Průvodce řešením problémů s HPLC

Jak identifikovat, izolovat a odstranit nejčastější problémy HPLC

Přestože se vývoj metod HPLC díky pokroku v technologii kolon a instrumentace zdokonalil, problémy se stále objevují. V každé příručce pro řešení problémů se jako nejdůležitější kritérium kolony uvádí reprodukovatelnost selektivity; proto většina výrobců udělala maximum pro validaci svých výrobních postupů. Nicméně malé rozdíly, které existují v chemickém složení povrchu, se obvykle objevují při analýze velmi citlivých vzorků. Vyloučit je všechny během výroby je prakticky nemožné vzhledem k proměnným: surovým materiálům a činidlům, chemii povrchové vazby, samotnému procesu balení i plniči kolony, laboratornímu vybavení a prostředí. Kromě toho má povrchová chemie tendenci se během používání kolony měnit. Vázaná fáze se rozpadá, oxid křemičitý se rozpouští jako křemičitan a rozšířený povrch má tendenci adsorbovat nečistoty ze vzorku a mobilní fáze. Proto je třeba tyto drobné rozdíly kompenzovat odolností metody.

V této příručce vám nabízíme systematický způsob izolace, identifikace a opravy mnoha typických problémů HPLC.

Nejdůležitější je mít na paměti čtyři jednoduchá hlavní pravidla:

1. Pravidlo "jedna": nikdy neměňte více než jednu věc najednou. Provedení několika změn ztěžuje spekulaci, z jakého efektu změna pochází.
2. Pravidlo "dvě": jakýkoli efekt nebo problém musí být opakovatelný, aby bylo možné jej vyřešit. Pokud nemůžete chromatografický problém zopakovat, pak je velmi obtížné zjistit, co ho způsobuje a jak ho odstranit.
3. "Vraťte to zpět": Často lze totiž problémům předejít pravidelnou rutinní údržbou (např. plánovanou výměnou opotřebovaných dílů) a vedením dobrých záznamů o tom, co a kdy bylo provedeno.
4. Vedení přesných záznamů: Většina problémů nevzniká ze dne na den, ale vyvíjí se postupně. Přesné vedení záznamů je pro odhalení a vyřešení mnoha problémů zásadní.
   Vyhodnocujte každý sloupek, který obdržíte, hned jak ho obdržíte, a poté v pravidelných intervalech. Vedením písemných záznamů o účinnosti kolony, použitých mobilních fázích, proudu lampy, výkonu čerpadla atd. můžete sledovat výkonnost systému.
   Záznamy také pomáhají předcházet chybám, jako je zavedení vody do křemíkové kolony nebo vysrážení pufru v systému přidáním příliš velkého množství organického rozpouštědla. Mnoho analytiků své systémy HPLC nějakým způsobem upravuje. Spolehlivé záznamy jsou nejlepším způsobem, jak zajistit, aby úprava nezpůsobila problémy. Problémy týkající se čerpadel, detektorů, automatických vzorkovačů a datových systémů naleznete v příručce pro řešení problémů s přístrojem nebo se obraťte na servisního technika přístroje.

Důležité segmenty systému HPLC jsou stejné, ať už používáte modulární systém nebo sofistikovanější jednotku. Problémy ovlivňující celkový výkon systému mohou vzniknout v každé součásti. Zde jsou popsány některé běžné problémy a problémy, které se mohou objevit, a způsoby jejich řešení. Chromatografové musí často identifikovat a odstraňovat problémy, které lze rozdělit do různých kategorií. Řešení těchto problémů jsou uvedena ve snadno použitelných tabulkách.

IZOLACE PROBLÉMŮ S HPLC

V systému HPLC mohou problémy vznikat z mnoha zdrojů. Nejprve definujte problém a poté izolujte jeho zdroj.

Určete, která složka (které složky) může (mohou) způsobovat potíže. Proces eliminace vám obvykle umožní určit konkrétní příčinu a problém odstranit.

Chcete převést svou metodu HPLC na metodu UHPLC? Získejte pomoc při výpočtu úspory času běhu a spotřeby rozpouštědel při převodu metod pomocí našeho Kalkulačky převodu metod HPLC.

Figure 1. Components of an HPLC System

JAK PŘEDCHÁZET PROBLÉMŮM S MOBILNÍ FÁZÍ

Nejdůležitější součástí chromatografické sestavy je kolona. Ale i když zajišťuje retenci, výsledná separace také silně závisí na mobilní fázi (MP). Různé účinky, které mobilní fáze nabízí, ovlivňují retenci a diferenciální migraci (selektivitu) rozpuštěných látek přes kolonu. Nízkou citlivost a stoupající základní linie, šum nebo hroty na chromatogramu lze často přičíst kontaminaci mobilní fáze. Nečistoty v mobilní fázi jsou obzvláště problematické při gradientové eluci, protože k akumulaci i malých nečistot může docházet v průběhu času, kdy "čekají" na zvýšený eluční výkon mobilní fáze, aby se eluovaly. Může dojít ke zvýšení základní linie a s rostoucí hladinou kontaminované složky se mohou objevit falešné píky.

Často problémy s chromatografickou separací souvisejí s nesprávně/nedůsledně připravenou mobilní fází. Proto lze pozorovat příklon k používání jednodušších mobilních fází z praktických důvodů větší robustnosti metody, snadnějšího přenosu metody a snadného použití (např. v klinické diagnostice nebo při řízení procesů).

Přísada rozpouštědla/pohyblivé fáze Čistota

Většina z vás zná pravidlo: "odpadky dovnitř, odpadky ven." Toto přísloví platí zejména při výběru správné čistoty složek mobilní fáze. Například pro gradientové separace je naprostou nutností používat rozpouštědla a činidla gradientové kvality, abyste získali přesnou, reprodukovatelnou a čistou základní linii (bez duchů píků) a citlivou chromatografickou separaci. Použití správné a vhodné třídy rozpouštědel na základě metody použití (např, hypergrade pro LC-MS, více informací najdete na SigmaAldrich.com/solvents)  rovněž minimalizuje pravděpodobnost kontaminace a prodlužuje životnost chromatografické kolony.

