Cell Culture FAQs: การปนเปื้อนแบคทีเรียเอนโดท็อกซิน

What is endotoxin?

เอนโดท็อกซินเป็นโมเลกุลของไลโปโพลีแซคคาไรด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อแบคทีเรีย (LPS) ขนาดเล็กที่สามารถปนเปื้อนเครื่องใช้    ในการทำงานได้อย่างง่ายดายและมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อบอทฮิวิทร์ดินวิฟทดลอง การปรากฏตัวของพวกเขาถูกตรวจพบโดย Limulus amebocyte lysate(LAL assay)ซึ่งสามารถตรวจจับได้ถึง 0.01 หน่วย endotoxin (EU)/mL เอนโดท็อกซินมีขนาดประมาณ 10 KDA แต่สามารถสร้างส่วนผสมขนาดใหญ่ได้ถึง 1,000 KDA แบคทีเรียหลั่ง endotoxin ในปริมาณมากเมื่อเซลล์ตายและเมื่อพวกเขากำลังเติบโตอย่างแข็งขันและแบ่ง Escherichia coli เดี่ยวมีโมเลกุล LPS ประมาณ 2 ล้านโมเลกุลต่อเซลล์ เอนโดท็อกซินมีความเสถียรต่อความร้อนสูงทำให้ไม่สามารถทำลายได้ภายใต้สภาวะการฆ่าเชื้อปกติ พวกมันเป็นโมเลกุลสะเทินน้ำสะเทินบกที่มีประจุลบสุทธิในสารละลาย เนื่องจากความสามารถในการย่อยสลายของพวกเขาพวกเขาจึงมีแนวโน้มที่จะมีความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งกับวัสดุที่ไม่ชอบน้ำอื่นๆเช่นผลิตภัณฑ์พลาสติกที่ใช้ในห้องปฏิบัติการ ด้วยเหตุนี้การปนเปื้อนจากบีกเกอร์ในห้องปฏิบัติการบาร์กวนและเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการอื่นๆจึงเป็นเรื่องปกติ

Figure 1. Structure and physical properties of bacterial endotoxin. Endotoxins are complex lipopolysaccharides (LPS) present in the outer cell membrane of gram-negative bacteria. Endotoxins consist of a core polysaccharide chain, O-specific polysaccharide side chains (O-antigen) and a lipid component, Lipid A, which is responsible for the toxic effects.

ความแตกต่างระหว่าง endotoxin กับ exotoxin คืออะไร ?

ทั้งสองอย่างอาจเป็นอันตรายต่อการเพาะเลี้ยงเซลล์ สารพิษเป็นสารพิษซึ่งมักเป็นโปรตีนที่หลั่งออกมาจากแบคทีเรียและปล่อยออกมานอกเซลล์ ในขณะที่เอนโดท็อกซินเป็นสารพิษจากแบคทีเรียที่ประกอบด้วยไขมันที่อยู่ภายในผนังเซลล์ของแบคทีเรีย สารพิษจากภายนอกมักถูกทำลายด้วยความร้อนในขณะที่เอนโดท็อกซินไม่สามารถทำลายได้ด้วยอุณหภูมิสูง สารพิษมีแอนติเจนสูงและกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในขณะที่เอนโดท็อกซินไม่ได้

เอนโดท็อกซินผ่านการทดสอบอย่างไร ?

Limulus amebocyte lysate assay (LAL assay) เป็นการทดสอบที่ใช้กันมากที่สุดสำหรับ endotoxin Lal (มาจากปูเกือกม้า) ทำปฏิกิริยากับแบคทีเรีย endotoxin lipopolysaccharide (LPS) ซึ่งเป็นส่วนประกอบของเมมเบรนของแบคทีเรียแกรมลบเพื่อสร้างเจล - ก้อนซึ่งสามารถวัดได้ เอนโดท็อกซินวัดในหน่วยเอนโดท็อกซินต่อมิลลิลิตร (EU/mL) หนึ่งใน EU เท่ากับสารละลายเอนโดท็อกซิน/มล. ประมาณ 0.1 ถึง 0.2 นาโนกรัม ปัจจุบันการวิเคราะห์ LAL มีสามรูปแบบโดยแต่ละรูปแบบมีความไวที่แตกต่างกัน การวิเคราะห์ LAL gel clot สามารถตรวจจับได้ถึง 0.03 EU/mL ในขณะที่การวิเคราะห์ LAL kinetic turbidimetric และ chromogenic สามารถตรวจจับได้ถึง 0.01 EU/mL

