Die Bedeutung der Filtration bei der Optimierung der (U)HPLC- und LC/MS-Leistung
- Filtration bei UHPLC, HPLC und LC-MS
- Partikelretention in verschiedenen Spritzenvorsatzfiltern
- Bewertung der Lebensdauer der HPLC-Säule mit und ohne Probenfiltration
- Bewertung von Membranfiltern für die Filtration der mobilen Phase
- Filtration, Verstopfen der Säule und HPLC-Analyse
- Empfohlene Produkte
- Literatur
Millex®-Spritzenvorsatzfilter für die HPLC-Probenfiltration
Millipore®-Membranfilter und -Filterhalter für die Filtration von mobilen Phasen/Lösungsmitteln
Es ist allgemein bekannt, dass die richtige Probenvorbereitung entscheidend ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Allerdings wird der Probenvorbereitungsschritt der Filtration vor (U)HPLC- und LC/MS-Analysen manchmal ausgelassen. Dies kann unerwünschte Folgen haben, da die in den Proben und mobilen Phasen verbleibenden Partikel die Leistung der Säulen und Geräte beeinträchtigen können. Wir haben Millex®-Spritzenvorsatzfilter im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Partikel zurückzuhalten (Retention) untersucht. Die Ergebnisse verglichen wir mit denen anderer Spritzenvorsatzfilter. Anschließend haben wir die Effizienz der Partikelretention (d. h. die prozentuale Retention) mit der Säulenlebensdauer korreliert. Dazu haben wir sowohl gefilterte als auch ungefilterte Proben in ein UHPLC-System injiziert und den Gegendruck über bis zu 500 Injektionen gemessen, bzw., bis ein festgelegtes Druckniveau überschritten wurde. Außerdem haben wir die Auswirkungen der Filtration der mobilen Phase auf den Säulengegendruck untersucht. Die vorliegenden Daten zeigen, wie wichtig die Filtration bei der Optimierung der Lebensdauer von HPLC-Säulen ist.
Filtration bei UHPLC, HPLC und LC-MS
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC), Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) und Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry, LC/MS) sind gängige Analysemethoden in der Arzneimittelentwicklung und pharmazeutischen Qualitätssicherung, in der akademischen und staatlichen Forschung, in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie sowie in klinischen Prüfungen und der Umweltanalytik. Eine der einfachsten und kostengünstigsten Verfahren zur Probenvorbereitung ist die Filtration, bei der Partikel aus der Probe entfernt werden.1 Ungelöste Partikel in einer Probe können die HPLC-Säule selbst bei niedrigen Konzentrationen verstopfen, was zu einem hohen Gegendruck im Gerät, einer reduzierten Lebensdauer der Säule und zu schlechter Datenqualität führt.2,3 Durch das Herausfiltern dieser Partikel aus den Proben können diese Probleme vermieden und gleichzeitig bessere chromatographische Daten bereitgestellt werden.4
Die Filtration ist auch wichtig bei der Vorbereitung mobiler Phasen für (U)HPLC und LC/MS.5,6,7 Handelsübliche Lösungsmittel für HPLC, UHPLC, LC/MS und MS sind bereits vorgefiltert. Eine zusätzliche Filtration ist nicht erforderlich, wenn diese Lösungsmittel direkt aus der Flasche als mobile Phase verwendet werden. Es gibt jedoch viele Methoden, bei denen Puffer und/oder Gemische für die mobile Phase verwendet werden müssen, und diese erfordern die Zugabe von Salzen wie Phosphaten oder Acetaten.8 In solchen Fällen wird empfohlen, den Puffer vor der Verwendung zu filtrieren9 und immer frisch zu verwenden.8
Wir haben die Retentionseffizienz verschiedener Spritzenvorsatzfilter untersucht. Außerdem haben wir die Lebensdauer von Säulen mit und ohne Probenfiltration verglichen.
Partikelretention in verschiedenen Spritzenvorsatzfiltern
Die Retention ist ein Indikator für den Prozentsatz der Partikel, die während der Filtration erfolgreich aus der Probe entfernt werden bzw. den Filter passieren und in das Gerät gelangen. Wir haben die Partikelretention in Spritzenvorsatzfiltern von vier Herstellern bewertet. Die Spritzenvorsatzfilter bestanden entweder aus hydrophilem Polytetrafluorethylen (PTFE) oder aus regenerierter Cellulose (RC). Bead-Lösungen in Wasser mit 0,05 % Volumenanteil wurden gefiltert. Anschließend wurde die Retention von Beads mit einem Durchmesser von 0,5 μm in Spritzenvorsatzfiltern mit einer Porengröße von 0,45 μm und von Beads mit einem Durchmesser von 0,24 μm in Spritzenvorsatzfiltern mit einer Porengröße von 0,2 μm gemessen. Die Bead-Lösung wurde durch n = 4 Spritzenvorsatzfilter pro Charge geleitet, und in den meisten Fällen wurden mehrere Chargen getestet. Nach dem Filtern von 3 ml Bead-Lösung wurde das Filtrat entnommen, per Fluoreszenzdetektion oder spektrophotometrisch charakterisiert und mit einer 6-Punkt-Standardkurve verglichen.
