ไขปัญหาเบื้องต้นสำหรับ PCR เมื่อการทดสอบ qPCR ล้มเหลวอย่างสมบูรณ์ขั้นตอนแรกคือการตรวจสอบการออกแบบการวิเคราะห์ลำดับ oligo และข้อมูล QC จากผู้ผลิต oligo แม้ว่าการวิเคราะห์อาจล้มเหลวแต่สามารถใช้ข้อมูล QPCR แบบหลายส่วนประกอบ/ข้อมูลดิบเพื่อให้ข้อมูลเพิ่มเติมได้ __รูปที่ 11.6__ แสดงพลอตข้อมูลดิบสำหรับการวิเคราะห์สองครั้งที่มีโพรบที่ติดฉลากว่า 6 FAM ™หรือ HEX ™ (VIC ®) แม้ว่าการวิเคราะห์ทั้งสองจะแสดงการขยายสัญญาณแต่สัญญาณฐานสิบหกจะอยู่ที่ประมาณครึ่งหนึ่งของสัญญาณ FAM เนื่องจากนี่เป็นสีย้อมที่อ่อนแอกว่าโดยเนื้อแท้นี่จึงเป็นการสังเกตปกติ การวิเคราะห์เจล agarose (__รูปที่ 11 6 ข__) แสดงให้เห็นว่าปฏิกิริยาทั้งสองมีความเข้มข้นใกล้เคียงกันของผลิตภัณฑ์สนับสนุนการสังเกตว่า  ค่า qPCR cq มีความคล้ายคลึงกัน ![พลอตข้อมูลดิบของการวิเคราะห์แบบดูเพล็กซ์ที่มี FAM และโพรบ HEXlabeled](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/duplex-assay-containing.jpg "พลอตข้อมูลดิบของการวิเคราะห์แบบดูเพล็กซ์ที่มี FAM และโพรบ HEXlabeled") __รูปที่ 11 6 A)__พลอตข้อมูลดิบของการวิเคราะห์แบบดูเพล็กซ์ที่มี FAM และโพรบ HEXlabeled โพรบ FAM ให้การเรืองแสงที่สูงขึ้นอย่างเป็นธรรมชาติ b) เจล agarose ที่แสดงว่ามีการผลิตผลิตภัณฑ์ในปริมาณที่เท่ากันในแต่ละปฏิกิริยาและยืนยันการสังเกต qPCR cq การตรวจสอบข้อมูลดิบเป็นการตรวจสอบที่มีประโยชน์ในการตรวจสอบว่าโพรบได้รับการติดฉลากอย่างถูกต้องและถูกเพิ่มลงในปฏิกิริยา __รูปที่ 11__ 7 แสดงข้อมูลดิบสำหรับการขยายเป้าหมายสามเป้าหมายในการทดลองสามเท่า โพรบเฉพาะสำหรับแต่ละชิ้นงานจะมีป้ายกำกับ FAM, HEX และ TAMRA โพรบ HEX และ TAMRA แสดงพื้นหลังที่ต่ำและการขยายที่มีประสิทธิภาพแต่สัญญาณ FAM สูงอย่างต่อเนื่องตลอดการทดลองและไม่มีหลักฐานของการขยาย ซึ่งสอดคล้องกับความเข้มข้นของโพรบที่สูงเกินไปในปฏิกิริยาหรือความผิดพลาดกับโพรบโดยไม่มีการดับสัญญาณในครั้งแรก ในกรณีดังกล่าวควรตรวจสอบความเข้มข้นของโพรบและการออกแบบการวิเคราะห์เพื่อให้แน่ใจว่าโพรบมีฉลากและดับที่เข้ากันได้และหากจำเป็นให้ทดสอบโพรบใหม่ ![มีการใช้ปฏิกิริยาสามเท่าในการตรวจจับชิ้นงานสามชิ้นโดยใช้โพรบที่มีฉลาก FAM, HEX และ TAMRA](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/triplex-reaction.jpg "มีการใช้ปฏิกิริยาสามเท่าในการตรวจจับชิ้นงานสามชิ้นโดยใช้โพรบที่มีฉลาก FAM, HEX และ TAMRA") __รูปที่ 11 7__มีการใช้ปฏิกิริยาสามเท่าในการตรวจจับชิ้นงานสามชิ้นโดยใช้โพรบที่มีฉลาก FAM, HEX และ TAMRA โพรบ HEX และ TAMRA ให้การขยายจากเป้าหมายแต่โพรบ FAM ไม่มีการขยาย การตรวจสอบข้อมูลดิบแสดงให้เห็นว่าการเรืองแสงพื้นหลังสูงเป็นพิเศษและไม่มีการสังเกตความแตกต่างตลอดการเกิดปฏิกิริยา ซึ่งสอดคล้องกับความเข้มข้นของโพรบที่สูงเกินไปในปฏิกิริยาหรือโพรบที่มีข้อบกพร่องที่มีการดับไม่เพียงพอ หากการทดสอบเดิมที่ใช้ในการตรวจจับโพรบควรทำการทดสอบซ้ำโดยใช้ตัวทำปฏิกิริยา SYBR Green I รวมถึงการควบคุมเชิงบวกและลบ (แต่ไม่ใช่ตัวอย่างที่มีค่า) หรือสามารถตรวจสอบผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาที่ล้มเหลวได้บนเจล agarose ที่ย้อมสี ethidium bromide การนำแนวทาง SYBR Green I มาใช้ในการทำการทดสอบซ้ำเป็นวิธีที่ดีกว่าเพราะจะช่วยหลีกเลี่ยงความเสี่ยงของการปนเปื้อนและให้การทดสอบซ้ำเพื่อตรวจสอบความล้มเหลวเริ่มต้น หากการทดสอบ SYBR Green I ให้ข้อมูลอาจเป็นไปได้ว่าความล้มเหลวของโพรบเดิมเกิดจากข้อผิดพลาดทางเทคนิคหรือความผิดพลาดของโพรบ ในการแยกความแตกต่างระหว่างข้อผิดพลาดในการทดลองหรือความผิดพลาดกับโพรบให้ทำการทดสอบโพรบซ้ำอีกครั้งหากปฏิกิริยาล้มเหลวอีกครั้งให้เปลี่ยนโพรบ วิธีการนี้สามารถนำมาใช้เพื่อตรวจสอบปฏิกิริยาที่ทำให้เกิดข้อมูลที่ไม่ดีได้ ในตัวอย่างที่แสดงใน __รูปที่ 11.8__ปฏิกิริยาของโพรบนั้นน้อยที่สุดและเมื่อเทียบกับปฏิกิริยาที่รันโดยใช้ SYBR Green I จะเห็นได้ว่าสัญญาณโพรบไม่สะท้อนการทดลอง ในกรณีดังกล่าวการออกแบบการวิเคราะห์ควรได้รับการตรวจสอบและการทดสอบโพรบใหม่ ![ปฏิกิริยาที่เหมือนกันถูกเรียกใช้โดยมีโพรบ qPCR หรือสีย้อมสี SYBR Green I (ตามที่ระบุ)](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/identical-reactions.jpg "ปฏิกิริยาที่เหมือนกันถูกเรียกใช้โดยมีโพรบ qPCR หรือสีย้อมสี SYBR Green I (ตามที่ระบุ)") __รูปที่ 11 8__ปฏิกิริยาที่เหมือนกันถูกเรียกใช้โดยมีโพรบ qPCR หรือสีย้อม SYBR Green I (ตามที่ระบุ) ปฏิกิริยา SYBR Green I มีความไวมากขึ้นประมาณสิบเอ็ดรอบและให้ฟลูออเรสเซนซ์จุดปลายที่สูงขึ้นมาก นี่เป็นการบ่งชี้ถึงความผิดพลาดในการสอบสวนหรือปัญหาเกี่ยวกับการออกแบบโพรบ (ข้อมูลที่ได้รับจากศาสตราจารย์ Stephen Bustin, UK) ### กำลังตรวจสอบการติดฉลากโพรบ ข้อมูลดิบหรือพล็อตหลายองค์ประกอบเป็นเครื่องมือวินิจฉัยที่มีประโยชน์ในการตรวจสอบว่ามีความเข้มข้นของโพรบที่เหมาะสมรวมอยู่ในปฏิกิริยาหรือไม่และโพรบได้รับการติดฉลากและดับอย่างเพียงพอหรือไม่ __รูปที่ 11__ 9 แสดงพล็อตหลายองค์ประกอบสำหรับปฏิกิริยาที่มีสามโพรบ สองครั้งแรกสร้างแปลงขยายและเรืองแสงพื้นหลังจะเห็นได้ชัด ไม่มีข้อมูลจากโพรบตัวที่สามและการตรวจสอบข้อมูลดิบแสดงให้เห็นว่าการเรืองแสงพื้นหลังเทียบเท่ากับการควบคุมน้ำเปล่าซึ่งไม่มีโพรบ ดังนั้นข้อมูลนี้จึงเป็นผลมาจากการไม่มีฟลูออเรสเซนซ์ในปฏิกิริยา ซึ่งอาจเกิดจากข้อผิดพลาดในระหว่างการตั้งค่าที่ไม่ได้ให้โพรบมาหรือโพรบไม่ได้ติดฉลากไว้ ![ตรวจพบยีนสามตัวในตัวอย่างเทมเพลตเดียวกัน](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/genes-were-detected.jpg "ตรวจพบยีนสามตัวในตัวอย่างเทมเพลตเดียวกัน") __รูปที่ 11 9__ตรวจพบยีนสามตัวในตัวอย่างเทมเพลตเดียวกัน ปฏิกิริยาสองครั้งส่งผลให้เกิดการขยายสัญญาณ (1 และ 2 อย่างไรก็ตามครั้งที่ 3 เป็นลบ การตรวจสอบมุมมองหลายองค์ประกอบจะแสดงให้เห็นว่าการเรืองแสงพื้นหลังสำหรับปฏิกิริยาที่ 3 นั้นเทียบเท่ากับการควบคุมน้ำที่ระบุว่าไม่มีสัญญาณ การตรวจสอบการติดฉลากโพรบเพิ่มเติมสามารถทำได้โดยใช้การย่อย DNase I ซึ่งจะต้องดำเนินการด้วยความระมัดระวังอย่างมากเพื่อให้แน่ใจว่าโพรบและหุ้นไพรเมอร์จะไม่ปนเปื้อนกับเอนไซม์ซึ่งจะนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ร้ายแรง อะลิควอทของโพรบที่ล้มเหลว (__รูปที่ 11__A) เทียบเท่ากับที่รวมอยู่ในปฏิกิริยาเช่น 10 300 นิวตันเมตรจะถูกบ่มด้วยและไม่มี DNase I ซึ่งสามารถดำเนินการได้แบบเรียลไทม์ (__รูปที่ 11 10 บี__) เพื่อให้วัดปริมาณฟลูออเรสเซนต์ได้ตามเวลาหรืออีกทางเลือกหนึ่งคือจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุด (หลังจาก 10 นาที) จะให้ข้อมูลที่เพียงพอ เมื่อทำการทดสอบนี้สิ่งสำคัญคือต้องเปรียบเทียบข้อมูลกับโพรบที่ทำงานได้ดีและมีฉลากเรืองแสงและดับเพลิงเดียวกัน (__รูปที่ 11 10 บี__)  ![ตรวจพบสองเทมเพลตโดยใช้โพรบที่แตกต่างกัน](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/templates-were-detected.jpg "ตรวจพบสองเทมเพลตโดยใช้โพรบที่แตกต่างกัน") __รูปที่ 11 10 A)__ตรวจพบสองเทมเพลตโดยใช้โพรบที่แตกต่างกันทั้ง FAM ที่ติดฉลากไว้ ในขณะที่การตรวจจับโดยใช้โพรบเพียงตัวเดียวส่งผลให้เกิดสัญญาณฟลูออเรสเซนต์สูงส่วนที่สองจะอ่อนแอลงมาก ข) ตัวควบคุมและโพรบทดสอบ 300 นิวตันเมตร) ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37°C ในเครื่องมือแบบเรียลไทม์ในบัฟเฟอร์ DNase I ในการมีหรือไม่มีเอนไซม์ DNase I การปล่อยฟลูออเรสเซนต์จากโพรบ 1 ประมาณสองเท่าจากโพรบ 2 แสดงให้เห็นว่าการติดฉลากโพรบ 2 ไม่เพียงพอ ปัญหาการเรืองแสงต่ำหรือขาดหายไปทั้งในตัวอย่างทดสอบและในการควบคุมเชิงบวก ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกต้องจะปรากฏบนเจลและการออกแบบจะได้รับการตรวจสอบ การตรวจจับโดยใช้สีย้อมสีเขียว SYBRProbe Detection __สาเหตุที่เป็นไปได้__ไม่ดี SYBR สีเขียวฉันผูกสีย้อม - เรืองแสงพื้นหลังสูง/ต่ำ - ความเข้มข้นของโพรบไม่ถูกต้อง - โพรบมีประสิทธิภาพลดลง - การติดฉลากโพรบไม่ดี - การเก็บข้อมูลฟลูออเรสเซนต์ไม่ถูกต้อง - เปรียบเทียบฟลูออเรสเซนซ์ของ SYBR Green I Binding Dye Mix ±1 μg DNA - ฟลูออเรสเซนซ์ควรสูง กว่าอย่างน้อย 10,000 หน่วยโดยมีดีเอ็นเอเพิ่มมากกว่าไม่มี - ตรวจสอบการเรืองแสงดิบ (พล็อตหลายองค์ประกอบ) - ฟลูออเรสเซนซ์ควรเพิ่มขึ้นอย่างน้อย 10,000 ยูนิต ระหว่างรอบ 1 และ 40 - ย่อย 5 fmoles ของโพรบด้วย DNase I. เก็บ ผลผลิตฟลูออเรสเซนต์โดยใช้ความยาวคลื่นทั้งหมด - ฟลูออเรสเซนซ์ควรมีอย่างน้อย 10,000 หน่วยมากก ว่าไม่มีการย่อย DNase __โซลูชัน__ซื้อ SYBR Green I Binding Dye ใหม่หรือ qPCR ผสมใหม่กับ SYBR Green Binding Dye - ใช้ความเข้มข้นที่ถูกต้อง - Purchase a new probe. Purchase a new probe. ### __แพล๊อตขยาย__ โครงสร้างของแผนการขยายและความสามารถในการทำซ้ำทางเทคนิคให้ข้อมูลที่มากมายเกี่ยวกับคุณภาพของการทดสอบ qPCR และอาจให้ข้อบ่งชี้เตือนครั้งแรกว่าทั้งหมดไม่ได้เป็นอย่างที่ควรจะเป็น แปลงขยายใน __รูปที่ 11.11__ Aare ไม่ปกติมีเสียงดังมากและยากที่จะตีความอย่างถูกต้อง การตรวจสอบเพิ่มเติมของค่าการเรืองแสง DR แสดงให้เห็นว่าอัตราผลตอบแทนของฟลูออเรสเซนต์ที่จุดปลายมีเพียง 400 หน่วยซึ่งบ่งชี้ว่าปฏิกิริยาไม่เพียงพอแต่การขยายได้รับการสร้างขึ้นโดยซอฟต์แวร์เครื่องมือและปรับขนาดอัตโนมัติ ในทำนองเดียวกันข้อมูลใน __รูปที่ 11.11__ Bhave foxtail เด่นชัด (เส้นโค้งลดลง) ที่จุดเริ่มต้นของโปรไฟล์ก่อนที่จะเพิ่มขึ้นอีกครั้งหลังจากส่วนข้อมูลขั้นต้น การปรากฏตัวของหางปลามีความสอดคล้องกันในปฏิกิริยาทั้งสองแต่ปฏิกิริยาหนึ่งมีจุดปลายที่ต่ำกว่ามาก (__รูปที่ 11 11 องศาเซลเซียส__) ส่งผลให้หางปลาที่ขยายตัวและมีความสัมพันธ์กัน __รูปที่ 11 11 ก__) แปลงขยายที่มีเสียงดังเนื่องจากการปรับขนาดอัตโนมัติโดยซอฟต์แวร์เครื่องมือของข้อมูลที่ไม่ดีที่มีการเรืองแสงต่ำ ข) ปฏิกิริยาที่ให้ผลลัพธ์จุดปลายต่ำ DR มี foxtail เริ่มต้นที่เด่นชัด c) FOXTAIL จะถูกมองว่าเป็นผลปกติเมื่อเป็นสัดส่วนกับการวิเคราะห์ที่มีคุณภาพสูง ในทำนองเดียวกันแผนการขยายใน __รูปที่ 11.12__ Aare ผิดปกติอย่างชัดเจนและไม่สามารถใช้งานได้ตามที่แสดง พล็อตการขยายที่ลดลงต่ำกว่า__11 DR (รูปที่ 12__A) เป็นตัวบ่งชี้คลาสสิกของการตั้งค่าพื้นฐานที่ไม่เหมาะสม การตรวจสอบข้อมูลดิบสำหรับปฏิกิริยานี้ (__รูปที่ 11 12 ข__) แสดงให้เห็นว่าแผนการขยายจริงมีโปรไฟล์ปกติยืนยันว่าข้อมูลที่วิเคราะห์เป็นผลมาจากปัญหาซอฟต์แวร์เครื่องมือ ข้อมูลขั้นต้นที่เหมาะสมสามารถนำไปหักจากข้อมูลดิบและนำไปใช้ในซอฟต์แวร์ได้ ในกรณีนี้รอบที่ 6__12 ถึง 16 แสดงระยะเชิงเส้นเริ่มต้นระยะพื้นฐานของปฏิกิริยาและเมื่อนำไปใช้จะส่งผลให้เกิดการขยายตัวตามปกติ (รูปที่ 11 องศาเซลเซียส__) ![แผนการขยายสัญญาณผิดปกติอย่างเห็นได้ชัดโดยมีส่วนของการจุ่มโปรไฟล์ใต้เส้นฐาน](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/amplification-plots-were-clearly.jpg "แผนการขยายสัญญาณผิดปกติอย่างเห็นได้ชัดโดยมีส่วนของการจุ่มโปรไฟล์ใต้เส้นฐาน") __รูปที่ 11 12 A)__แผนการขยายสัญญาณผิดปกติอย่างเห็นได้ชัดโดยมีส่วนของการจุ่มโปรไฟล์ใต้เส้นฐาน b) การตรวจสอบข้อมูลดิบแสดงให้เห็นว่าข้อมูลปฏิกิริยาเป็นไปตามที่คาดไว้ c) การตั้งค่าเบสไลน์ของเครื่องมือตามรอบที่เหมาะสมจะคืนค่าโปรไฟล์ปกติให้กับข้อมูลของพล็อตการขยายที่วิเคราะห์ โปรไฟล์พล็อตการขยายยังสามารถตีความเพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับคุณภาพของการวิเคราะห์และการเพิ่มประสิทธิภาพ __รูปที่ 11.1__ 3 แสดงความพยายามในการขยายแม่แบบการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าโดยมีความเข้มข้นแต่ละค่าที่รันใน qPCR ที่ซ้ำกัน ความสามารถในการทำซ้ำระหว่างการทำซ้ำไม่ดีความแตกต่างของรอบ (Δ Cq) ระหว่างข้อมูลไม่คงที่และไม่ใช่ 3.323 รอบตามที่คาดไว้สำหรับการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่า การตรวจสอบแปลงขยายโดยคำนึงถึงเส้นโค้งมาตรฐานนี้แสดงให้เห็นว่าการวิเคราะห์ต่ำกว่ามาตรฐานและไม่สามารถใช้ในการวิเคราะห์ได้ เหตุผลจะต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติมแต่อาจเป็นผลมาจากการออกแบบการวิเคราะห์ที่ไม่ดี (ดู [PCR/qPCR/dPCR Assay Design)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design)เงื่อนไขการวิเคราะห์ย่อยที่เหมาะสม (ดู [การเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์และการตรวจสอบ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation)) หรือการวางท่อที่ไม่ดี (การทดสอบซ้ำ) ![ตัวอย่าง cDNA ถูกเจือจางด้วยการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าและแม่แบบเฉพาะที่ตรวจพบโดยใช้ qPCR ที่ซ้ำกันสำหรับการเจือจางแต่ละครั้ง](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/cdna-sample.jpg "ตัวอย่าง cDNA ถูกเจือจางด้วยการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าและแม่แบบเฉพาะที่ตรวจพบโดยใช้ qPCR ที่ซ้ำกันสำหรับการเจือจางแต่ละครั้ง") __รูปที่ 11 13__ตัวอย่าง cDNA ถูกเจือจางด้วยการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่าและแม่แบบเฉพาะที่ตรวจพบโดยใช้ qPCR ที่ซ้ำกันสำหรับการเจือจางแต่ละครั้ง การทำซ้ำไม่ดีแสดงถึงปัญหาเกี่ยวกับการวางท่อหรือการปรับการวิเคราะห์ให้เหมาะสม ปัญหาระเบิดฟลูออเรสเซนซ์พุ่งขึ้นอย่างกะทันหัน (รูปที่ 11 14 สาเหตุที่เป็นไปได้สีย้อมอ้างอิงหรือข้อผิดพลาดของเครื่องมือไม่ดี (เช่นเปิดประตูระหว่างการวิ่ง) Diagnostic Test - ปิดใช้งานการปรับสภาพสีย้อมอ้างอิงหรือดูผลลัพธ์ ΔR (การเรืองแสงเพิ่มขึ้นจากรอบ 1 ถึง 40 แทน ΔRn (การ เรืองแสงสัมพัทธ์เพิ่มขึ้นหลังจากการปรับให้เป็นปกติกับความเข้มของสีย้อมของผู้รายงาน) - สำหรับเครื่องมือที่สามารถทนต่อการวิเคราะห์โดยไม่มีสีย้อมอ้างอิง พล็อตควรได้รับการแก้ไขหากฟลูออเรสเซนซ์ไม่ได้รับการ ปรับให้เป็นสีย้อมอ้างอิงที่ไม่ได้ใช้งาน - การเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วในข้อมูลดิบหรือ ΔR ระบุข้อผิดพลาดของเครื่องมือ โซลูชัน - เรียบเนียนและ มีการขยาย: ซื้อสีย้อม ΔR รับอ้างอิงใหม่ ปกป้องสีย้อมจากแสงระหว่างการเก็บรักษาเสมอ - เข็มยังคงอยู่ใน ΔR: วิ่งซ้ำถ้าปัญหายังคงแสวงหา ความช่วยเหลือทางวิศวกรรมสำหรับเครื่องมือ ![ในระหว่าง qPCR