General description
MTT ist ein blassgelbes Substrat, das von lebenden Zellen gespalten wird, um ein dunkelblaues Formazan-Produkt zu erhalten. Dieser Prozess erfordert aktive Mitochondrien, und selbst frisch abgestorbene Zellen spalten keine nennenswerten Mengen an MTT. Der nachstehend beschriebene kolorimetrische Assay kann sowohl für Proliferations- als auch für Komplement-vermittelte Zytotoxizitätstests verwendet werden.
Application
Verfahren:
1) Mittels Standardmethoden einen Lymphokin-, Mitogen- oder Komplement-vermittelten Zytotoxizitätsassay in 96-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden von hoher optischer Qualität (z. B. Falcon) durchführen. Das Endvolumen des Gewebekulturmediums in jedem Well sollte 0,1 ml betragen und das Medium (z. B. RPMI oder DMEM) kann bis zu 10 % fetales Rinderserum enthalten.
2) Am Ende des Assays 0,01 ml AB-Lösung (MTT) in jeden Well geben. Zum Mischen vorsichtig an die Seite der Schale tippen.
3) Für die MTT-Spaltung bei 37 °C inkubieren. Die optimale Zeit kann je nach Assay variieren, vier Stunden sind jedoch für die meisten Zwecke geeignet. Nach Ablauf dieser Zeit liegt das in Wells mit lebenden Zellen entstandene MTT-Formazan in Form von schwarzen, fasrigen Kristallen am Boden der Wells vor.
4) 0,1 ml Isopropanol mit 0,04 N HCl in jeden Well geben. Durch wiederholtes Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette gründlich mischen. Das HCl wandelt das Phenolrot im Gewebekulturmedium in eine gelbe Färbung um, die die MTT-Formazan-Messung nicht beeinträchtigt. Das Isopropanol löst das Formazan auf, wodurch eine homogene blaue Lösung entsteht, die für die Extinktionsmessung geeignet ist.
5) Die Extinktion innerhalb von einer Stunde mit einem ELISA-Plattenleser mit einer Testwellenlänge von 570 nm und einer Referenz-Wellenlänge von 630 nm messen. Nach mehreren Stunden bei Raumtemperatur können die Serumproteine aufgrund der/des Säure/Alkohols allmählich ausgefällt werden. Durch Kühlen der Platten wird die Ausfällung beschleunigt. Wenn die Platten vor der Messung gelagert werden müssen, vor der Zugabe der/des Säure/Alkohols bei 4 °C aufbewahren, dann auf Raumtemperatur erwärmen und die/den Säure/Alkohol erst kurz vor dem Ablesen hinzufügen.
Ergebnisse:
Der MTT-Assay weist in der Regel 200 bis 50.000 Zellen einer typischen Zelllinie nach, wobei der effektive Bereich von 1.000 bis 50.000 Zellen beträgt. Diese Zahlen können bei anderen Zelltypen variieren. Zytotoxizitätsassays sollten so eingerichtet werden, dass die unlysierten Kontrollzellen ein Signal von 0,2 bis 0,4 abgeben und Proliferationsassays sollten einen ähnlichen Wert bei Plateaukonzentrationen erzielen. Dies entspricht etwa 20–50.000 Zellen pro Well bei einer typischen Zelllinie.
Die Extinktion ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen. Selbst bei Konzentrationen von 1 x 106 Zellen/ml entsteht keine signifikante Extinktion durch die tatsächlichen Zellen.
Preparation Note
Bei 2–8 °C bis zu sechs Monate haltbar. Die Mischung aus Reagenz A und Lösung B ist bei 2–8 °C bis zu zwei Wochen lang stabil.
Reagensvorbereitung:
10 ml Lösung B zu einem Fläschchen Reagenz A hinzufügen. Gut mischen, sterilfiltrieren und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 °C aufbewahren. Hinweis: Es kann die ganze Nacht dauern, bis es sich auflöst. Lösung nicht erhitzen. Wenn für die Auflösung der Kristalle unbedingt erforderlich, den pH-Wert mit 1–2 Tropfen HCl anpassen. Das AB-Gemisch ist unter diesen Bedingungen mehrere Wochen lang stabil.
Other Notes
Reagenz A: MTT, (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid), 50 mg/Fläschchen.
Lösung B: PBS, pH-Wert 7,4, 15 ml
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