Voda je nejčastějším zdrojem kontaminace při analýzách na obrácené fázi. Měli byste používat pouze vodu vysoké čistoty, a to v kvalitě HPLC nebo LC-MS v závislosti na prováděných analýzách. Může to být komerčně dostupná balená voda nebo ultračistá voda z vhodného systému čištění vody Mili-Q^®. Ultračisté systémy Milli-Q^® jsou vynikající volbou pro chromatografy, protože nabízejí jedinečnou kombinaci optimalizovaného čištění vody, včetně koncového filtru obsahujícího oxid křemičitý C18 s reverzní fází, a monitorovacích technologií. výběr optimálního systému ultračisté vody (typ 1) pro vaši laboratoř bude záviset na několika parametrech, jako jsou: dostupná kvalita napájecí vody, denní objemové potřeby, požadavky na monitorování, očekávané úrovně certifikace a další specifické požadavky, které můžete mít. Pokud používáte destilovanou nebo deionizovanou (DI) vodu, mějte na paměti, že běžné deionizátory mohou do vody vnášet organické kontaminanty, které ohrožují vaše analýzy.

Používejte pouze rozpouštědla HPLC (nebo LC-MS) třídy, soli, činidla pro iontové páry a modifikátory zásad a kyselin. Čištění rozpouštědel nižší kvality je časově náročné a často v nich zůstávají stopové množství kontaminantů. Tyto stopové kontaminanty mohou způsobit problémy při použití vysoce citlivého ultrafialového, fluorescenčního nebo hmotnostně spektrometrického (MS) detektoru. Pokud jako konečný detektor používáte hmotnostní spektrometrii, používejte rozpouštědla a aditiva třídy MS, abyste zajistili nejvyšší celkovou citlivost metody a zabránili kontaminaci přístroje MS.

Protože mnoho vodných pufrů podporuje růst bakterií nebo řas, měli byste tyto roztoky připravit čerstvé a před použitím je filtrovat pomocí 0,22 μm membránového filtru, pokud provádíte analýzu UHPLC, nebo 0,45 μm filtru pro standardní analýzu HPLC. Filtrací se také odstraní částice, které by mohly způsobit hluk na základní linii nebo ucpat kolonu. Zabraňte růstu mikroorganismů přidáním asi 100 ppm  azidu sodného do vodných pufrů. Alternativně lze tyto pufry také smíchat s 20 % nebo více organického rozpouštědla, jako je ethanol, acetonitril, methanol nebo isopropanol.

V případech vyžadujících přidání jakéhokoli činidla, jako je pufr, je třeba zajistit, aby činidlo splňovalo požadovanou kvalitu a nemělo prošlou dobu použitelnosti. Degradační látky z prošlých aditiv vedou k duchovitým píkům v chromatogramech vzorků. Některá aditiva degradují rychleji v závislosti na své povaze (například 20 mM, pH 7 fosfátový pufr). Nesprávná/neopatrná manipulace (například zbytky rozpouštědla vrácené zpět do lahvičky, lahvička ponechaná na laboratorním stole bez uzavřeného uzávěru, ztracené špičky pipet plovoucí uvnitř lahvičky a podobně) s těmito činidly rychle kazí chemikálie.

Míchání mobilních fází

U izokratických separací s předem smíchanými mobilními fázemi je třeba při jejich přípravě zohlednit objemové kontrakce rozpouštědel v běžně používaných směsích (voda/acetonitril, metanol nebo tetrahydrofuran). Jediným správným způsobem přípravy takových směsí mobilních fází je odděleně odebrat přesně odměřené objemy složek a smíchat je. Například pro získání 70% organické mobilní fáze je třeba odděleně přesně odměřit 300 ml vody a 700 ml organického rozpouštědla a poté je v baňce smíchat dohromady. Pokud se však přesně odměří pouze voda a poté se přidá organické rozpouštědlo, aby se vytvořil požadovaný konečný objem, bude v důsledku smršťování směsi rozpouštědel výsledná síla rozpouštědla o něco vyšší (nebo slabší v případě, že se nejprve přidalo organické rozpouštědlo a voda se přidala později). Při předběžném míchání MP je třeba věnovat pozornost toxickým výparům rozpouštědel, které by mohly být uvolňovány, a to pod digestoří.

V současné době jsou gradienty obecně správně formulovány pomocí gradientových čerpadel; při porovnávání přístrojů s nízkotlakými a vysokotlakými gradientovými systémy však mohou být pozorovány určité drobné rozdíly v retenčním chování v důsledku jejich mechanismů míchání. Botické přístupy mají své výhody i nevýhody - přístroje s nízkotlakým gradientem jsou jednodušší, a proto se snadněji udržují, ale hlavní výhodou je konstantní průtok nezávislý na gradientu. Průtok získaný z vysokotlakých gradientových systémů tvorby je o několik procent nižší, jak je nastaveno, kvůli kontrakci rozpouštědla po smíchání. Tento jev je třeba mít na paměti, pokud někdo přenáší zavedenou metodu z jednoho typu přístroje na druhý.

V chromatografii s obrácenou fází je většinou lepší pracovat s předem smíchanými mobilními fázemi, jako je 5 % acetonitril ve vodě a/nebo 5 % voda v acetonitrilu. Důvodem takové preference je zvýšení účinnosti odplynění, zamezení zahřívání směsi (např. methanol ve vodě) nebo ochlazování (např. acetonitril ve vodě) při míchání a také zlepšení účinnosti míchání tím, že obě mobilní fáze mají podobnější viskozitu a povrchové napětí. Omezení těchto předem smíchaných rozpouštědel spočívají v tom, že síla rozpouštědla mobilní fáze B nemůže být 100% a že se jedná o další krok při přípravě mobilní fáze - což je další potenciální zdroj chyb. Obvykle se doporučuje používat rozpouštědla mobilní fáze přímo z jejich dodávkových obalů, aby se zabránilo další možnosti kontaminace.