Figure 2. LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.

แหล่งที่มาทั่วไปของการปนเปื้อน endotoxin ที่พบในห้องปฏิบัติการคืออะไร ?

การรักษาความสะอาดอย่างทั่วถึงในเครื่องใช้ในห้องปฏิบัติการวัตถุดิบสื่อและเทคนิคการใช้ในห้องปฏิบัติการที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญในการลดระดับ endotoxin ในห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเซลล์ นอกจากนี้ขอแนะนำให้กรองสื่อทั้งหมดโดยใช้อุปกรณ์กรองเช่น  ชุดกรอง Stericup ® ซึ่งสามารถกำจัดสารพิษที่อาจเกิดขึ้นทั้งหมดก่อนนำไปสู่เซลล์

• Water: น้ำที่มีความบริสุทธิ์สูงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับห้องปฏิบัติการทุกแห่ง Milli-Q^® Integral เป็นระบบทำน้ำให้บริสุทธิ์ที่มีน้ำปราศจากเอนโดท็อกซินในห้องปฏิบัติการโดยตรงจากน้ำประปา ระบบมีความสามารถในการผลิตน้ำบริสุทธิ์และ/หรือน้ำบริสุทธิ์ได้ถึง 300 ลิตร/วันตอบสนองความต้องการของห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ นอกจากนี้เรายังมีขวดใช้เดียว o fendotoxin ฟรี wate rfor การใช้งานเพาะเลี้ยงเซลล์ทั้งหมด
• เซรั่ม: เนื่องจากแหล่งที่มาของสัตว์ชีวภาพเซรั่มวัวในทารกในครรภ์ในอดีตเป็นผู้กระทำผิดหลักสำหรับ endotoxin ที่น่าเบื่อ อย่างไรก็ตามการคัดกรองที่ดีขึ้นจะช่วยลดความเสี่ยงลงได้อย่างมาก เซรั่มทุกล็อตของเราได้รับการทดสอบสำหรับระดับ endotoxin เพื่อให้แน่ใจว่ามีประสิทธิภาพในระดับสูง
• น้ำยาทั่วไปเช่น อีโคลี่ ปัจจัยการเจริญเติบโตของรีคอมบิแนนท์ที่ได้มาฮอร์โมนไขมันสื่อฐานและตัวทำปฏิกิริยาการแยกตัวออกเช่น trypsin ทั้งหมดสามารถเป็นแหล่งของ endotoxin ได้ เราทดสอบการเพาะเลี้ยงเซลล์ของเราทั้งหมดทดสอบน้ำยาสำหรับระดับ endotoxin
• พลาสติคแวร์/เครื่องแก้ว: เครื่องแก้วท่อพลาสติกและอุปกรณ์ควรปราศจากแอนโดรเจนและควรล้างด้วยน้ำปราศจากแอนโดรเจนหรือ endotoxin ต่ำ ขวดพลาสติกควรได้รับการฆ่าเชื้อด้วยการฉายรังสีแกมมา
• User Contamination: แบคทีเรียมีอยู่บนทุกพื้นผิวของผิวหนังเส้นผมและน้ำลาย ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้เทคนิคปลอดเชื้อที่เหมาะสมในขณะที่จัดการกับการเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อลดความเสี่ยงในการนำ endotoxin เข้าสู่ระบบ

What are the effects of endotoxin on cell cultures?