มาตรฐานข้อมูลจะพุ่งขึ้นอย่างกะทันหันด้วยโปรไฟล์ที่ไม่ใช่โปรไฟล์ทั่วไป](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/during-a-standard-qpcr.jpg "ในระหว่าง qPCR มาตรฐานข้อมูลจะพุ่งขึ้นอย่างกะทันหันด้วยโปรไฟล์ที่ไม่ใช่โปรไฟล์ทั่วไป") __รูปที่ 11 14__ในระหว่าง qPCR มาตรฐานข้อมูลจะพุ่งขึ้นอย่างกะทันหันด้วยโปรไฟล์ที่ไม่ใช่โปรไฟล์ทั่วไป ปัญหาการสลายตัวหรือการเรืองแสงที่ติดยาเสพติด (รูปที่ 11 15 สาเหตุที่เป็นไปได้เมื่อมีการสะสมผลิตภัณฑ์ PCR เส้นใยอภินันทนาการจะแข่งขันกับ ไพรเมอร์และ/หรือโพรบสำหรับการหลอมเข้ากับเทมเพลต Diagnostic Testดูรูปที่ 11 15 โซลูชันไม่ต้องสนใจหาก Cq ไม่ได้รับผลกระทบ ![ตัวอย่าง cDNA ถูกเจือจางด้วยการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่า](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/the-hooked-amplification.jpg "ตัวอย่าง cDNA ถูกเจือจางด้วยการเจือจางแบบอนุกรม 10 เท่า") __รูปที่ 11 15__สำหรับการสลายตัวหรือการเรืองแสงที่ติดยาเสพติดสาเหตุที่เป็นไปได้อาจเกิดจากเส้นใยเสริมที่แข่งขันกับไพรเมอร์และ/หรือโพรบสำหรับการหลอมแม่แบบ ไม่ต้องสนใจตราบใดที่ CT ไม่ได้รับผลกระทบ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การแยกตัว/ละลายเส้นโค้ง การวิเคราะห์เส้นโค้งสลายตัวหรือละลายจะทำงานหลังจาก qPCR และเป็นเครื่องมือวิเคราะห์ที่ใช้ร่วมกับสีย้อมติดดีเอ็นเอ (เช่น SYBR Green I) หรือโพรบที่ไม่เสื่อมสภาพเช่น Molecular Beacons หรือ Scorpions® Probes เพื่อตรวจสอบว่ามีการขยายผลิตภัณฑ์เดียว หลังจากการขยาย PCR จะมีการบ่มไอคอนแอมพลิฟายเออร์ที่เกิดขึ้นที่อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นและการเปลี่ยนแปลงของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เมื่อการเปลี่ยนดีเอ็นเอระหว่างสถานะดับเบิลควั่นและสถานะเดี่ยวควั่น เมื่อปฏิกิริยามีแอมพลิฟายเออร์เพียงตัวเดียวจะละลายอย่างสม่ำเสมอและพล็อตของ DF/DT (อัตราการเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนซ์เทียบกับอุณหภูมิ) จะแสดงจุดสูงสุดหนึ่งจุด การตรวจสอบเส้นโค้งละลายจะมีประสิทธิภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อรวมกับข้อมูลจากการควบคุม __รูปที่ 11.16__ แสดงโปรไฟล์โพสต์ qPCR Melt สำหรับชุดของตัวอย่างการทดสอบทดลองการควบคุมเชิงบวกและการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลต โปรไฟล์การละลายสำหรับตัวอย่างทดสอบจะเหมือนกับการควบคุมเชิงบวกและแต่ละตัวอย่างจะแสดงจุดสูงสุดเดียวสำหรับ DF/DT โปรไฟล์ละลายสำหรับการควบคุมแม่แบบไม่มีมีโปรไฟล์ที่กว้างขึ้นและ TMที่ต่ำกว่า การสังเกตเหล่านี้สอดคล้องกับการปรากฏตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์ที่ปรากฏในการควบคุมเชิงลบ ซึ่งได้รับการยืนยันโดยใช้เจล agarose ย้อมสี ethidium bromide (รูปที่ 11 16 ข.) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์จะปรากฏให้เห็นเมื่อมีเทมเพลตที่ความเข้มข้นต่ำ ซึ่งจะทำให้เกิดการประมาณการของชิ้นงานมากเกินไปเมื่อตรวจจับในตัวอย่างที่มีความเข้มข้นของชิ้นงานต่ำ ดังนั้นการวิเคราะห์ควรได้รับการปรับให้เหมาะสมหรือออกแบบใหม่ ในทางกลับกัน __รูปที่ 11.16__ แสดงให้เห็นว่าโปรไฟล์ละลายสำหรับผลิตภัณฑ์ในตัวควบคุมเทมเพลต NO จะเหมือนกับโปรไฟล์ละลายสำหรับการควบคุมเชิงบวกและตัวอย่างการทดสอบ นี่เป็นการบ่งชี้ที่ชัดเจนถึงการปนเปื้อนของตัวควบคุมแบบไม่มีแม่แบบที่มีแม่แบบในระหว่างการตั้งค่าการทดสอบ ตัวอย่างสุดท้ายแสดงให้เห็นถึงการรับรู้การขยายของเป้าหมายจาก gDNA ที่มีอยู่ในตัวอย่าง cDNA (__รูปที่ 11 16 มิติ__) แอมพลิฟายเออร์ที่ได้จาก gDNA มีความยาว  มากกว่าดังนั้นจึงมี TM ที่สูงกว่าจาก cDNA ![การควบคุมเชิงบวกปฏิกิริยาทดสอบและ NTC ได้รับการขยาย](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/positive-control.jpg "การควบคุมเชิงบวกปฏิกิริยาทดสอบและ NTC ได้รับการขยาย") __รูปที่ 11 16 ก__การควบคุมเชิงบวกปฏิกิริยาการทดสอบและ NTC ถูกขยายออกไปแล้วจึงได้รับการวิเคราะห์การละลายหลังการใช้ PCR มีผลิตภัณฑ์ที่เห็นได้ชัดใน NTC ที่ละลายในอุณหภูมิที่ต่ำกว่าและมีจุดสูงสุดที่ละลายกว้างขึ้นสอดคล้องกับการก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์ ![ไพรเมอร์ไดเมอร์จะเห็นได้ชัดในความละเอียดของเจล](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/primer-dimers.jpg "ไพรเมอร์ไดเมอร์จะเห็นได้ชัดในความละเอียดของเจล") __รูปที่ 11 16 บาท__ไพรเมอร์ไดเมอร์จะเห็นได้ชัดบนความละเอียดเจลของตัวอย่างเหล่านี้ (พร้อมกับตัวอย่างอื่นๆ) โดยมีการก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์เป็นสัดส่วนผกผันกับความเข้มข้นของเทมเพลตอินพุต ![ตัวอย่างของการใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งละลายเพื่อระบุการปนเปื้อนของปฏิกิริยาใน