Při analýze vzorků obsahujících ionizovatelné sloučeniny může být pufr jednou z nejdůležitějších proměnných, které řídí retenci v HPLC separaci. Hodnota pH mobilní fáze určuje přítomnost ionizovatelných sloučenin (analytů a matrice) buď v ionizovaném, nebo neionizovaném stavu. Ionizované druhy v chromatografii s reverzní fází (RP) se z kolony eluují vždy dříve než neionizované druhy. Změnou pH lze také zvýšit selektivitu pro účinnou separaci těsně eluujících nebo překrývajících se píků. Proměnlivost pH v jednotlivých sériích vede k nekonzistenci separace. Pufry zabraňují kolísání pH. Proto je správná volba pufru z hlediska pufrujících druhů, iontové síly a pH nejkritičtějším krokem při vývoji metody HPLC, pokud se analyzují ionizovatelné látky.

Tipy pro výběr LC pufru

Výběr vyrovnávací paměti. Výběr vhodného pufru pro danou aplikaci se řídí charakteristikami pufru, jako je pKa, rozsah pH a UV cut-off. Zpravidla by se měly používat pufry pro pH v rozmezí +/- 1 jednotky jejich hodnoty pKa. V tomto rozmezí pufry odolávají jakýmkoli záměrným pokusům o změnu pH. Kapacita pufru je maximální, když se pH pufru rovná jeho pKa. Je třeba také zvážit mezní hodnotu UV záření, protože vlnová délka detekce by neměla interferovat s absorbancí pufru (významná absorbance: kyselina trifluoroctová < 220 nm; kyselina mravenčí, kyselina octová <240 nm). Pro dosažení nejlepších výsledků s ionizovatelným analytem, který vás zajímá, použijte pufr s pH vzdáleným od pKa nejméně o 2 jednotky. Pokud je pH mobilní fáze příliš blízko pKa analytu, mohou být pozorovány rozdělené píky nebo ramena v důsledku přítomnosti obou druhů ve vzorku. Pro několik ionizovatelných analytů, které jsou předmětem zájmu, je vhodnější zvolit takovou hodnotu pH, při níž se všechny analyty vyskytují ve stejné formě, buď ionizované, nebo neionizované.

• Měření pH pufru. pH pufru je pH vodné části před přidáním organické mobilní fáze. Přídavek organického rozpouštědla obvykle posune pH buď nahoru, nebo dolů (posun pH by měl být u stejného pufru konzistentní). Není tak důležité znát přesnou hodnotu pH pufru v organickém prostředí, ale je důležité mít konzistentní hodnotu pH (protože pKa vašich analytů se stanovuje také ve vodné fázi a jednotlivé posuny pKa také neznáme).
• Chemická čistota. Kvalita/čistota přísad mobilní fáze (pufrů, solí, kyselin a zásad) spolu s organickými rozpouštědly používanými v experimentu HPLC musí být přizpůsobena citlivosti detektoru a elučnímu protokolu.
• Chemická kompatibilita. Složení pufru spolu s pH mobilní fáze musí být zvoleno v souladu s materiálem pouzdra kolony a povahou stacionární fáze, aby se zabránilo korozi obou těchto materiálů.
• Kompatibilita s MS. Zavádění minerálních solí do systému hmotnostní spektrometrie se nedoporučuje. Příklady vhodných těkavých pufrů jsou octan amonný, mravenčan amonný a citronan amonný. pH modifikátory, jako je kyselina mravenčí a kyselina octová, by měly být použity k regulaci pH a napomáhají ionizaci pro LC-MS.
• Rozpustnost pufrů. V ideálním případě by měl být pufr zcela rozpustný ve vodě (metody RP) a neměl by se během analýzy srážet při smíchání se zvoleným organickým rozpouštědlem. Koncentrace pufru musí být proto pečlivě zvolena, aby nedocházelo k vysrážení při vyšších koncentracích v organickém rozpouštědle. Zanedbání tohoto požadavku může způsobit provozní problémy s čerpadly a vyvolat zablokování kolony HPLC nebo zvýšení protitlaku.
• Síla pufru. Eluent vykazující slabou interakci se stacionární fází je schopen eluovat z kolony pouze slabě vázané analyty, zatímco silná interakce způsobuje eluci silně vázaných molekul vzorku. Eluční nebo rozpouštěcí síla různých rozpouštědel závisí na typu použité stacionární fáze. Po eluční síle hraje důležitou roli viskozita pufru z hlediska jeho vhodnosti pro použití v HPLC analýzách.
• Koncentrace pufru. V ideálním případě by měla být zvolena nejnižší koncentrace, která poskytuje reprodukovatelné výsledky. Vyšší koncentrace vedou k rychlejší eluci polárních molekul. Obecně by koncentrace pufru neměla být nižší než 5 mM. Pod touto koncentrací nemusí fungovat jako pufr (závisí na koncentraci analytu a pufrovací schopnosti). Zvyšování koncentrace pufru může zvýšit viskozitu, což zase může zvýšit protitlak kolony. Běžně by se koncentrace měla udržovat v rozmezí 5 až 100 mM. Koncentrace pufrů s minerálními solemi vyšší než 100 mM rychleji opotřebovává pohyblivé části čerpadla, proto se doporučuje instalovat zpětné těsnění promývačky.

Můžeme konstatovat, že pufry hrají klíčovou roli při většině HPLC separací. Vývoj metod často vyžaduje pečlivý výběr pufrů a odpovídající péči při jejich přípravě. Obecná pravidla, která je třeba mít na paměti, jsou tato - roztoky pufrů musí být homogenní, čiré a bez jakýchkoli částic. V případě skladování mějte na paměti, že pufry mají omezenou životnost, proto jejich přípravu zvažte denně.

