Phương pháp & bước sắp xếp của người cấp dưới
What is Sanger Sequencing?
Trình tự Sanger, còn được gọi là "phương pháp chấm dứt chuỗi", là một phương pháp để xác định trình tự nucleotide của DNA. Phương pháp này được phát triển bởi hai lần đoạt giải Nobel Frederick Sanger và các đồng nghiệp của ông vào năm 1977, do đó có tên là Chuỗi Sanger.
Để xem lại cấu trúc chung của DNA, vui lòng xem Hình 2.
Đánh giá của biệt động hoạt động như thế nào?
Sắp xếp trình tự Sanger có thể được thực hiện thủ công hoặc phổ biến hơn, trong một cách tự động thông qua máy sắp xếp trình tự (Hình 1). Mỗi phương pháp thực hiện theo ba bước cơ bản, như được mô tả dưới đây.
Hình 1.Ba bước cơ bản của sắp xếp hệ thống cấp cứu tự động.
Các bước sắp xếp hiệp sĩ
Có ba bước chính để sắp xếp trình tự Sanger.
1. Trình tự DNA cho PCR chấm dứt chuỗi
Trình tự DNA quan tâm được sử dụng như một khuôn mẫu cho một loại PC Rgọi là PCR kết thúc chuỗi đặc biệt. PCR kết thúc chuỗi hoạt động giống như PCR tiêu chuẩn, nhưng với một sự khác biệt lớn: Bổ sung các nucleotide sửa đổi (dNTPs) được gọi là dideoxyribonucleotide (dNTPs). Trong bước mở rộng của PCR tiêu chuẩn, DNA polymerase thêm dNTP vào một chuỗi DNA đang phát triển bằng cách xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 3-OH tự do của nucleotide cuối cùng và 5-phosphate của entering an sinh (hình 2).
Trong PCR chấm dứt chuỗi, người dùng pha trộn tỷ lệ ddNTP chấm dứt chuỗi thấp với các dNTP bình thường trong phản ứng PCR. DdNTPs thiếu 3'-O Hgroup cần thiết cho sự hình thành phosphodiester bon; do đó, khi DNA polymerase kết hợp một dddNTTP ngẫu nhiên, việc mở rộng sẽ chấm dứt. Kết quả của PCR chấm dứt chuỗi là hàng triệu đến hàng tỷ bản sao oligonucleotide của chuỗi DNA quan tâm, chấm dứt ở độ dài ngẫu nhiên (n) bởi 5-dNTP sinh hoạt.
I Nmanual Sanger sequencing, bốn phản ứng PCR được thiết lập, mỗi phản ứng chỉ có một loại ddNTP (dddATP, dddtTP, ddddGTP và dddCTP) trộn vào.
I nautomated Sanger sequencing, tất cả dNTP được trộn lẫn trong một phản ứng duy nhất, và mỗi trong bốn dNTP có một nhãn huỳnh quang duy nhất.
2. Phân tách kích thước bằng điện di Gel
Trong bước thứ hai, các oligonucleotide kết thúc chuỗi được phân tách bằng kích thước thông qua điện di gel. Trong điện di gel, các mẫu DNA được nạp vào một đầu của ma trận gel, và một dòng điện được áp dụng; DNA được tích điện âm, do đó các oligonucleotide sẽ được kéo về phía điện cực dương ở phía đối diện của gel. Bởi vì tất cả các mảnh DNA có cùng điện tích trên mỗi đơn vị khối lượng, tốc độ mà các oligonucleotide di chuyển sẽ chỉ được xác định theo kích thước. Một mảnh nhỏ hơn thì càng ít ma sát khi nó di chuyển qua gel, và nó sẽ di chuyển nhanh hơn. Kết quả là, các oligonucleotide sẽ được sắp xếp từ nhỏ nhất đến lớn nhất, đọc gel từ dưới lên trên.