Tabelle 1 zeigt die Retentionseffizienz der vier getesteten 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter. Die Retentionseffizienz variierte von einem Membranfiltermaterial zum anderen, wobei RC die niedrigste Retention (48,2 +/-4,3 %) zeigte. PTFE-Spritzenvorsatzfilter wiesen hingegen eine Retention der Polystyrol-Beads von ca. 98–100 % auf.
Hersteller (HERST.) | Material | Chargennummern | % Retention | |
|---|---|---|---|---|
Einzeln (n = 4 Einheiten) | Durchschnitt (alle Chargen) | |||
Millex®-Spritzenvorsatzfilter | PTFE (hydrophil) | 1a | 96,6 ± 0,10 | 98,3 ± 1,8 |
1b | 100 ± 0,10 | |||
HERST. 2 | PTFE (hydrophil) | 2a | 100 ± 0,10 | 100 ± 0,10 |
2b | 100 ± 0,10 | |||
HERST. 3 | PTFE (hydrophil) | 3a | 100 ± 0,10 | 100 ± 0,10 |
HERST. 4 | Regenerierte Cellulose (RC) | 4a | 52,6 ± 3,6 | 48,2 ± 4,3 |
4b | 45,1 ± 2,8 | |||
4c | 46,8 ± 1,8 | |||
In der HPLC ist die Filtration durch eine 0,45-µm-Filtermembran ausreichend, es sei denn, das Packungsmaterial der Säule hat eine kleine Partikelgröße (z. B. Partikel unter 2 µm bzw. bei UHPLC). In diesem Fall ist ein 0,2-μm-Filter erforderlich.5,10 UHPLC-Säulen sind anfälliger für Verstopfungen aufgrund der feineren Porosität der Einlassfritten, der engeren interstitiellen Räume und des kleineren Röhrendurchmessers. Daher wurde auch die Retention von Beads mit einem Durchmesser von 0,24 μm in Spritzenvorsatzfiltern mit einer Porengröße von 0,2 μm bewertet (Tabelle 2). Die Retentionseffizienz des RC-Filters beträgt weniger als 20 %. Dies deutet darauf hin, dass mehr als 80 % der Filterpartikel die Membran passieren. Die drei hydrophilen PTFE-Spritzenvorsatzfilter zeigten unterschiedliche Retentionseffizienz, wobei die Filter von HERST. Nr. 2 insgesamt die niedrigsten Werte und außerdem Inkonsistenzen zwischen den einzelnen Chargen aufwiesen.
Hersteller (HERST.) | Material | Chargennummern | % Retention | |
|---|---|---|---|---|
Einzeln (n = 4 Einheiten) | Durchschnitt (alle Chargen) | |||
Millex®-Spritzenvorsatzfilter | PTFE (hydrophil) | 1a | 96,7 ± 0,70 | 96,0 ± 1,6 |
1b | 95,4 ± 1,9 | |||
HERST. 2 | PTFE (hydrophil) | 2a | 78,8 ± 17 | 49,8 ± 32 |
2b | 20,9 ± 0,90 | |||
HERST. 3 | PTFE (hydrophil) | 3a | 98,5 ± 1,5 | 98,5 ± 1,5 |
HERST. 4 | Regenerierte Cellulose (RC) | 4a | 14,4 ± 1,1 | 15,8 ± 2,2 |
4b | 14,2 ± 0,70 | |||
4c | 18,7 ± 0,60 | |||
Die Daten zur Retentionseffizienz legen nahe, dass nicht alle Spritzenvorsatzfilter derselben Porengröße für die Probenfiltration gleich gut funktionieren.
Bewertung der Lebensdauer der HPLC-Säule mit und ohne Probenfiltration
Die Säulenlebensdauer wurde mit wiederholten Injektionen von 10 μl entweder gefilterter oder ungefilterter Bead-Lösung mit 0,05 % Volumenanteil bewertet. Die Filtration erfolgte in 30 HPLC-zertifizierte Fläschchen mit n = 30 Produkten der zuvor getesteten 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter. In den meisten Fällen wurden mehrere Chargen getestet. Nach jeder Injektion wurde die Änderung des Gegendrucks gemessen. Es wurden bis zu 500 Säuleninjektionen durchgeführt, bzw. so viele, bis der zuvor festgelegte Druck von 8000 psi erreicht wurde. Dieses Drucklimit wurde festgelegt, um sicherzustellen, dass das System keinen unsicheren Druck erreichte. Die HPLC-Bedingungen sind in
Tabelle 3 aufgeführt.