Odplynění mobilní fáze

Odplynění mobilní fáze v chromatografii má zásadní význam pro dosažení přesných a reprodukovatelných výsledků. Odplynění mobilní fáze zahrnuje odstranění rozpuštěných plynů, zejména kyslíku a oxidu uhličitého, které mohou nepříznivě ovlivnit výkon chromatografického systému. Přítomnost těchto plynů může vést k nestabilitě základní linie, šumu detektoru a změnám retenčních časů, což může ohrozit spolehlivost chromatografických dat. Odplynění navíc pomáhá zabránit tvorbě bublin plynu v čerpadle a chromatografické koloně, což může ovlivnit přesnost dodávky eluentu a způsobit kolísání průtoků. Důsledné a účinné odplyňování je zvláště důležité pro systémy vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC), kde jsou přesné a stabilní podmínky nezbytné pro dosažení přesných tvarů píků a rozlišení. Celkově je odplyňování mobilní fáze nezbytným krokem v chromatografické metodice, který zajišťuje reprodukovatelnost a přesnost analytických výsledků a udržuje robustnost chromatografického systému. Abyste zabránili vzniku bublin v systému, důkladně odplyňte mobilní fázi. Obecně je první a nejlepší volbou in-line odplyňovač (levný a účinný), ale pokud mobilní fáze neobsahuje žádné těkavé složky, může být alternativou sonikace (snadné, ale neúplné odplynění) nebo rozprašování héliem (velmi účinné, ale drahé). Nízká teplota zvyšuje rozpustnost plynů, proto je třeba rozpouštědla uložená v chladničce stabilizovat na pokojovou teplotu nebo dodatečně odplynit jinými metodami (například sonikací) před jejich zavedením do systému spoléhajícího se na odplynění ve vakuu online.

IZOLACE PROBLÉMŮ S ČERPADLY

Čerpadlo musí dodávat do kolony konstantní průtok rozpouštědla v širokém rozsahu podmínek. Čerpadla HPLC obsahují jedno- nebo dvoupístové, stříkačkové nebo membránové konstrukce. Tato čerpadla mohou být nízkotlaké nebo vysokotlaké systémy pro tvorbu gradientu (obrázky 2 & 3). Používají se oba přístupy; vysokotlaké gradientové čerpadlo však může dodávat průtok až o 4 % nižší, než je nastavená hodnota, z důvodu kontrakce rozpouštědla po smíchání, což může mít vliv na přesnost chromatografických separací. Na druhé straně nízkotlaké gradientotvorné čerpadlo zpožďuje příchod gradientu na kolonu, což přináší problémy při udržování přesných elučních podmínek, které jsou zvláště výrazné při použití vysokorychlostních strmých gradientů. Tyto provozní vlastnosti je třeba pečlivě zvážit při výběru systému čerpadla na základě specifických požadavků chromatografické analýzy, zejména při převodu metody z jednoho přístroje na druhý.

Figure 2 High-pressure gradient system

Figure 3. Low-pressure gradient system

 

Problémy s chromatografickými čerpadly mohou zahrnovat různé problémy, které mohou ovlivnit výkon a spolehlivost čerpadla v chromatografii. 

Řešení těchto problémů často zahrnuje běžnou údržbu, kontrolu a výměnu spotřebního materiálu a zajištění správné kalibrace a provozu chromatografické pumpy. Pravidelné kontroly systému a dodržování doporučených plánů údržby jsou nezbytné pro optimální výkon chromatografie.

Problémy čerpacího systému lze obvykle snadno odhalit a odstranit. Pro problémy čerpacího systému je charakteristický opakující se základní hluk, jehož frekvence se zvyšuje úměrně s průtokem. Jistou známkou netěsnosti je nahromadění solí na přípojce čerpadla. Pufrovací soli by se měly ze systému denně vyplachovat čerstvou deionizovanou vodou. Pro izolaci a opravu specifických problémů souvisejících s vaším přístrojem použijte oddíly o řešení problémů a údržbě v návodu k obsluze nebo se obraťte na prodejce přístroje. Těsnění čerpadla vyžadují pravidelnou výměnu. Při nákupu nového systému (U)HPLC se důrazně doporučuje program preventivní údržby.

VSTŘIKOVAČE A VSTŘIKOVACÍ ROZPOUŠTĚDLA

Injektor rychle zavádí vzorek do systému s minimálním narušením průtoku rozpouštědla. Systémy HPLC v současnosti používají injektory s variabilní smyčkou, s pevnou smyčkou a injekční injektory. Tyto sestavy se aktivují ručně, pneumaticky nebo elektricky.

Mechanické problémy týkající se injektoru (např. netěsnosti, ucpané kapilární trubice, opotřebovaná těsnění) lze snadno odhalit a jejich náprava zahrnuje řešení různých problémů, které mohou ovlivnit kvalitu a reprodukovatelnost chromatografických výsledků. Použijte předkolonový filtr, abyste zabránili ucpání frit kolony v důsledku fyzikální degradace těsnění injektoru. Jiné problémy, například nereprodukovatelné nástřiky, se řeší obtížněji.