เอนโดท็อกซินมีผลต่อ    การเจริญเติบโตและการทำงานของบ็อตฮิวิตร์ดินวิฟโอเซลล์และเป็นแหล่งที่มาของความแปรปรวนที่สำคัญ ในหลอดทดลองมีหลักฐานที่เพิ่มขึ้นว่า endotoxin ทำให้เกิดปัญหาต่างๆสำหรับการวิจัยเพาะเลี้ยงเซลล์ ในบรรดาผลที่ได้รับการบันทึกไว้คือการกระตุ้นวัฒนธรรมเม็ดเลือดขาวเพื่อสร้างปัจจัยเนื้อเยื่อการผลิตที่เกิดขึ้นจาก IL 6 ใน macrophages ที่เท่ากันและการยับยั้งการก่อตัวของเม็ดเลือดแดงเม็ดเลือดแดงในระดับต่ำมาก (น้อยกว่า 1 นาโนกรัม/มล.) ของ endotoxin ในร่างกายเอนโดท็อกซินกระตุ้นการตอบสนองต่อการอักเสบในการศึกษาสัตว์ การปรากฏตัวของ endotoxin ในผลิตภัณฑ์สำหรับการฉีด (วัคซีนและยาที่ฉีดได้) อาจส่งผลให้เกิดการตอบสนองของ pyrogenic ตั้งแต่ไข้และหนาวสั่นไปจนถึงการช็อตติดเชื้อที่ไม่สามารถย้อนกลับได้และร้ายแรง

What are the acceptable limits of endotoxin in cell cultures?

เนื่องจากความเสี่ยงร้ายแรงที่เกี่ยวข้องกับการปนเปื้อนของ endotoxin องค์การอาหารและยาแห่งสหรัฐอเมริกา (FDA) ได้กำหนดขีดจำกัดความเข้มข้นของ endotoxin สำหรับอุปกรณ์ทางการแพทย์และยาเสพติดในหลอดเลือดดำที่นักวิจัยควรตระหนักถึง ขีดจำกัดของ FDA ในปัจจุบันกำหนดให้ eluates จากอุปกรณ์ทางการแพทย์ต้องน้อยกว่า 0.5 EU/mL เว้นแต่อุปกรณ์จะสัมผัสกับน้ำไขสันหลังที่มีขีดจำกัดอยู่ที่ 0.06 EU/mL

คุณจะป้องกันการปนเปื้อน endotoxin ได้อย่างไร ?

จำเป็นต้องใช้สารรีเอเจนต์อาหารเสริมและสื่อที่ผ่านการทดสอบจาก endotoxin จากซัพพลายเออร์น้ำยาที่เชื่อถือได้ นอกจากนี้ยังเป็นสิ่งสำคัญที่จะใช้เทคนิคปลอดเชื้อที่เหมาะสมและล้างและฆ่าเชื้ออย่างทั่วถึง plasticware เพาะเลี้ยงเซลล์และวัสดุสิ้นเปลืองเช่นปิเปตและหลอดรูปกรวยก่อนที่จะเพาะเลี้ยงเซลล์

วิธีการกำจัด endotoxin ถ้าวัฒนธรรมกลายเป็นปนเปื้อน ?

ขอแนะนำให้ทิ้งน้ำยาและเซลล์ทั้งหมดหากวัฒนธรรมปนเปื้อนด้วย endotoxin และเริ่มด้วยน้ำยาและเซลล์ใหม่ อย่างไรก็ตามหากไม่สามารถกำจัดสารตัวทำปฏิกิริยาที่ทิ้งตัวอย่างได้สามารถนำไปใช้เพื่อกำจัดได้  โซลูชันการกำจัดเอนโดท็อกซิน ช่วยให้มั่นใจได้ถึงคุณสมบัติของไมเซลล่าร์ของไทรทันเอ็กซ์ 114 เพื่อกำจัดเอนโดท็อกซิน LPS ออกจากตัวอย่าง