Säule | Ascentis® Express C18, 2,7 μm Porengröße, 50 × 2,1 mm Innendurchmesser |
Mobile Phase | 35:65 Acetonitril: Wasser, filtriert durch hydrophile PTFE-Membran (0,2 μm Porengröße) mit einer |
Fließrate | 0,75 ml/min |
Säulentemperatur | 35,0 °C |
Injektionsvolumen | 10 µl |
Gegendruck-Höchstwert | 8000 psi |
Jeder 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter wurde mit einer neuen Säule getestet. Schläuche, Injektoren, Dichtungen und das HPLC-System wurden nach jedem Test gründlich gereinigt, sowohl mit als auch ohne installierte Säule, um sicherzustellen, dass alle Partikel aus dem vorherigen Durchlauf aus dem System entfernt wurden. Nach der Installation einer neuen Säule wurde das System 10 Minuten lang mit 70:30 Acetonitril:Wasser (1 ml/min) gespült und dann mit der mobilen Phase (Tabelle 3) äquilibriert, bis ein stabiler Ausgangswert für den Gegendruck erreicht wurde (ca. 10–15 Minuten).
0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter wurden verwendet, um Lösungen von Polystyrol-Beads (0,05 % Volumenanteil) mit 0,5 μm Durchmesser in HPLC-zertifizierte Fläschchen zu filtern. Dann wurden die Filtrate in das UHPLC-Gerät injiziert. Es wurden wiederholte Injektionen von jeweils nur 10 μl durchgeführt, bis der Gegendruck-Höchstwert (8000 psi) erreicht oder überschritten wurde. Auch ungefilterte Proben wurden direkt injiziert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1. Einfluss der Probenfiltration auf den UHPLC-Systemgegendruck Der durchschnittliche Gegendruck (psi) wurde gegen die Anzahl der Injektionen gefilterter und ungefilterter Lösungen von Beads (0,05 % Volumenanteil) mit 0,5 μm Durchmesser aufgetragen. Die gefilterten Proben stammen aus drei hydrophilen 0,45-μm-PTFE-Spritzenvorsatzfiltern und einem RC-Spritzenvorsatzfilter von jeweils einem anderen Hersteller (HERST.). Ungefilterte Lösungen wurden ebenfalls injiziert.
Es wurden nur 36 Injektionen der ungefilterten Probe durchgeführt, bevor der Gegendruck den Grenzwert von 8000 psi überschritt. Der Grenzwert wurde überschritten, nachdem 71 Injektionen über den RC-Spritzenvorsatzfilter durchgeführt worden waren. Dies deutet darauf hin, dass die Partikel die Säule schnell verstopften und dass selbst eine Injektion von 10 μl die Lebensdauer der Säule erheblich verkürzte. Das korreliert mit den Daten zur Retentionseffizienz, bei denen der RC-Spritzenvorsatzfilter nur 48 % der Partikel in einer Lösung zurückhielt. Das heißt, etwa 50 % der zu filtrierenden Partikel wurden stattdessen in das UHPLC-System injiziert. Alle Proben, die PTFE-Filter passierten, konnten über 500-mal injiziert werden, ohne dass nennenswerte Veränderungen des Säulengegendrucks auftraten. Dies lag daran, dass fast 100 % der Partikel von diesen Spritzenvorsatzfiltern zurückgehalten wurden, wie zuvor beschrieben.
Bewertung von Membranfiltern für die Filtration der mobilen Phase
Die Bedeutung der Filtration in (U)HPLC- und LC/MS-Anwendungen beschränkt sich nicht allein auf das Filtern von Proben. Das Vorhandensein von Partikeln in der mobilen Phase kann darüber hinaus zu ernsthaften Problemen in der (U)HPLC führen. Eine frühere Studie von Joshi et al. zeigte, dass die unvollständige Entfernung von Partikeln aus der mobilen Phase auch zu einem Anstieg des UHPLC-Säulengegendrucks führt (Abbildung 2).7,11 In dieser Studie wurde die mobile Phase aus 50:50 Acetonitril:Wasser durch Membranfilter aus Polypropylen (PP) und hydrophiles PTFE (Porengrößen 0,2 μm und 0,45 μm) gefiltert. Die mobile Phase wurde mit einer gleichmäßigen Flussrate von 0,25 ml/min in eine UHPLC-Säule geleitet, und der Gegendruck wurde über 600 Minuten lang überwacht.
Abbildung 2. Änderung des Gegendrucks (psi) des UHPLC-Systems im Vergleich zur Zeit (min) während des Fließens der mobilen Phase bei 0,25 ml/min über 600 Minuten. Die mobile Phase wurde durch Membranfilter aus Polypropylen (PP) und PTFE mit Porengrößen von 0,2 μm und 0,45 μm gefiltert. (Nachdruck mit Genehmigung, siehe Literaturhinweis 11.)
