Digixigenin (DIG) Labelling Methods (BẰNG TIẾNG Anh)

Section Overview

• Digoxigenin (DIG) Labelling and Anti-DIG Antibody (BẰNG TIẾNG Anh)
• ĐÀO nhãn DNA bằng PCR
• DIG Random primed DNA Labelling
• Nick Translation Labelling of dsDNA for in Situ Probes
• Sao chép nhãn của các đầu dò RNA
• DIG oligonucleotide 5 End-Labeling, 3 End-Labelling, và 3 Tail Labelling
• Ước tính hiệu suất đầu dò theo Quy trình phát hiện trực tiếp
• Tải về và tài nguyên liên quan đến DIG

Digoxigenin (DIG) Labelling and Anti-DIG Antibody (BẰNG TIẾNG Anh)

Hệ THỐNG DIG là công nghệ không phóng xạ được lựa chọn để dán nhãn và phát hiện axit nucleic cho nhiều ứng dụng. Hệ thống này dựa trên một steroid được phân lập từ các cây digitalis (Digitalis purpurea và Digitalis lanata). Những cây này là nguồn tự nhiên duy nhất của digoxigenin, vì vậy kháng thể chống ĐÀO không liên kết với các vật liệu sinh học khác, đảm bảo ghi nhãn cụ thể. Do tính đặc hiệu cao này, cần ít vật liệu hơn so với ghi nhãn phóng xạ làm cho hệ thống ĐÀO lý tưởng cho phân tích lai tạo hạt nhân. Axit nucleic cố định được lai với đầu dò được dán nhãn ĐÀO và phát hiện sau đó được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể Anti-Digoxigenin ái lực cao, kết hợp với phosphatase kiềm (AP), peroxidase horseradish (HRP), fluorescein hoặc rhodamine để phát hiện màu, và chemiluminescent hoặc huỳnh quang.

Hình 1. Ví dụ phát hiện axit nucleic có dán nhãn ĐÀO bằng cách sử dụng chất nền hóa phát quang.

ĐÀO nhãn DNA bằng PCR

Dán nhãn PCR là phương pháp ưu tiên để chuẩn bị đầu dò có nhãn ĐÀO khi mẫu chỉ có số lượng giới hạn, được lọc một phần hoặc rất ngắn. Nó đòi hỏi tối ưu hóa ít hơn các phương pháp khác và tạo ra năng suất cao của đầu dò có nhãn. Trong ghi nhãn PCR, một polymerase ổn định nhiệt kết hợp DIG-dUTP khi nó khuếch đại một vùng cụ thể của DNA mẫu. Kết quả là một đầu dò lai được dán nhãn cao, cụ thể và cực kỳ nhạy cảm.

Reaction Principle

Trong một phản ứng PCR tiêu chuẩn, Digoxigenin-11-dUTP được tích hợp vào DNA mới tổng hợp. Điều kiện tiên quyết duy nhất là một số thông tin trình tự của trình tự đích là cần thiết để tổng hợp các mồi thích hợp. Hệ THỐNG ĐÀO không phóng xạ sử dụng digoxigenin, một hapten steroid, để gắn nhãn DNA, RNA, hoặc oligonucleotide để lai tạo, và phát hiện màu sắc hoặc phát hiện phát quang tiếp theo. Digoxigenin được kết hợp với dUTP thông qua một liên kết este không bền kiềm. Các dUTP được dán nhãn có thể dễ dàng kết hợp bằng cách tổng hợp axit nucleic enzyme bằng cách sử dụng DNA polymerase. Sự kết hợp của việc dán nhãn không phóng xạ với PCR là một công cụ mạnh mẽ để phân tích các sản phẩm PCR và để chuẩn bị các đầu dò được dán nhãn từ một lượng nhỏ của chuỗi đích tương ứng.

TÌM HIỂU nhãn DNA theo các tính năng và lợi ích của PCR

PCR Conditions

• Tối ưu hóa các thông số khuếch đại PCR (điều kiện đạp xe, nồng độ mẫu, trình tự mồi và nồng độ mồi) cho mỗi mẫu và bộ mồi được đặt trong trường hợp không có DIGdUTP trước khi thử kết hợp ĐÀO.

Template

• Để có kết quả tốt nhất, hãy dùng chèn được nhân bản làm mẫu. DNA bộ gen có thể khó sử dụng hơn.
• Nồng độ khuôn mẫu rất quan trọng để sản xuất thành công que đo cụ thể.

Dán nhãn

 PCR DIG Probe Synthesis Ki đòi hỏi tối ưu hóa ít hơn hầu hết các phương pháp ghi nhãn, bởi vì nó chứa Bung rộng High Fidelity Enzyme Blend. Lợi ích của sự pha trộn enzyme này bao gồm:

• Có thể sử dụng hiệu quả các vùng giàu GC làm mẫu
• Đối với hầu hết các mẫu, không yêu cầu tối ưu hóa MgCl 2concentration và phản ứng dán nhãn sẽ hoạt động với nồng độ tiêu chuẩn 1,5 mm MgCl₂

DIG Random primed DNA Labelling

Phương pháp ghi nhãn DNA "mồi ngẫu nhiên" dựa trên sự lai tạo của hỗn hợp của tất cả các hexanucleotide có thể có với mẫu DNA. Tất cả các tổ hợp trình tự được đại diện trong hỗn hợp mồi hexanucleotide, dẫn đến liên kết mồi với DNA mẫu theo cách thống kê. Do đó, một mức độ ghi nhãn bằng nhau dọc theo toàn bộ chiều dài của mẫu DNA được đảm bảo. Chuỗi bổ sung được tổng hợp từ đầu 3´ OH của mồi hexanucleotide ngẫu nhiên sử dụng enzyme Klenow, cấp dán nhãn. Deoxyribonucleoside triphosphat biến đổi ([32P]-, [35S]-, [3H]-, [125I]-, digoxigenin hoặc biotinlabored) có trong phản ứng được tích hợp vào chuỗi DNA bổ sung mới được tổng hợp.

Những đầu dò được dán nhãn này đặc biệt thích hợp cho việc phát hiện gen sao chép đơn trên các blot bộ gen miền Nam, sàng lọc các thư viện tái tổ hợp, chấm / khe cắm, và các blot phía bắc. Vì mỗi mồi có một chuỗi sáu base khác nhau, sản phẩm đầu dò được dán nhãn sẽ là một tập hợp các mảnh có độ dài thay đổi. Do đó, đầu dò được dán nhãn sẽ xuất hiện dưới dạng một vết bẩn, chứ không phải là một dải duy nhất trên gel. Sự phân bố kích thước của đầu dò được dán nhãn phụ thuộc vào chiều dài của mẫu gốc.

Reaction Principle

Trong dán nhãn ngẫu nhiên, enzyme Klenow sao chép khuôn mẫu DNA với sự có mặt của mồi hexamer và DIG-11-dUTP. Trung bình, enzyme chèn một nửa ĐÀO trong mỗi khoảng 20-25 nucleotide. Sản phẩm được dán nhãn kết quả là một đầu dò lai nhạy cảm, được dán nhãn đồng nhất, có khả năng phát hiện ít nhất 0,10 - 0,03 pg DNA đích.

Nick Translation Labeling of dsDNA for in situ probe

Phương pháp dịch nick dựa trên khả năng của DNase I để đưa các nicks phân phối ngẫu nhiên vào DNA ở nồng độ enzyme thấp với sự hiện diện của Mg2+. E. coli DNA polymerase I tổng hợp DNA bổ sung cho sợi nguyên vẹn theo hướng 5´ - 3´ bằng cách sử dụng đầu cuối 3´-OH của nick làm mồi. Hoạt tính exonucleolytic 5´ - 3´ của DNA polymerase I đồng thời loại bỏ các nucleotide theo hướng tổng hợp. Hoạt động của polymerase tuần tự thay thế các nucleotide đã loại bỏ bằng triphosphates deoxyribonucleoside có nhãn đồng vị hoặc có nhãn hapten. Ở nhiệt độ thấp (+15 °C), DNA không được dán nhãn trong phản ứng được thay thế bằng DNA mới được tổng hợp có nhãn. Fo rin ngồi các thủ tục điều hòa, chiều dài của các mảnh được dán nhãn thu được từ thủ tục này phải là khoảng 200-500 base.