Různé výšky píků, rozdělené píky a široké píky mohou být způsobeny neúplně naplněnými smyčkami vzorku, nekompatibilitou injekčního rozpouštědla s mobilní fází nebo špatnou rozpustností vzorku. Kdykoli je to možné, rozpouštějte a vstřikujte vzorky v mobilní fázi, která v okamžiku vstřiku protéká kolonou. V opačném případě se ujistěte, že injekční rozpouštědlo má nižší eluotropickou sílu než mobilní fáze. Uvědomte si, že některé autosamplery používají oddělené promývací roztoky pro stříkačky. Ujistěte se, že promývací roztok je kompatibilní a slabší než mobilní fáze. Tato skutečnost je důležitá zejména při přepínání mezi analýzami s obrácenou a normální fází nebo kapalinovou chromatografií s hydrofilní interakcí (HILIC). Zajištění čistoty vnějšího povrchu injekční jehly je rovněž zásadní, zejména při práci s vysoce koncentrovanými nebo viskózními vzorky. Doporučuje se vnější omytí jehly, aby se zabránilo zbytkům z předchozích injekcí a zabránilo se kontaminaci portu sady injekční jehly, což by mohlo ohrozit přesnost následných analýz a způsobit křížovou kontaminaci mezi různými vzorky. Toho lze dosáhnout ponořením jehly do jedné nebo více lahviček obsahujících promývací roztoky určené k důkladnému vyčištění vnějšího povrchu jehly. Správné vnější promývání nejen pomáhá zachovat integritu chromatografického systému, ale v konečném důsledku přispívá k přesnosti a spolehlivosti analytických výsledků.

Vhodná příprava vzorků je kritickým aspektem zajištění přesnosti a spolehlivosti chromatografických analýz. Před vstřikováním je nutné vzorky filtrovat, aby se předešlo možnému ucpání jehly injektoru a následným problémům se systémem. Filtrací se odstraní pevné částice, které by mohly ucpat úzké kanálky injekční jehly, a zajistí se tak hladký a konzistentní proces vstřikování. Kromě toho se při odebírání vzorků z injekčních lahviček doporučuje vyhnout se vstřikování ze dna lahvičky, protože by se v ní časem mohl nahromadit sediment. Sedimentace může vést k zanesení nežádoucích částic do chromatografického systému a k ucpání/znečištění kolony. Dodržováním osvědčených postupů, jako je filtrování vzorků a vyhýbání se vstřikům ze dna lahvičky, přispívají analytici k celkové spolehlivosti a přesnosti chromatografických výsledků, minimalizují riziko kontaminace systému a zajišťují optimální výkonnost.

OCHRANA SLOUPŮ

Ačkoli nejsou nedílnou součástí většiny zařízení, filtry na vstupu mobilní fáze, filtry před vstřikovačem a před kolonou a ochranné kolony výrazně snižují problémy spojené se složitými separacemi. Doporučujeme, aby všechny vzorky byly filtrovány přes 0,45 μm nebo 0,2 μm stříkačkové filtry.

Inline filtry hrají v chromatografických systémech klíčovou roli a slouží jako nepostradatelné součásti zvyšující kvalitu a životnost analytických kolon. Tyto filtry jsou strategicky umístěny v rámci fluidní cesty a účinně zachycují pevné částice, nečistoty nebo kontaminanty přítomné v mobilní fázi nebo vzorku předtím, než se dostanou do chromatografické kolony. Tím, že zabraňují vniknutí nežádoucích částic, přispívají inline filtry k ochraně a zachování obalového materiálu kolony, čímž prodlužují její životnost a zajišťují konzistentní a reprodukovatelné separace. Inline filtry nemají nahradit filtraci, ale jsou spíše záložní ochranou kolony. Pórovitost inline filtrů se doporučuje menší než vstupní frita kolony. Například frita v čele kolony plněné částicemi o velikosti 5 µm má velikost 2 µm, v tomto případě by porozita inline filtru měla být ~1-0,5 µm. Když začne v systému stoupat protitlak, zkontrolujte a v případě potřeby vyměňte inline filtr.

V každém případě důrazně doporučujeme používat ochranné kolony. Stacionární fáze v ochranné koloně by měla odpovídat analytické koloně, takže by měla zachytit látky, které by se nevratně adsorbovaly na analytickou kolonu a omezily její životnost. Ochranná kolona funguje jako obětní prvek v chromatografickém systému. Životnost těchto jednorázových produktů závisí na složení mobilní fáze, objemu nástřiku, čistotě vzorku, pH atd. Jakmile se tato zařízení znečistí nebo zanesou částicemi, zvýší se tlak a píky se rozšíří nebo rozdělí. 

JAK CO NEJLÉPE VYUŽÍT SVŮJ ANALYTICKÝ SLOUPEC

Nezávisle na tom, zda kolona obsahuje vázanou reverzní nebo normální fázi, iontovou výměnu, afinitu, hydrofobní interakci, vylučování velikosti nebo balení na bázi pryskyřice/siliky, nejčastějším problémem spojeným s analytickými kolonami je poškození. Příznaky zhoršení jsou špatný tvar píku, rozštěpené píky, ramena, ztráta rozlišení, snížení retenčních časů a vysoký protitlak. Tyto příznaky naznačují, že se na fritě nebo na vstupu do kolony nahromadily nečistoty nebo že se v loži těsnění nacházejí dutiny, kanálky nebo prohlubeň.

Zhoršení je zřejmější u kolon s vyšší účinností. Například 3,0 µm těsnění zadržované 0,5 µm fritami je náchylnější k ucpávání než 5 nebo 10 µm těsnění zadržované 2,0 µm nebo většími fritami. Správná ochrana kolony a příprava vzorku jsou zásadní pro maximální využití každé kolony.

Přetěžování kolony může způsobit špatný tvar píků a další problémy.

TYPICKÁ KAPACITA KOLONY (nakládání, vstřikování vzorku)

Kapacita kolony závisí na mnoha faktorech, ale typické hodnoty pro celkový maximální objem nástřiku a množství analytů na koloně jsou uvedeny v následující tabulce. Za maximální objem nástřiku se považují nejvýše 2 % celkového objemu kolony a typická koncentrace vzorku v HPLC je přibližně 1 mg/ml. Mějte prosím na paměti, že účinnost a rozlišení se obvykle zvyšují se snížením objemu nástřiku.

ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ S DETEKTORY

Problémy s detektory se dělí do dvou kategorií - elektrické a mechanické/optické. V případě elektrických problémů byste se měli obrátit na výrobce přístroje. Mechanické nebo optické problémy lze obvykle vysledovat v průtokové cele. Problémy s detektory zahrnují kontaminaci buňky, vzduchové bubliny a netěsnost. Ty obvykle způsobují nízkou citlivost, drifty, zvuky základní linie nebo hroty v chromatogramech. Některé buňky jsou citlivé na tlak, zejména ty, které se nacházejí v detektorech indexu lomu. Průtoky nebo protitlaky, které překračují doporučení výrobce, rozbijí okénko buňky. Staré nebo vadné lampy, stejně jako nesprávná doba náběhu detektoru, zesílení nebo útlum sníží citlivost a výšku píku.

PROBLÉMY S HPLC, PŘÍČINY A NÁPRAVNÁ OPATŘENÍ

Zadržení

Malé rozdíly ve složení mobilní fáze mohou při přetížení kolony způsobit obrovské rozdíly v retenčním čase, který se navíc mění s teplotou. Avšak i v případě, že je mobilní fáze pufrovaná a čerpadlo pracuje správně, mohou retenční časy kolísat, pokud je pH příliš blízko pK látky vzorku. Proto by pH mobilní fáze mělo být zvoleno tak, aby bylo alespoň o jednu jednotku pH vyšší nebo nižší než hodnota pK separovaných analytů. Drift retenčního času ukazuje na nedostatečnou úpravu kolony. S rostoucí životností kolony se mohou retenční časy posouvat směrem k menší retenční schopnosti, zejména pokud uživatel pracuje s kyselým pH (≤pH 2). Náhlé změny retenčního času jsou obvykle způsobeny chybami v systému.

Problém: Změna doby zadržení

Figure 4. Variable Retention Times. A) Normal, B) Problem, C) Problem

Problém: Zkracující se doba uchovávání

Problém: prodloužení doby uchovávání

Ekvilibrace

Ekvilibrace chromatografické kolony je klíčovým krokem v chromatografickém procesu, který je nezbytný pro zajištění přesných a reprodukovatelných výsledků. Tento proces spočívá v tom, že mobilní fáze protéká kolonou za specifických podmínek, dokud není dosaženo stabilní základní hodnoty, která ukazuje, že systém je v rovnováze.

Equilibrace slouží k několika důležitým účelům. Zaprvé umožňuje interakci stacionární fáze uvnitř kolony s mobilní fází, čímž zajišťuje správné smáčení a úpravu obalového materiálu. To pomáhá vytvořit rovnoměrné rozložení mobilní fáze a analytů uvnitř kolony, čímž se optimalizuje účinnost separace a rozlišení.

Dále ekvilibrace pomáhá stabilizovat parametry systému, jako je tlak, teplota a průtoková rychlost, čímž se minimalizuje variabilita během následných nástřiků. Tím, že se systém dostane do ustáleného stavu, snižuje ekvilibrace riziko driftu základní linie a zajišťuje konzistentní výkon v průběhu času.

Problém: Pomalá doba ekvilibrace kolony

Problém: Různé doby uchovávání

Vrcholy

Pokud mají všechny píky na chromatogramu stejný vzhled, problém vznikl před separací. Pokud se v chromatogramu eluují pouze některé píky nebo pouze jeden pík se zkresleným tvarem, je zdroj chemické povahy.

Problém: Široké vrcholy

Široké píky vznikají buď zásadním ovlivněním ze strany systému HPLC (špatné propojení kapilár, prázdné objemy, příliš velké detekční cely nebo špatně zvolené časové konstanty), nebo špatným výkonem kolony.

Figure 5. Typical chromatograms, A). Normal peaks B) Broad peaks

Problém: Ghost Peaks

Píky duchů mohou být způsobeny neznámými složkami vzorku, pozdními elučními píky z předchozích nástřiků, nečistotami nebo problémy se smícháním v souvislosti s mobilní fází. Vzorek by proto měl být přednostně vždy rozpuštěn v eluentu nebo v rozpouštědle se slabší eluční silou. Látky s UV absorpcí nižší než eluent mohou vytvářet negativní píky.

Figure 6. HPLC chromatograms, A) Previous sample, B) After injection of solvent following the solvent with no ghost peak, C) After injection of solvent following the solvent showing a ghost peak

Problém: záporné špičky

Figure 7. A) Normal chromatogram, B) Chromatogram with negative peaks

Problém: zdvojnásobení špičky

Pokud mají všechny píky ramena nebo eluují jako dvojité píky, může být příčinou ucpané inline filtry, vstupní frita kolony, kontaminované předkolony nebo prázdný objem v hlavě kolony. Ve většině případů lze kolonu uvést do původního stavu vyčištěním nebo výměnou vstupní frity. Krátkodobým řešením tohoto problému může být také inverze kolony. Zničené lože na výstupu z kolony přispívá k šíření špičky pouze okrajově.

Problém: Peak Fronting

Figure 8. Typical chromatograms, A) normal without a fronting peak B) with a fronting peak

Problém: vrcholové chvosty

Odstín píků, které jsou eluovány dříve, je způsoben dodatečnými účinky kolony. K nápravě je třeba zkontrolovat celý systém - připojení kapiláry, hadičky a detekční buňku. Sekundární, nespecifické interakce s povrchem silikagelu vedou k chvostu pozdně eluovaných píků a dokonce ke vzniku dvojitých píků. Přidání triethylaminu nebo acetátu do mobilní fáze nebo výběr vhodné stacionární fáze výrazně zlepší tvar píků. Nevhodně zvolená hodnota pH mobilní fáze může rovněž vést k chvostu píků. V zásadě by se chromatografie měla provádět o jednu jednotku pH výše nebo níže, než jsou hodnoty pK vzorkovaných látek.