Beim Filtern der mobilen Phase durch die vier getesteten Membranfilter stieg der Gegendruck bei der 0,45-μm- und 0,2-μm-Polypropylenmembran am stärksten an. Neben den bereits beschriebenen Problemen mit der Säule können Partikel in der mobilen Phase zu einem vorzeitigen Verschleiss von Gerätekomponenten wie Pumpenrückschlagventilen, Kolben und Dichtungen führen.12 Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Injektion der mobilen Phasen während eines Experiments ein signifikant höheres Volumen mit der Säule in Kontakt kommt als bei der Probeninjektion. Vorhandene Partikel könnten daher die beobachteten Auswirkungen auf die Säulenverstopfung beschleunigen und verstärken.
Einflussfaktoren auf die Membranfilterretention
Die Filtration von Proben und mobilen Phasen erfolgte mit Membranfiltern, die als mikroporöse Barrieren dienten. Die Poren in den Membranen ermöglichen einen physikalischen Größenausschluss von Partikeln aus einer Massenmatrix. Es kann jedoch vorkommen, dass Partikel, die größer als die erwartete oder angegebene Porengröße der Membran sind, die Membran passieren, während kleinere Partikel zurückgehalten werden, was zu unterschiedlichen Retentionsergebnissen führt.
Die verschiedenen Eigenschaften der Poren eines Mikrofilters – wie Form, Größe, Frequenz, Verteilung, und Symmetrie – definieren, wie der Filter bestimmte Partikelgrößen zurückhält. In dieser Studie zur Filterretention zeigten PTFE-Filter verschiedener Hersteller bei gleicher Porengröße (insbesondere bei 0,2 µm) unterschiedliche Retentionsergebnisse bezüglich der gleichen Partikelgröße. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass Porenradienverteilung und Porosität je nach Hersteller höher oder niedriger sind. Mit anderen Worten: Das Spektrum der einzelnen Porengrößen von der kleinsten bis zur größten kann sehr unterschiedlich ausfallen. Der Prozess zum Gießen von Membranen – selbst aus demselben Material – variiert von Hersteller zu Hersteller. Die daraus resultierende Porenform kann daher je nach Material und mitunter von Charge zu Charge stark variieren – insbesondere, wenn der Prozess nicht sorgfältig kontrolliert wird. Darüber hinaus verwenden Hersteller verschiedene Methoden zur Messung von Porosität und Porengröße, die auf Tests wie Luftdurchlässigkeit, Lufteintrittsdruck, Reinwasserdurchlässigkeit, BET-Analyse, Porometrie oder Retention basieren.
Wenn Spritzenvorsatzfilter für die (U)HPLC- und LC/MS-Probenvorbereitung verwendet werden, ist die Partikelretention nicht das einzige Merkmal, das berücksichtigt werden muss. Andere Aspekte der Membran, wie z. B. chemische Zusammensetzung und chemische Verträglichkeit, Filterdurchmesser, Dicke und Gehäuse, sowie die chemischen Eigenschaften der Filterlösung und des zu filternden Analyten, können ebenfalls einen erheblichen Einfluss auf die Gesamtleistung des Membranfilters haben.13
Filtration, Verstopfen der Säule und HPLC-Analyse
Das Filtern der Proben vor der (U)HPLC-Analyse wird als bewährte Praxis angesehen.5 Es verhindert ein vorzeitiges Verstopfen der Säule und einen erhöhten Gegendruck des Geräts, wodurch unnötiges Herunterfahren des Systems und Verlust der Laborproduktivität vermieden werden und gleichzeitig die Datenqualität erhalten bleibt. Die Ergebnisse der Studien zur Retentionseffizienz legen nahe, dass Spritzenvorsatzfilter die Säulen in unterschiedlichem Maße schützen, wenn sie zur Filtration partikelhaltiger Proben vor der (U)HPLC-Injektion eingesetzt werden.
Spritzenvorsatzfilter der gleichen Porengröße können unterschiedliche Partikelretention-Wirkungsgrade aufweisen. Es ist wichtig, einen Filter auszuwählen, der Partikel effizient zurückhält, um die (U)HPLC-Säule vor vorzeitigem Verstopfen zu schützen. Mobile Phasen müssen ebenfalls gefiltert werden, da Partikel nicht nur eine Verstopfung der Säule verursachen, sondern auch dazu führen können, dass Gerätekomponenten schneller verschleißen. Um die Lebensdauer der HPLC-Säule zu verlängern und konsistente, qualitativ hochwertige Daten zu erzeugen, sollte daher stets die Filtration sowohl der Probe als auch der mobilen Phase in Betracht gezogen werden.
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