Sao chép nhãn của các đầu dò RNA

Đối với một số ứng dụng, RNA gắn nhãn DIG là một đầu dò lai hiệu quả hơn so với DNA dán nhãn DIG. Ví dụ, các đầu dò RNA có nhãn DIG có thể phát hiện các mRNA hiếm gặp với số lượng nano tổng RNA. Các đầu dò RNA được dán nhãn này được tạo ra  phiên mã b yin vitr từ một mẫu DNA. Trong phương pháp phiên mã RNA, DNA được nhân bản vào vị trí nhân bản nhiều của một vector phiên mã giữa các promoter cho các RNA polymerase khác nhau (như T7, SP6 hoặc T3 RNA polymerase). Mẫu sau đó được tuyến tính hóa bằng cách phân tách vectơ tại một vị trí duy nhất (gần hạt dao). Một RNA polymerase sao chép DNA vào một bản sao RNA antisense với sự có mặt của một hỗn hợp ribonucleotide (bao gồm DIG-UTP). Trong quá trình phản ứng, DNA có thể được phiên mã nhiều lần (lên đến một trăm lần) để tạo ra một lượng lớn các bản sao RNA được dán nhãn ĐÀO đầy đủ (10-20 μg RNA từ 1 μg DNA trong một phản ứng tiêu chuẩn). DIG được kết hợp vào RNA ở khoảng 25-30 nucleotide.

Reaction Principle

Mẫu DNA cần phiên mã được nhân bản vào vị trí polylinker của một vector phiên mã thích hợp, trong đó chứa promoter cho SP6 và T3 và T7 RNA polymerase. Sau khi tuyến tính hóa tại một vị trí phù hợp, RNA được phiên mã với sự hiện diện của DIG-11-UTP. Trong các điều kiện tiêu chuẩn, khoảng 10 μg RNA có nhãn DIG chiều dài đầy đủ được phiên mã từ 1 μg khuôn mẫu.

Các mẹo sau đây rất quan trọng để ghi nhãn đầu dò RNA thành công:

RNase

RNase có mặt khắp nơi và không yêu cầu bất kỳ đồng yếu tố nào cho hoạt động. Nếu bạn muốn thành công, hãy thực hiện tất cả các biện pháp phòng ngừa có thể để ngăn ngừa nhiễm RNase. For instance:

• Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng đồ nhựa dùng một lần, đồ thủy tinh nướng lò hoặc đồ nhựa đã được khử nhiễm bằng RNase ZAP hoặc các thuốc thử tương tự.
• Chuẩn bị tất cả các dung dịch bằng nước đã được xử lý bằng diethyl-pyrocarbonate (DEPC) hoặc dimethyldicarbonate (DMDC) và hấp tiệt trùng dung dịch.
• Đeo găng tay trong suốt quá trình thực hiện.
• Hiệu quả dán nhãn phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh khiết của mẫu DNA. Mẫu phải được tinh lọc cao.
• Mẫu cuối cùng phải được tuyến tính hóa, phenol/chloroform được chiết xuất và ethanol kết tủa.

Template Sequence

• Một số vùng primer và / hoặc polylinker trong các mẫu DNA tương đồng với các phần của trình tự RNA ribosome 28s và 18s. Do đó, các đầu dò được dán nhãn có thể tạo ra các tín hiệu cụ thể, nhưng không mong muốn trong các mẫu chứa các RNA nổi bật này. Để giảm thiểu hiệu ứng này, hãy loại bỏ càng nhiều chuỗi polylinker khỏi mẫu của bạn càng tốt.
• Nếu bạn sử dụng PCR để tạo mẫu DNA, sản phẩm của phản ứng Độ tin cậy cao mở rộng chứa một số mảnh chỉ với một phần nhô ra 3´ A. Phần nhô ra này có thể tạo ra các sản phẩm bao quanh trong phản ứng dán nhãn phiên mã.