NTC](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/melt-curve-analysis-identify-reaction.jpg "ตัวอย่างของการใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งละลายเพื่อระบุการปนเปื้อนของปฏิกิริยาใน NTC") __รูปที่ 11 16 องศาเซลเซียส__ตัวอย่างของการใช้การวิเคราะห์เส้นโค้งละลายเพื่อระบุการปนเปื้อนของปฏิกิริยาใน NTC ![ระบุแอมพลิฟายเออร์ขนาดใหญ่ที่เป็นผลมาจาก PCR ของ gDNA](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/identifying-a-larger-amplicon.jpg "ระบุแอมพลิฟายเออร์ขนาดใหญ่ที่เป็นผลมาจาก PCR ของ gDNA") __รูปที่ 11 16 มิติ__ระบุแอมพลิฟายเออร์ขนาดใหญ่ที่เป็นผลมาจาก PCR ของ gDNA ปัญหา TM สูงสุดหลายจุดในข้อมูลโปรไฟล์ละลาย  ผลิตภัณฑ์เดี่ยวบนเจล (รูปที่ 11 17ผลิตภัณฑ์หลายรายการบนเจล สาเหตุที่เป็นไปได้แปลเป็นภาษาท้องถิ่นที่หรือภูมิภาคที่อุดมไปด้วย GC หรือ ทำซ้ำสั้นๆในผลิตภัณฑ์ PCR ทำให้การหลอม แอมพลิฟายเออร์ที่ไม่สมบูรณ์ด้วย โปรไฟล์การละลายที่แตกต่างกันอย่างเห็นได้ชัด ไพรเมอร์ไม่เฉพาะเจาะจงและกำลัง ผลิตผลิตภัณฑ์หลายรายการ - ความเข้มข้น MG 2 + ใน ปฏิกิริยาสูงเกินไปหรือ อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป Diagnostic Testตรวจสอบลำดับของแอมพลิฟายเออร์สำหรับ ภูมิภาคที่มีแอทหรือ GC หรือภูมิภาคที่มีแอมพลิจูดซ้ำลำดับสีรองพื้นระเบิดเทียบกับ ลำดับของสิ่งมีชีวิตแหล่งกำเนิดเพื่อ ตรวจสอบเป้าหมายเดียว โซลูชันนี่ไม่ใช่ปัญหาหาก การวิเคราะห์เจลแสดงให้เห็นว่าผลิตภัณฑ์ทั้งหมด มีความเฉพาะเจาะจง ใช้ ไพรเมอร์ต่อไป - ไตเตรท mg2 + เพื่อกำหนด ความเข้มข้นที่เหมาะสม - ทำการ ไล่ระดับอุณหภูมิการหลอมเพื่อเลือก อุณหภูมิการหลอมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ PCR - ออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำกัน ![โปรไฟล์ละลายและ B) การวิเคราะห์เจล agarose ของปฏิกิริยา SYBR GREEN I](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/melt-profile.jpg "โปรไฟล์ละลายและ B) การวิเคราะห์เจล agarose ของปฏิกิริยา SYBR GREEN I") __รูปที่ 11 17 A)__โปรไฟล์ละลายและ B) การวิเคราะห์เจล agarose ของปฏิกิริยา SYBR GREEN I แม้ว่าโปรไฟล์การละลายจะแนะนำผลิตภัณฑ์ของ TM ที่แตกต่างกันแต่ภาพเจลแสดงว่ามีแอมพลิฟายเออร์เพียงตัวเดียว ซึ่งเป็นการบ่งชี้ลำดับแอมพลิฟายเออร์ที่มีบริเวณที่อุดมไปด้วย AT หรือ GC หรือองค์ประกอบที่ซ้ำกันทำให้เกิดการละลายที่ผิดปกติ ### การเจือจางแบบอนุกรมของแม่แบบ/เส้นโค้งมาตรฐาน ไม่ว่าการออกแบบทดลองจะมีข้อกำหนดสำหรับเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับการวัดปริมาณในท้ายที่สุดหรือไม่การตรวจจับการเจือจางแบบอนุกรมของแม่แบบที่เหมาะสมเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการตรวจสอบและแก้ไขปัญหาการวิเคราะห์ การตรวจจับการเจือจางแบบอนุกรมช่วยให้สามารถกำหนดช่วงไดนามิกเชิงเส้นในการทดสอบได้ __รูปที่ 11.18__ แสดงเส้นโค้งมาตรฐานที่มีจุดข้อมูลความเข้มข้นต่ำที่ไม่พอดีกับเส้นขอบแบบเส้นตรง เหตุผลที่พบบ่อยที่สุดสำหรับรูปแบบข้อมูลนี้คือไพรเมอร์ไดเมอร์เกิดขึ้นในตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ (ดังแสดงใน __รูปที่ 11 18 บี__) นี่คือเส้นโค้งมาตรฐานที่สร้างขึ้นจากข้อมูลที่แสดงใน __รูปที่ 11.2__ __รูปที่ 11.18__ แสดงเส้นโค้งมาตรฐานที่มีตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูงหลุดออกมาจากช่วงเส้นตรง เหตุผลที่พบบ่อยที่สุดสำหรับเรื่องนี้คือการยับยั้งการตอบสนองหรือการตั้งค่าพื้นฐานไม่เหมาะสม ![จุดข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับความเข้มข้นของชิ้นงานที่ต่ำกว่าจะไม่อยู่บนเส้นโค้งมาตรฐาน ข) นี่เป็นเรื่องปกติของปฏิกิริยาที่ส่งผลให้ไพรเมอร์ลดลงตามที่แสดงไว้ ในกรณีนี้จะไม่มีการสังเกตพบการเพิ่มขึ้นของ Cq สำหรับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/the-data-points.jpg "จุดข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับความเข้มข้นของชิ้นงานที่ต่ำกว่าจะไม่อยู่บนเส้นโค้งมาตรฐาน ข) นี่เป็นเรื่องปกติของปฏิกิริยาที่ส่งผลให้ไพรเมอร์ลดลงตามที่แสดงไว้ ในกรณีนี้จะไม่มีการสังเกตพบการเพิ่มขึ้นของ Cq สำหรับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ") รูปที่ 11 18 a) จุดข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับความเข้มข้นต่ำของเป้าหมายไม่ได้อยู่บนเส้นโค้งมาตรฐาน ข) นี่เป็นเรื่องปกติของปฏิกิริยาที่ส่งผลให้ไพรเมอร์ลดลงตามที่แสดงไว้ ในกรณีนี้จะไม่มีการสังเกตพบการเพิ่มขึ้นของ Cq สำหรับตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่ำ ![ตัวอย่างที่มีเทมเพลตความเข้มข้นสูงจะไม่อยู่บนเส้นโค้งมาตรฐาน](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/log-of-dna-dilution.jpg "ตัวอย่างที่มีเทมเพลตความเข้มข้นสูงจะไม่อยู่บนเส้นโค้งมาตรฐาน") __รูปที่ 11 18 องศาเซลเซียส__ตัวอย่างที่มีเทมเพลตความเข้มข้นสูงจะไม่อยู่บนเส้นโค้งมาตรฐาน นี่เป็นปฏิกิริยาทั่วไปที่ถูกยับยั้งโดยความเข้มข้นของแม่แบบหรือเนื่องจากการตั้งค่าพื้นฐานที่ไม่ถูกต้อง เส้นโค้งมาตรฐานยังใช้ในการวัดประสิทธิภาพของปฏิกิริยาในช่วงไดนามิกของการเจือจาง ต้องใช้ความระมัดระวังเพื่อให้แน่ใจว่าทุกจุดที่ใช้ในการคำนวณประสิทธิภาพอยู่ในสายการผลิต ปฏิกิริยาควรมีประสิทธิภาพใกล้เคียงกับ 100 เปอร์เซ็นต์มากที่สุดและผู้ที่มีประสิทธิภาพสูง (> 110%) หรือต่ำ (<85%) จะได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม ![กรดนิวคลีอิกเทมเพลตถูกเจือจางผ่านชุด 10 เท่า](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/template-nucleic-acid.jpg "กรดนิวคลีอิกเทมเพลตถูกเจือจางผ่านชุด 10 เท่า") __รูปที่ 11 19 ก__กรดนิวคลีอิกเทมเพลตถูกเจือจางผ่านชุด 10 เท่า แปลงขยายมีการไล่ระดับสีตื้นผิดปกติและ ΔCq เป็น 4 รอบมากกว่าที่คาดไว้ 3.3 ![การไล่ระดับสีของเส้นโค้งมาตรฐานของ Cq เทียบกับปริมาณจะใช้ในการคำนวณประสิทธิภาพของปฏิกิริยา](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/gradient-of-a-standard.jpg "การไล่ระดับสีของเส้นโค้งมาตรฐานของ Cq เทียบกับปริมาณจะใช้ในการคำนวณประสิทธิภาพของปฏิกิริยา") __รูปที่ 11 19 บาท__การไล่ระดับสีของเส้นโค้งมาตรฐานของ Cq เทียบกับปริมาณจะใช้ในการคำนวณประสิทธิภาพของปฏิกิริยา ปัญหาประสิทธิภาพ PCR มากกว่า 120% (รูปที่ 11 20 สาเหตุที่เป็นไปได้ - สีรองพื้นมากเกินไป - การวางท่อไม่ถูกต้อง - การยับยั้ง Diagnostic Test - ประเมินพล็อตการแยกตัวออกจากกันตามที่แสดงใน รูปที่ 11.20 - ทดสอบการปรับเทียบปิเปตต์ - ตรวจสอบ ΔCq ระหว่างการเจือจาง สารยับยั้งในตัวอย่าง จะถูกระบุหากมีการลดลงให้ยืนยันโดยใช้การวิเคราะห์ SPUD (ดู [ภาคผนวก](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction)A) โซลูชัน - ลองใช้ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่ต่ำกว่า - ด้วย RT-PCR ให้ลองใช้ RT Enzyme น้อยลงทำ 2 ขั้นตอนและ/หรือใช้ อุณหภูมิบ่มที่สูงขึ้นสำหรับขั้นตอน RT - ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ปรับเทียบปิเปตต์แล้ว หากปิเปตต์ได้รับการปรับเทียบ อย่างเหมาะสมให้ใช้ปิเปตต์อย่างถูกต้อง - Purify sample. ใช้การเจือจางที่สูงขึ้นในการวิเคราะห์ ![กรดนิวคลีอิกเทมเพลตถูกเจือจางผ่านชุด 10 เท่า](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/template-nucleic-acid-was-diluted.jpg "กรดนิวคลีอิกเทมเพลตถูกเจือจางผ่านชุด 10 เท่า") __รูปที่ 11 20 ก__กรดนิวคลีอิกเทมเพลตถูกเจือจางผ่านชุด 10 เท่า ΔCq ระหว่างแปลงขยายคือ 1.5 รอบแทนที่จะเป็น 3.3 ![เกรเดียนต์ของเส้นโค้งมาตรฐาน](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/the-gradient-of-a-standard.jpg "เกรเดียนต์ของเส้นโค้งมาตรฐาน") __รูปที่ 11 20 บาท__การไล่ระดับสีของเส้นโค้งมาตรฐานของ Cq เทียบกับปริมาณจะใช้ในการคำนวณประสิทธิภาพของปฏิกิริยาที่ใกล้เคียงกับ 140% ![การตรวจสอบโปรไฟล์โค้งละลายจะแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างของความเข้มข้นต่ำกว่า](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/an-examination-of-the-melt.jpg "การตรวจสอบโปรไฟล์โค้งละลายจะแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างของความเข้มข้นต่ำกว่า") __รูปที่ 11 20 องศาเซลเซียส__การตรวจสอบโปรไฟล์โค้งละลายจะแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างของความเข้มข้นที่ต่ำกว่า (ร่องรอยสีเหลืองและสีน้ำเงิน) ยังมีสัญญาณจากไพรเมอร์ที่ขยาย (สูงสุดที่ TM ที่ต่ำกว่า) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การแก้ไขปัญหากรณีศึกษา RT-PCR ### การวิเคราะห์โพรบที่ล้มเหลว การวิเคราะห์โดยใช้โพรบได้รับการออกแบบมาเพื่อตรวจจับ EIFB1 ในตัวอย่าง cDNA ของมนุษย์แต่ไม่มีการขยาย ปฏิกิริยาเริ่มต้นถูกรันบนเครื่องมือ ABI StepOne โดยใช้น้ำยาที่เข้ากันได้ มีความพยายามที่จะเพิ่มประสิทธิภาพของไพรเมอร์โดยใช้ช่วงของความเข้มข้นจาก 200 นิวตันเมตรถึง 900 นิวตันเมตร (__รูปที่ 11.21__) แต่ไม่มีการปรับปรุง การออกแบบการวิเคราะห์ได้รับการตรวจสอบและพบว่าเหมาะสมกับเป้าหมายและในซิลิโคคาดว่านี่เป็นการวิเคราะห์ที่มีคุณภาพสูง ไพรเมอร์ใหม่ถูกสังเคราะห์และทำงานควบคู่ไปกับอะลิควอทของการสังเคราะห์เดิมโดยใช้ตัวดำเนินการที่แตกต่างกัน SYBR Green I reagents (ดังนั้นตัวทำปฏิกิริยาที่แตกต่างกัน) และเครื่องมือ (Eppendorf Realplex) (__รูปที่ 11.22__) ในขณะที่ใช้วิธีการนี้เราตระหนักดีว่าวัตถุประสงค์หลักคือการแก้ปัญหาในขณะที่วัตถุประสงค์รองคือการอธิบายความล้มเหลว