I Nmanual Sanger sequencing, các oligonucleotide từ mỗi trong bốn phản ứng PCR được chạy trong bốn làn riêng biệt của một loại gel. Điều này cho phép người dùng biết oligonucleotide nào tương ứng với mỗi dNTNTNTP.
Tôi đã xác định trình tự Sanger, tất cả các oligonucleotide được chạy trong một điện di gel mao mạch duy nhất trong máy giải trình tự.
3. Phân tích gel & xác định trình tự DNA
Bước cuối cùng chỉ đơn giản liên quan đến việc đọc gel để xác định trình tự của DNA đầu vào. Bởi vì DNA polymerase chỉ tổng hợp DNA trong hướng 5 đến 3 bắt đầu từ một mồi được cung cấp, mỗi ddNTP đầu cuối sẽ tương ứng với một nucleotide cụ thể trong trình tự ban đầu (ví dụ: Mảnh ngắn nhất phải chấm dứt ở nucleotide đầu tiên từ đầu 5, đoạn ngắn thứ hai phải chấm dứt ở nucleotide thứ hai từ đầu 5, v.v.) Do đó, bằng cách đọc các dải gel từ nhỏ nhất đến lớn nhất, chúng tôi có thể xác định chuỗi sinh hoạt 5 đến 3 của chuỗi DNA ban đầu.
I Nmanual Sequencing, người dùng đọc tất cả bốn làn của gel cùng một lúc, di chuyển từ dưới lên trên, sử dụng làn để xác định danh tính của dNTP đầu cuối cho mỗi dải tần số. Ví dụ, nếu dải dưới cùng được tìm thấy trong cột tương ứng với dddgTP, thì đoạn PCR nhỏ nhất kết thúc với dddgTP, và nucleotide đầu tiên từ đầu 5 của chuỗi ban đầu có một cơ sở guanine (G).
I nautomated Sanger sequencing, một máy tính đọc từng dải gel mao mạch, theo thứ tự, sử dụng huỳnh quang để gọi danh tính của mỗi thiết bị đầu cuối dNTP. Nói ngắn gọn, laser kích thích các thẻ huỳnh quang trong mỗi dải và máy tính phát hiện ánh sáng phát ra. Bởi vì mỗi trong bốn ddNTP được gắn nhãn huỳnh quang khác nhau, ánh sáng phát ra có thể được gắn trực tiếp với nhận dạng của ddNTTP thiết bị đầu cuối. Đầu ra được gọi là chromatogram, cho thấy đỉnh huỳnh quang của mỗi nucleotide dọc theo chiều dài của mẫu DNA.
Hình 2.Cấu trúc DNA Schematic. DNA là một phân tử bao gồm hai sợi cuộn quanh nhau để tạo thành một chuỗi xoắn kép. Mỗi chuỗi được tạo thành từ một chuỗi các phân tử được gọi là deoxyribonucleotide (dNTPs).
Mỗi dNTP chứa một nhóm phosphate, một nhóm đường và một trong bốn bazơ nitơ [adenine (A), thymine (T), guanine (G), hoặc cytosine (C)]. Các dNTP được xâu lại với nhau theo kiểu tuyến tính bởi liên kết cộng hóa trị phosphodiester giữa đường của một dNTP và nhóm phosphate tiếp theo; mô hình đường-phosphate lặp đi lặp lại này tạo thành xương sống đường-phosphate.
Các bazơ nitơ của hai sợi riêng biệt được liên kết với nhau bởi các liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung để tạo thành chuỗi xoắn DNA sợi kép.
Cách đọc kết quả đánh giá của người bảo vệ
Việc đọc kết quả trình tự Sanger đúng cách sẽ phụ thuộc vào việc trong hai chuỗi DNA bổ sung nào được quan tâm và mồi có sẵn. Nếu hai sợi DNA là A và B và sợi A là mối quan tâm, nhưng mồi tốt hơn cho dải B, các mảnh đầu ra sẽ giống hệt với dải A. Mặt khác, nếu dải A được quan tâm và mồi tốt hơn cho dải A, sau đó đầu ra sẽ giống hệt với strand B. Theo đó, đầu ra phải được chuyển đổi trở lại dải A.