Template Length

• Chiều dài mẫu tối ưu là khoảng 1 kb
• Minimum length should be at least 200 bp

Lưu trữ của Đầu dò

• Để ổn định lâu dài, đầu dò RNA nên được phân tách và lưu trữ ở -20 °C hoặc -70 °C
• Các đầu dò RNA dán nhãn DIG ổn định trong ít nhất 1 năm ở -20 °C hoặc -70 °C trong ethanol

Probe Sensitivity

• Để nhanh chóng xác định độ nhạy của đầu dò RNA antisense dán nhãn ĐÀO, chuẩn bị  phiên mã RNA cảm giác tương ứng b yin vitr. Sau đó, sử dụng bảng điểm cảm giác tinh khiết ở các nồng độ khác nhau làm mục tiêu trên một blot phía bắc. Từ kết quả của vết mực, bạn có thể dễ dàng xác định lượng mục tiêu thấp nhất (bảng điểm cảm giác) có thể được phát hiện bằng đầu dò được dán nhãn (bản phiên âm antisense).

DIG oligonucleotide 5 End-Labeling, 3 End-Labelling, và 3 Tail Labelling

Đối với một số ứng dụng, như một sin là sự lai hóa, một oligonucleotide tổng hợp được dán nhãn ĐÀO là đầu dò lai tốt nhất. Ngoài ra t oin là các tế bào lai, các oligonucleotide dán nhãn ĐÀO có thể được sử dụng như các đầu dò lai trong nhiều ứng dụng, bao gồm các chấm / khe, sàng lọc thư viện, phát hiện các chuỗi gen lặp lại trên các blot phía Nam và phát hiện các mRNA phong phú trên các blot phía bắc.

Một số phương pháp có sẵn để ghi nhãn ĐÀO các oligonucleotide và được tóm tắt dưới đây.

Oligonucleotide 5' gắn nhãn đầu với DIG-NHS-Ester

Oligonucleotide 3' gắn nhãn đầu cuối với DIG-dUTP

Thêm đuôi 3´ DIG-dUTP và dATP (khoảng 40 - 50 dư lượng)

Hình 2. Không phóng xạ oligonucleotide đuôi và phát hiện.

Ước tính hiệu suất đầu dò theo Quy trình phát hiện trực tiếp

Để thêm đúng lượng đầu dò vào quá trình lai, trước tiên bạn phải xác định lượng đầu dò có nhãn ĐÀO được tạo ra trong phản ứng ghi NHÃN. Quy trình phát hiện trực tiếp được đưa ra ở đây so sánh lượng nhãn ĐÀO trong một loạt các chất pha loãng được chuẩn bị từ đầu dò có dán nhãn với nồng độ đã biết của axit nucleic điều khiển được dán nhãn ĐÀO.

Lưu ý: Nếu bạn dán nhãn đầu dò DNA bằng PCR, bạn không cần phải thực hiện phát hiện trực tiếp để đánh giá năng suất.

Đối với đầu dò có dán nhãn PCR, hãy sử dụng phương pháp đánh giá điện di gel.

Phát hiện trực tiếp bao gồm các bước sau:

• Chuẩn bị pha loãng nối tiếp đầu dò có dán nhãn và phát hiện chúng trên màng nylon (thời gian cần thiết: 15 phút)
• Phát hiện ĐÀO vào những điểm có phát quang hóa học; cần có thời gian (2-2,5 giờ)

Tải về và tài nguyên liên quan đến DIG

Need help? Hãy xem hướng dẫn chọn sản phẩm DIG của chúng tôi.

For more information, view the following brochures:

• Hệ thống ĐÀO
• Hệ thống ĐÀO cho phép lai Situ
• ĐÀO hệ thống để lai bộ lọc

Bạn có thể tìm thấy thông tin kỹ thuật chi tiết trong Sổ tay hướng dẫn DIG:

• ĐÀO Sổ tay hướng dẫn ứng dụng để lai bộ lọc
• DIG Application Manual for Nonradioactive in Situ hybridization, 4th edition

Tìm hiểu cách xử lý Hệ THỐNG ĐÀO trong Mẹo kỹ thuật của chúng tôi:

• ĐÀO độ nhạy và tính đặc hiệu của hệ thống
• Dán nhãn RNA bằng cách sử dụng  phiên mã in vitro

Chỉ dành cho nghiên cứu khoa học sự sống. Not for use in diagnostic procedures.