Figure 9. Typical chromatograms, A) Normal without a tailing peak B). With a tailing peak

Problém: hroty

Problém: žádné špičky

Figure 10. Typical chromatograms, A) Normal peaks, B) No peaks, C) Very small peaks

Problém: Vrcholy s rameny, rozdělené vrcholy

Figure 11. Typical chromatograms A) Normal peaks B) Split peaks

Problém: Změna výšky vrcholu (jeden nebo více vrcholů)

Figure 12. Typical chromatograms, A) Normal B) One peak with a different height

Problém: ztráta rozlišení

Problém: Zaoblené vrcholy

Figure 13. Typical chromatograms, A) Normal, B) Rounded Peaks

Zotavení

Výtěžnost vzorku z chromatografické kolony ovlivňuje několik faktorů, včetně chemického složení kolony, složení mobilní fáze, vlastností analytu a provozních parametrů. Volba materiálu náplně kolony a chemie stacionární fáze může významně ovlivnit retenci analytu a chování při eluci. Optimalizace výběru kolony tak, aby odpovídala fyzikálně-chemickým vlastnostem analytu, je zásadní pro minimalizaci nespecifické sorpce a maximalizaci výtěžnosti vzorku. Složení mobilní fáze hraje zásadní roli při eluci analytu a výtěžnosti vzorku. Úpravou složení a gradientového profilu mobilní fáze mohou analytici zvýšit účinnost eluce analytu a zlepšit výtěžnost analytu.

Problém: špatná výtěžnost vzorku

Leaks

Často se může stát, že po instalaci nových dílů, zejména pokud instalace nebyla provedena správně, dojde k netěsnostem. Kromě toho může netěsnost způsobit i náhlé zvýšení protitlaku v systému. Netěsnost mohou způsobovat také staré, opotřebované a zanesené díly.

Problém: Netěsnost na sloupku nebo armaturách

Problém: netěsnost na detektoru

Problém: netěsnost na vstřikovacím ventilu

Problém: netěsnost čerpadla

Selektivita

Náhlé změny chromatografické selektivity mohou být způsobeny řadou faktorů, včetně kondicionování kolony, složení mobilní fáze, vlivu matrice vzorku, kolísání teploty a průtoku a degradace kolony. Pochopením těchto faktorů a zavedením vhodných opatření ke zmírnění jejich vlivu mohou analytici zachovat spolehlivost a reprodukovatelnost chromatografických výsledků a zajistit tak přesný a konzistentní analytický výkon.

Problém: Rozdíly v selektivitě

Figure 14. Typical chromatograms, A) Normal, B) Problem of change in selectivity

Základní linie

Chromatografická základní linie slouží jako referenční bod pro detekci analytů při chromatografické analýze. Představuje signál produkovaný detektorem v nepřítomnosti eluce analytu a udává úroveň šumu základní linie a stabilitu systému. Stabilní a dobře definovaná základní linie je nezbytná pro přesnou detekci, integraci a kvantifikaci píků v chromatografické analýze. Odchylky nebo poruchy základní linie, jako je drift, šum nebo špičky, mohou zakrýt píky analytu a vést k nepřesným výsledkům. Mezi faktory, které přispívají k poruchám základní linie, patří kolísání složení mobilní fáze, teploty, tlaku a citlivosti detektoru, jakož i problémy související s přístroji, jako je šum detektoru a elektronické rušení. Pro zlepšení poměru signálu k šumu a zlepšení kvality dat se často používají správné techniky korekce základní linie, jako je odečítání základní linie nebo filtrování. Kromě toho je pro udržení stability základní linie a zajištění spolehlivosti chromatografických výsledků nezbytná pravidelná údržba systému, včetně proplachování kolon, čištění detektoru a kalibrace přístroje. Lze shrnout, že chromatografická základní linie hraje při chromatografické analýze zásadní roli a slouží jako základ pro přesné a precizní stanovení koncentrací analytu. Udržování stability základní linie je zásadní pro dosažení spolehlivých a reprodukovatelných chromatografických výsledků v analytických aplikacích.

Problém: Rušení v době prázdna

Problém: Driftování základní linie

Figure 15. Typical chromatograms, A) Normal B) Baseline Drift

Problém: Hluk

Figure 16. Typical chromatograms, A) Normal, B) Baseline noise (regular)

Figure 17. Typical chromatograms, A) Normal B) Problem (Irregular baseline noise)

Tlak

Problém s tlakem je obvykle spojen s příliš vysokým protitlakem a k objasnění toho, kde problém vzniká, je dobrým laboratorním postupem postupné odpojování systému, počínaje detektorem a postupně zpět ke vstřikovači a poté k čerpadlu.

Problém: Klesající tlak

Problém: kolísající tlak

Problém: Vysoký protitlak

Flow

Problém: Žádný průtok

Figure 18. Typical chromatograms A) Normal, B) Problem (No flow)

Další doporučení

Doporučujeme také nahlédnout do částí o údržbě a řešení problémů v příručce k přístroji nebo se obrátit na servisního technika. Moderní systémy HPLC mají často autodiagnostické funkce, které pomáhají izolovat problémovou oblast v přístroji. V případě přetrvávajících problémů týkajících se kolony nebo vaší analýzy se obraťte na oddělení technického servisu společnosti Supelco.

Zbývající stránky této příručky obsahují postupy pro obnovení výkonu kolony po ztrátě rozlišení, retence nebo selektivity, návrhy, jak předcházet hardwarovým problémům s kolonou a jak je řešit, a výběr produktů na ochranu kolon z portfolia společnosti Supelco. Na našich webových stránkách naleznete kompletní řadu příslušenství, které prodlužuje životnost kolon a obecně zjednodušuje nebo zlepšuje (U)HPLC nebo FPLC^® analýzy

OBNOVENÍ VÝKONU VAŠEHO SLOUPU

Vystavení kolony vzorkům nebo rozpouštědlům obsahujícím vysoce adsorpční složky vede ke zvýšení protitlaku a změně selektivity. Často je možné obnovit původní výkonnost kolony dodržováním vhodných promývacích protokolů. Při provádění regenerace výplachem rozpouštědlem by měla být kolona obrácena a převedena z analytického systému HPLC do jednoduché, levné pumpy. Případně odpojte kolonu od detektoru a promyjte ji přímo do odpadu. Každé rozpouštědlo by mělo být propláchnuto minimálně 20, nejlépe 30 objemy kolony.