ปฏิกิริยานี้ทำให้เกิดการขยายตัวเทียบเท่าจากทั้งสองกลุ่มของไพรเมอร์ ในขั้นตอนนี้ปรากฏว่าปัญหาปฏิกิริยาวางอยู่กับโพรบและดังนั้นโพรบใหม่จึงถูกสังเคราะห์และทั้งสองชุดถูกเปรียบเทียบโดยผู้ประกอบการรายที่สองบนเครื่องมือ Realplex โดยใช้ รีเอเจนต์ LuminoCt ® (รีเอเจนต์ที่แตกต่างกันกับผู้ที่พยายามครั้งแรก) (__รูปที่ 11.23__) โพรบทั้งสองให้ข้อมูลการขยายตัวโพรบใหม่ปรากฏขึ้นดีกว่าโพรบเดิมเล็กน้อยแม้ว่าจะเป็นที่น่าสังเกตว่าโพรบเดิมถูกโพสต์ระหว่างห้องปฏิบัติการทดสอบและดังนั้นจึงอยู่ที่อุณหภูมิห้องในการแก้ปัญหาเป็นเวลาหลายวัน ในขั้นตอนนี้เป็นที่ชัดเจนว่าทั้งการวิเคราะห์เดิมและการทดแทนทำงานเมื่อดำเนินการโดยผู้ประกอบการรายที่สองใน รีเอเจนต์ LuminoCt ® บนอุปกรณ์ Realplex ดังนั้นเหตุผลที่เหลือของความล้มเหลวเดิมจึงถือว่าเป็น: - __ผู้ประกอบการ:__ การทดลองซ้ำหลายครั้งโดยนักวิทยาศาสตร์ที่มีประสบการณ์และดังนั้นจึงถือว่าเป็นคำอธิบายที่ไม่น่าเป็นไปได้ - __เครื่องมือ:__ อาจมีปัญหาบางอย่างเนื่องจากการวิเคราะห์อื่นๆล้มเหลว - __น้ำยา:__ คำอธิบายที่ง่ายที่สุดในการทดสอบ ตัว ทำปฏิกิริยา LuminoCt ® ถูกเปรียบเทียบกับตัวทำปฏิกิริยาที่มีอยู่โดยใช้ทั้งชุด oligo บนเครื่องมือ ABI StepOne โดยผู้ดำเนินการรายแรก ปฏิกิริยาล้มเหลวกับน้ำยาเดิมแต่ให้การขยายที่ดีกับ รีเอเจนต์ LuminoCt ® (__รูปที่ 11.24__) ![ไพรเมอร์ถึง EIFB1 ได้รับการทดสอบที่ระดับความเข้มข้นระหว่าง 200 นิวตันเมตรและ 900 นิวตันเมตร](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/concentrations-between-200.jpg "ไพรเมอร์ถึง EIFB1 ได้รับการทดสอบที่ระดับความเข้มข้นระหว่าง 200 นิวตันเมตรและ 900 นิวตันเมตร") __รูปที่ 11 21__ไพรเมอร์ถึง EIFB1 ได้รับการทดสอบที่ระดับความเข้มข้นระหว่าง 200 นิวตันเมตรและ 900 นิวตันเมตร ไม่พบการขยายสัญญาณภายใต้เงื่อนไขใดๆ (oligos และรีเอเจนต์ ABI ใน ABI StepOne Plus) ![ไพรเมอร์สองชุดสำหรับ EIFB1 ถูกเปรียบเทียบใน SYBR Green I reagent; ชุดที่ล้มเหลวเดิมและชุดใหม่](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/two-batches-of-primers.jpg "ไพรเมอร์สองชุดสำหรับ EIFB1 ถูกเปรียบเทียบใน SYBR Green I reagent; ชุดที่ล้มเหลวเดิมและชุดใหม่") __รูปที่ 11 22__ไพรเมอร์สองชุดสำหรับ EIFB1 ถูกเปรียบเทียบใน SYBR Green I reagent; ชุดที่ล้มเหลวเดิมและชุดใหม่ (oligos และ reagents บนตราสาร Ependorf Realplex) ทั้งสองชุดของไพรเมอร์สนับสนุนการขยาย ![ไพรเมอร์สองชุดและโพรบไปยัง EIFB1](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/were-compared-in-sigma.jpg "ไพรเมอร์สองชุดและโพรบไปยัง EIFB1") __รูปที่ 11 23__มีการเปรียบเทียบไพรเมอร์และโพรบสองชุดกับ EIFB1 ในรีเอเจนต์ LuminoCt ® ชุดที่ล้มเหลวเดิมและชุดใหม่ (oligos และ reagents บนตราสาร Ependorf Realplex) ทั้งสองชุดของ oligos สนับสนุนการขยาย ![การทดสอบไพรเมอร์และโพรบ EIFB1 ถูกรันในน้ำยาสองชนิดที่แตกต่างกัน](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/primer-and-probe-assay.jpg "การทดสอบไพรเมอร์และโพรบ EIFB1 ถูกรันในน้ำยาสองชนิดที่แตกต่างกัน") __รูปที่ 11 24__การทดสอบไพรเมอร์และโพรบ EIFB1 ทำงานในน้ำยาที่แตกต่างกันสองชนิด (รีเอเจนต์ ABI หรือ LuminoCt ® เดิม) ได้รับข้อมูลจากการวิเคราะห์นี้เมื่อรันโดยใช้รีเอเจนต์ LuminoCt ® เท่านั้น ### ประสิทธิภาพการตอบสนองไม่ถูกต้องและแปรผันได้ การทดสอบดำเนินการในการเจือจางแบบอนุกรมของ oligo เทียมโดยใช้ไพรเมอร์มาตรฐานและการทดสอบโพรบ การทดสอบได้รับการพัฒนาและปรับให้เหมาะสมกับเครื่องมือที่แตกต่างกันแต่ผลการเจือจางแปลกไม่ได้คาดว่าเมื่อถ่ายโอนไปยังห้องปฏิบัติการทดสอบและเครื่องมืออื่น (__รูปที่ 11 25 เอ__) เงื่อนไขการวิเคราะห์ทั้งหมดได้รับการปรับให้เหมาะสมอีกครั้งเพื่อให้เฉพาะเจาะจงกับห้องปฏิบัติการใหม่แต่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงข้อมูล ผู้ปฏิบัติงานสังเกตว่าผลที่ได้จะเด่นชัดขึ้นเมื่อทำการวิเคราะห์ซ้ำภายในไม่กี่ชั่วโมงโดยใช้ชุดการเจือจางเดียวกัน ในฐานะที่เป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการแก้ไขปัญหาการวิเคราะห์ถูกรันบนเครื่องมืออื่นโดยผู้ปฏิบัติงานคนอื่นที่สร้างเส้นโค้งมาตรฐานที่คาดไว้อีกครั้ง ซึ่งจะนำไปสู่ข้อเสนอแนะว่าปัญหาเบื้องต้นเกิดจากข้อผิดพลาดของผู้ปฏิบัติงานความล้มเหลวของเครื่องมือหรือความแปรผันเล็กน้อยในขั้นตอนการทดลอง เนื่องจากผู้ปฏิบัติงานทั้งสองมีประสบการณ์สูงและเครื่องมือทำงานได้ดีสำหรับการทดลองอื่นๆจึงมีการตรวจสอบตัวเลือกความแตกต่างเพียงเล็กน้อย เบาะแสที่สำคัญคือการสังเกตความแปรปรวนของข้อมูลจากชุดการเจือจางเดียวกันหลังจากเก็บตัวอย่างที่อุณหภูมิ 