Các phương pháp được sử dụng để phát hiện protein và axit nucleic liên kết với màng

Các phương pháp phát hiện khác nhau được sử dụng để hình dung các axit nucleic và các protein cụ thể được chuyển sang hỗ trợ màng. Các vết mờ phía nam và phía bắc liên quan đến việc sử dụng các đầu dò phóng xạ, và việc phát hiện liên quan đến việc tiếp xúc với phim chụp X quang hoặc phim chụp X quang tự động trong bóng tối. Trong blotting phương Tây, các protein trên màng nitrocellulose có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phép đo màu, hóa phát quang hoặc kỹ thuật huỳnh quang.

Western Blotting Detection Methods

Phát hiện đo màu

Nguyên lý: Các phương pháp phát hiện thường được sử dụng liên quan đến việc sử dụng kháng thể chính đặc hiệu protein, sau đó phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp kết hợp với enzyme HRP (peroxidase horseradish) hoặc enzyme AP (phosphatase kiềm). Khi chất nền chromogen được thêm vào, enzyme xúc tác một phản ứng và tạo ra một kết tủa màu được lắng đọng trên vết mực. Kết tủa này có thể dễ dàng nhìn thấy và có thể được chụp ảnh.

Hình 1. Phát hiện bằng đo màu của protein trên màng

Hệ thống peroxidase cải ngựa (HRP): Các chất nền tương thích với HRP là 4-chloro-1-naphthol (4-CN; C8302), 3, 3-diaminobenzidine (DAB; D5905) và 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB; T0565).

Với sự hiện diện của hydro peroxide, HRP liên hợp với kháng thể thứ cấp

• Oxy hóa 4-CN thành kết tủa 4-chloro-1-naphthon màu tím hơi xanh
• Polyme hóa DAB thành kết tủa màu nâu phức tạp
• Oxy hóa TMB thành kết tủa TMB diimine màu xanh đậm

Chất nền tương thích với AP là sự kết hợp của 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP^®) một tetrazolium dnitroblue (NBT) (B5655, B6404, B6777, B1911)

Hình dung một protein trên vết mực phương Tây sử dụng kháng thể thứ cấp liên hợp với AP liên quan đến đỉnh cao của phản ứng hai bước với 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Một tetrazolium dnitroblue (NBT). AP xúc tác sự hình thành chất trung gian bromochloro indoxyl bằng cách khử phosphoryl. NBT oxy hóa indoxyl để tạo ra kết tủa màu tím và lần lượt bị khử thành kết tủa diformazan màu xanh không hòa tan. Sự kết hợp của hai kết tủa dẫn đến kết tủa màu tím-xanh có thể nhìn thấy trên vết mực tại vị trí protein quan tâm.

Hình 2. Cấu trúc phương pháp phát hiện

Phát hiện hóa phát quang

Nguyên tắc: Hóa phát quang là một quá trình mà phản ứng hóa học liên quan đến một chất dẫn đến giải phóng năng lượng dưới dạng ánh sáng. Ánh sáng phát ra có thể được ghi lại trên phim X quang. Phương pháp phát hiện được sử dụng phổ biến nhất này liên quan đến việc phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp kết hợp với HRP (peroxidase cải ngựa) hoặc AP (phosphatase kiềm).

Hình 3. Phát hiện hóa phát quang protein trên màng

Hệ thống peroxidase-luminol cải ngựa: Luminol là một chất nền phát quang hóa học của HRP. Với sự hiện diện của peroxide, HRP oxy hóa luminol thành một sản phẩm kích thích gọi là 3-aminophthalate phát ra ánh sáng ở 425 nm. Phát thải tiếp tục cho đến khi 3-aminophthalate phân rã và đi vào trạng thái cơ bản. Ánh sáng phát ra có thể được ghi lại bằng camera CCD hoặc bằng cách tiếp xúc với phim X-Ray.

Alkaline phosphatase (AP)-Hệ thống CDP- STAR ®: CDP-Star^® (dinatri 2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2-(5-chloro)tricyclo [3.3.1.1^3,7]decan}-4-yl)-1-phenyl phosphate) là một chất nền hóa phát quang của AP. CDP-Star^® được khử phosphoryl hóa bởi AP để tạo ra anion phenolate dioxetane ổn định meta phát ra ánh sáng ở bước sóng 466 nm. Ánh sáng phát ra ổn định lên đến 24 giờ cho phép chụp nhiều lần với phim X-Ray.  

Chúng tôi cung cấp một loạt các kháng thể thứ cấp kết hợp với các enzyme HRP và AP. Những kháng thể thứ cấp này có thể được sử dụng với các thuốc thử phát hiện sau đây trong blotting phương Tây.