Vì vậy, nếu trình tự quan tâm đọc là "TACG" và mồi tốt nhất cho dải đó, đầu ra sẽ là "ATGC" và do đó, phải được chuyển đổi trở lại thành "TACG". Tuy nhiên, nếu mồi tốt hơn đối với dải bổ sung ( của Alone ATGC "), thì đầu ra sẽ là "TACG", đó là chuỗi chính xác.
Tóm lại, trước khi bắt đầu, bạn cần biết mục tiêu của mình là gì và làm thế nào để đạt được mục tiêu đó! Vì vậy, hãy nhớ điều này, đây là ví dụ về ví dụ trước đây (TACG -> ATGC -> TACG). Nếu các nhãn dideoxynucleotide là T = vàng, A = hồng, C = xanh đậm và G = xanh nhạt, bạn sẽ kết thúc với các chuỗi ngắn primer-A, primer-AT, primer-ATG và primer-ATGC. Một khi các mảnh đã được phân tách bằng điện di, laser sẽ đọc các mảnh theo thứ tự chiều dài (hồng, vàng, xanh nhạt và xanh đậm) và tạo ra một sắc ký. Máy tính sẽ chuyển đổi các chữ cái, vì vậy chuỗi cuối cùng là TACG chính xác.
Sắp xếp sơ đồ đối lập với PCR
Trình tự Sanger và PCR sử dụng các vật liệu ban đầu tương tự và có thể được sử dụng kết hợp với nhau, nhưng không thể thay thế vật liệu khác.
PCR is used to amplify DNA in its entirety. Trong khi các mảnh có độ dài khác nhau có thể được tạo ra một cách ngẫu nhiên (ví dụ, DNA polymerase có thể rơi ra), mục tiêu là sao chép toàn bộ chuỗi DNA. Cuối cùng, "thành phần" là DNA, nucleotide, mồi DNA và DNA polymerase đích (đặc biệt là Taq polymerase, có thể tồn tại ở nhiệt độ cao cần thiết trong PCR).
Ngược lại, mục tiêu của việc sắp xếp trình tự Sanger là tạo ra mọi chiều dài có thể của DNA đến chiều dài đầy đủ của DNA mục tiêu. Đó là lý do tại sao, ngoài các vật liệu ban đầu PCR, các dideoxynucleotide là cần thiết.
Trình tự của Sanger và PCR có thể được kết hợp lại với nhau khi tạo ra vật liệu ban đầu cho giao thức sắp xếp trình tự Sanger. PCR có thể được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của DNA cần được giải trình tự.
Có nhiều mẫu để làm việc giúp giao thức Sanger hiệu quả hơn. Nếu trình tự đích dài 1.000 nucleotide và chỉ có một bản sao của mẫu, nó sẽ mất nhiều thời gian hơn để tạo ra 1.000 đoạn được gắn thẻ. Tuy nhiên, nếu có một số bản sao của mẫu, theo lý thuyết, sẽ mất ít thời gian hơn để tạo ra tất cả 1.000 mảnh được gắn thẻ.
Sản phẩm liên quan
Response not successful: Received status code 500
Để tiếp tục tìm hiểu, vui lòng đăng nhập hoặc tạo tài khoản.
Không có tài khoản?Để mang đến sự thuận tiện cho khách hàng, trang này đã được dịch bằng máy. Chúng tôi đã nỗ lực để đảm bảo việc dịch máy này cho ra bản dịch chính xác. Tuy nhiên, chất lượng dịch máy không được hoàn hảo. Nếu bạn không hài lòng với nội dung dịch bằng máy, vui lòng tham khảo phiên bản tiếng Anh.