4  __25°C (รูปที่ 11.25 Aand 11__B) ซึ่งจะนำไปสู่การตรวจสอบหลอดที่ใช้สำหรับชุดการเจือจางและการทดสอบทางเลือกต่างๆ หลังจากเปลี่ยนไปใช้หลอดปฏิกิริยา Ependorf ขนาด 1.5 มล. สำหรับชุดการเจือจางเส้นโค้งมาตรฐานที่คาดการณ์ไว้ถูกสร้างขึ้น (__รูปที่ 11 25 องศาเซลเซียส__) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าจำเป็นต้องเลือกชีววิทยาโมเลกุลพลาสติกเก็บข้อมูลต่ำสำหรับ PCR และการวิเคราะห์เหล่านี้มีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงที่ละเอียดอ่อนในโปรโตคอล ![เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่าและตรวจพบโดยใช้การวิเคราะห์ตามโพรบเฉพาะ](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/an-artificial-oligo.jpg "เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่าและตรวจพบโดยใช้การวิเคราะห์ตามโพรบเฉพาะ") __รูปที่ 11 25 ก__เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่าและตรวจพบโดยใช้การวิเคราะห์ที่ใช้โพรบเฉพาะ มีความแตกต่างที่ไม่สอดคล้องกันระหว่างแปลงขยาย ![เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่า](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/template-was-diluted.jpg "เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่า") __รูปที่ 11 25 บาท__เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 4 เท่า (นี่คือการเจือจางที่ตรวจพบในรูปที่ 11 A) และทิ้งไว้ที่ 25°C เป็นเวลาหลายชั่วโมงก่อนที่จะถูกตรวจพบโดยใช้การวิเคราะห์ที่ใช้โพรบเฉพาะ มีความแตกต่างที่ไม่สอดคล้องกันระหว่างแผนการขยายสัญญาณซึ่งรุนแรงขึ้นตามเวลาระหว่างการเจือจางและการทดสอบ ![เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่าเป็นหลอดเกรดโมเลกุลชีววิทยา](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/pcr/molecular-biology-grade-tubes.jpg "เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่าเป็นหลอดเกรดโมเลกุลชีววิทยา") __รูปที่ 11 25 องศาเซลเซียส__เทมเพลต oligo เทียมถูกเจือจาง 10 เท่าลงในหลอดโมเลกุลชีววิทยาเกรดและตรวจพบโดยใช้การทดสอบที่ใช้โพรบเฉพาะ มีความแตกต่างที่สอดคล้องกันระหว่างแปลงขยายตามที่คาดไว้ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)สรุป—รายการตรวจสอบการแก้ไขปัญหา PCR - ตรวจสอบคุณภาพของตัวอย่าง (วัสดุที่มีประสิทธิภาพลดลงจะทำให้เกิดผลลัพธ์ที่ผิดพลาด) - ตรวจสอบโปรโตคอล RT เข้ากันได้กับการออกแบบ (เช่น Oligo-DT PRIMEDT ต้องมีการวิเคราะห์ qPCR ในลำดับที่ 3 ' 1 kb) - ตรวจสอบการออกแบบการวิเคราะห์ - ตรวจสอบการควบคุมทั้งหมด - ตรวจสอบไพรเมอร์โดยใช้ SYBR GREEN I ย้อม/ใช้เจล - ตรวจสอบให้แน่ใจว่าการตั้งค่าซอฟต์แวร์ถูกต้อง (พื้นฐาน, การตรวจจับสีย้อม, ความเข้มข้นของมาตรฐาน) - ตรวจสอบให้แน่ใจว่าความเข้มข้นของ ROX ใช้ได้กับเครื่องมือ (และไม่รบกวน multiplex) - ตรวจสอบระดับการเรืองแสงของพื้นหลัง - ตรวจสอบการติดฉลากโพรบด้วยการทดสอบ DNase I หรือการสังเคราะห์โพรบซ้ำ __บทความที่เกี่ยวข้อง__ - [คู่มือผลิตภัณฑ์ Extract-N-Amp ™](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/extract-n-amp-product-guide) - [การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [การเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์ PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [โคโลนี PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/colony-pcr) - [PCR ที่ยาวและแม่นยำ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/long-and-accurate-pcr) - [PCR Master Mix](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-master-mix) - [ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/polymerase-chain-reaction) - [ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification) - [View More](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __หมวดหมู่สินค้าที่เกี่ยวข้อง__ - [หัวปิเปต](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [สารเคมีและชุดอุปกรณ์ PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/molecular-biology-and-functional-genomics/pcr-and-amplification/pcr-reagents-and-kits) บนสุด __เข้าสู่ระบบเพื่อดำเนินการต่อ__ เพื่ออ่านต่อ โปรดเข้าสู่ระบบหรือสร้างบัญชีใหม่ เข้าสู่ระบบ__ยังไม่มีบัญชีใช่หรือไม่?__ลงทะเบียน หน้านี้ได้ถูกแปลโดยเครื่องแปลภาษาเพื่อความสะดวกของลูกค้าของเรา เราได้พยายามเพื่อให้มั่นใจว่าเครื่องแปลภาษาแปลได้ถูกต้องแม่นยำ อย่างไรก็ตาม เครื่องแปลภาษานั้นไม่สมบูรณ์แบบ หากคุณไม่พอใจกับเนื้อหาที่แปลโดยเครื่องแปลภาษา โปรดอ้างอิงจากฉบับภาษาอังกฤษ An unknown error has occured.