Phát hiện huỳnh quang

Nguyên lý: Protein quan tâm trên các vết phương Tây cũng có thể được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể chính hoặc thứ cấp kết hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở bước sóng cụ thể và có thể được phát hiện bằng cách chụp ảnh vết mực.

Hình 4. Phát hiện huỳnh quang của protein trên màng

Chúng tôi cung cấp một loạt các kháng thể thứ cấp kết hợp với nhiều loại thuốc nhuộm huỳnh quang Atto. Chúng phù hợp nhất cho việc tiêm chủng đa nhân trong đó hai kháng thể thứ cấp kết hợp với thuốc nhuộm Atto sử dụng các bước sóng kích thích/phát xạ khác nhau. Ghép kênh với các kháng thể thứ cấp kết hợp với thuốc nhuộm Atto được áp dụng nhiều nhất để phát hiện một protein cụ thể ở trạng thái phosphoryl hóa và không phosphoryl hóa.

 

Phương pháp phát hiện phương pháp phân tích phương pháp phía Nam và phía Bắc

Phương Nam và phương Bắc blotting liên quan đến việc sử dụng các đầu dò phóng xạ, và việc phát hiện liên quan đến việc tiếp xúc với phim chụp X quang hoặc phim chụp X quang tự động trong bóng tối. Tuy nhiên, có các chất nền hóa phát quang có thể được sử dụng để phát hiện axit nucleic được chuyển vào màng nylon.

Phát hiện hóa phát quang

Để phát hiện phát quang hóa của các đầu dò axit nucleic, cần phải ủ màng trong bộ đệm ngăn chặn (B6429, C7594, G7663) trong 60 phút.

Phản ứng giữa HRP và luminol cũng có thể được áp dụng để phát hiện axit nucleic ở phương Nam và Bắc blotting. Các đầu dò DNA và RNA có thể được dán nhãn với HRP trong một phản ứng ghi nhãn đơn giản. Đầu dò có dán nhãn có thể được sử dụng mà không làm sạch thêm. Đầu dò có thể được phát hiện trên vết mực bằng phản ứng tạo ra ánh sáng giữa HRP và luminol.

 Hệ thống CDP- Star ®: Các đầu dò DNA và RNA có thể được dán nhãn bằng CDP-Star^® với phosphatase kiềm nhiệt ổn định trong một phản ứng ghi nhãn đơn giản. Đầu dò có dán nhãn có thể được sử dụng mà không làm sạch thêm. Độ nghiêm ngặt lai có thể được kiểm soát bởi nhiệt độ cũng như nồng độ muối.

Chúng tôi cung cấp các thuốc thử phát hiện phát quang hóa học sau đây cho phương Nam và phương Bắc.

Phim X-Ray dùng để phát hiện

We offers a wide range of X-ray films for chemiluminescence detection of proteins on Western blots. Chúng có sẵn với các kích cỡ gói tiện lợi khác nhau.  Các kích thước gói phổ biến nhất của phim Carestream Kodak Biomax được liệt kê dưới đây.

Phát hiện tàu thăm dò phóng xạ ở Nam và Bắc là bằng cách tiếp xúc với phim X-Ray ở -80 °C. Để phát hiện vết đốm miền Nam và miền Bắc, chúng tôi cung cấp các đoạn phim X-Ray sau với các kích cỡ gói tiện lợi khác nhau. Các kích thước gói phổ biến nhất của phim Carestream Kodak Biomax được liệt kê dưới đây.

Protocol để phát hiện protein và axit nucleic

Chromogenic Detection of Protein (bằng tiếng Anh)

Phát hiện bằng giải pháp 4-CN:

• Sau khi hoàn thành blotting phương Tây, ấp kín vết mực trong ngăn chặn bộ đệm và kháng thể chính.
  
• Ủ ấm vết mực với kháng thể thứ cấp được dán nhãn HRP hoặc AP.
  
• Thời gian ủ bệnh sẽ phụ thuộc vào protein quan tâm và nồng độ của các kháng thể được sử dụng.
  
• Đặt vết mực trên bề mặt sạch, bằng phẳng.
  
• Chuẩn bị dung dịch chất nền bằng cách kết hợp 4-CN và hydro peroxide sao cho nồng độ cuối cùng của peroxide là 0,01%.
  
• Che phủ đồng đều toàn bộ bề mặt vết mực bằng dung dịch chất nền ở nhiệt độ phòng trong 1-5 phút.
  
• Sau khi cường độ mong muốn của màu được phát triển, dừng phản ứng bằng cách rửa vết mực bằng nước.
  
• Thu nhận hình ảnh vết mực.

Phát hiện bằng DAB:

• Sau khi hoàn thành blotting phương Tây, ấp kín vết mực trong ngăn chặn bộ đệm và kháng thể chính.
• Ủ ấm vết mực với kháng thể thứ cấp được dán nhãn HRP hoặc AP.
• Thời gian ủ bệnh sẽ phụ thuộc vào protein quan tâm và nồng độ của các kháng thể được sử dụng.
• Đặt vết mực trên bề mặt sạch, bằng phẳng.
• Chuẩn bị dung dịch chất nền bằng cách hòa tan một viên DAB trong 15 mL dung dịch muối đệm tris, pH 7,6. Thêm 12 µL của hydro peroxide mới 30% trước khi sử dụng. Nồng độ DAB và peroxide có thể được thay đổi, theo yêu cầu.
• Che phủ đồng đều toàn bộ bề mặt vết mực bằng dung dịch chất nền ở nhiệt độ phòng trong 1-5 phút.
• Sau khi cường độ mong muốn của màu được phát triển, dừng phản ứng bằng cách rửa vết mực bằng nước.
• Thu nhận hình ảnh vết mực.

Phát hiện bằng TMB:

• Sau khi hoàn thành blotting phương Tây, ấp kín vết mực trong ngăn chặn bộ đệm và kháng thể chính.
• Ủ ấm vết mực với kháng thể thứ cấp được dán nhãn HRP hoặc AP.
• Thời gian ủ bệnh sẽ phụ thuộc vào protein quan tâm và nồng độ của các kháng thể được sử dụng.
• Đặt vết mực trên bề mặt sạch, bằng phẳng.
• Phủ toàn bộ bề mặt vết mực đồng nhất với giải pháp TMB ở nhiệt độ phòng trong 5-15 phút.
• Sau khi cường độ mong muốn của màu được phát triển, dừng phản ứng bằng cách rửa vết mực với nước có độ tinh khiết cao.
• Thu nhận hình ảnh vết mực.

Phát hiện bằng BCIP® /NBT:

• Sau khi hoàn thành blotting phương Tây, ấp kín vết mực trong ngăn chặn bộ đệm và kháng thể chính.
• Ủ ấm vết mực bằng kháng thể thứ cấp được dán nhãn HRP hoặc AP.
• Thời gian ủ bệnh sẽ phụ thuộc vào protein quan tâm và nồng độ của các kháng thể được sử dụng.
• Đặt vết mực trên bề mặt sạch, bằng phẳng.
• Phủ toàn bộ bề mặt vết mực đồng nhất với  Tsolution BCIP ® /NB ở nhiệt độ phòng trong 1-5 phút.
• Sau khi cường độ mong muốn của màu sắc được phát triển, dừng phản ứng bằng cách rửa vết mực bằng nước hoặc dung dịch axit axetic 1%.
• Thu nhận hình ảnh vết mực.

Phát quang hóa Phát hiện protein

• Sau khi hoàn thành blotting phương Tây, ấp kín vết mực trong ngăn chặn bộ đệm và kháng thể chính.
• Ủ ấm vết mực với kháng thể thứ cấp được dán nhãn HRP hoặc AP.
• Thời gian ủ bệnh sẽ phụ thuộc vào protein quan tâm và nồng độ của các kháng thể được sử dụng.
• Đặt vết mực trên bề mặt sạch, bằng phẳng.
• Chuẩn bị thuốc thử phát quang hóa học bằng cách trộn các thể tích bằng nhau của thuốc thử luminol và chất oxy hóa trong cốc. Đổ hỗn hợp này lên vết mực và ủ khoảng 1 phút bằng cách lắc nhẹ.
• Loại bỏ thuốc thử phát quang hóa dư thừa bằng cách nhúng vết mực trên giấy thấm.
• Chuyển vết mực sang phòng tối.
• Đặt vết mực vào giữa hai lớp bọc nhựa trong hộp đựng phim. Làm mịn bọt khí, nếu có.
• Đặt phim X-Ray lên đỉnh của vết mực, phơi sáng trong khoảng 30 giây và phát triển.
• Thay đổi thời gian phơi sáng theo yêu cầu để phát hiện tối ưu.

Hóa phát quang Phát hiện axit nucleic

Giao thức trên cũng có thể được sử dụng nếu thuốc thử phát quang hóa học đang được sử dụng để phát hiện axit nucleic trên các vết phương Nam và Bắc.

Tài liệu tham khảo

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.