Je velmi důležité si nejprve pečlivě přečíst návod k použití, který je dodáván s každou kolonou. Tento list obsahuje také informace o doporučených postupech péče o kolonu a její regeneraci. Tato doporučení je nutné dodržovat. Znečištění kolony v horní části částicemi by mělo být obecně snadno odstraněno promytím kolony po dobu přibližně 5 až 20 objemů kolony v režimu zpětného proplachu, ale pouze v případě, že to výrobce kolony umožňuje - je důležité se ujistit, že obě fritové části kolony (vstupní i výstupní) mají stejnou pórovitost. Mějte na paměti, že malé částice zachycené hlouběji v obalu kolony se pravděpodobně neodstraní. V důsledku takového promývání by měl být protitlak v koloně poněkud nižší. Odstranění nespecificky vázaného materiálu z kolony je obtížné a výsledek je obvykle nepředvídatelný, protože obvykle nevíme, o jaké sloučeniny se jedná kontaminanty. Poměr úspěšnosti se může pohybovat od 0 do 100 %. Úplné obnovení balení kolony, uniformita pro kolony naplněné částicemi menšími než 5 µm je velmi nepravděpodobná. Obvykle zpětné propláchnutí kolony pomáhá pouze krátkodobě.

Pokud se rozhodnete propláchnout/regenerovat kolonu, následující postup krok za krokem by měl teoreticky omladit kolonu, jejíž výkon se zhoršil v důsledku kontaminace vzorku.

Poznámka! Všechna rozpouštědla použitá pro regeneraci kolony musí být stejné analytické úrovně kvality, jaká se běžně používá s touto kolonou provádějící denní analýzu.

1. Odpojte a obráťte kolonu.
2. Připojte ji k čerpadlu, ale ne k detektoru.
3. Postupujte podle příslušného proplachovacího postupu v níže uvedené tabulce, přičemž použijte průtok, který vede k protitlaku kolony 1500-4500 psi, nikdy však ne vyššímu, než je maximální doporučený tlak v návodu k použití od výrobce. Pokud máte kolonu Supelco^®, proveďte analýzu pomocí zkušební směsi a podmínek uvedených v datovém listu.
4. Konzervujte kolonu obvyklým rozpouštědlem
5. Zkoušejte kolonu pomocí vzorku zkušební směsi. Účinnost, symetrie a kapacita by měly být v rozmezí 10-15 % hodnot ze zkušebního listu. Pokud tomu tak není, vyměňte kolonu.

Poznámka: Objemy uvedené v tabulce jsou pro kolony o rozměrech 25 cm x 4,6 mm I.D., které mají objem kolony 4,15 ml. Při obnově kolony s vnitřním průměrem 4,6 mm kratší nebo delší než 25 cm vynásobte všechny objemy poměrem délky kolony a 25 (např. pro 15 cm kolonu: 15/25, neboli 0,6násobek objemu). Při obnově kolony s vnitřním průměrem jiným než 4,6 mm vynásobte všechny objemy poměrem čtverce vnitřního průměru kolony k (4,6)²  (např. pro kolonu s vnitřním průměrem 3,2 mm: (3,2)²/(4,6)² = 10,24/21,16 = 0,48násobek hodnot uvedených v tabulce).

Nepotažené křemíkové kolony vystavené působení polárního rozpouštědla

Vzorky a mobilní fáze obsahující velmi silně polární rozpouštědla, jako je voda nebo alkoholy, mohou deaktivovat nepotažené křemíkové HPLC kolony. Toto působení může drasticky ovlivnit výkonnost kolony, zejména retenci a selektivitu rozpuštěných látek. Dokonce i dlouhodobé proplachování kolony nepolárním rozpouštědlem pouze částečně obnovuje výkonnost kolony, přičemž dochází k plýtvání chemickými látkami. Regenerační roztok oxidu křemičitého (obsahující kyselinu octovou, dimethoxypropan a methylenchlorid) může rychle a levně obnovit výkonnost křemíkové kolony odstraněním zachyceného polárního materiálu. Roztok pumpujte přes postiženou kolonu po dobu 10 minut rychlostí 4 ml/minutu a poté jej proplachujte mobilní fází po dobu 10 minut rychlostí 2 ml/minutu. Vyhodnoťte výkonnost kolony pomocí testovací směsi pro hodnocení křemíkových kolon. Výkonnost by měla být prakticky stejná jako před zavedením polárního rozpouštědla.

ULOŽENÍ SLOUPCE

Skladování kolony může být krátkodobé, střednědobé a dlouhodobé.

• Krátkodobé skladování, tj. přes noc, mobilní fáze použitá při poslední analýze může zůstat uvnitř kolony. Alternativně je také možný průchod mobilní fáze při velmi nízkém průtoku (zejména pokud je koncentrace pufru v mobilní fázi vysoká, >50 mM). V tomto případě lze případně vynechat úpravu kolony před pokračováním analýzy následující den. Tato možnost se doporučuje zejména u separací v normální fázi, kde změna složení mobilní fáze může vést ke zdlouhavé reekvilibraci. Pokud je však koncentrace pufru v mobilní fázi velmi vysoká (>0,5 M), pak by životnost části čerpadla (např. injektoru & přepínacích ventilů) mohla záviset na době kontaktu s pufrem o vysoké koncentraci. Totéž platí pro kolonu, pokud je pH blízké limitní hodnotě kolony (u většiny kolon na bázi oxidu křemičitého pH 2 až pH 7). Některé soli, jako jsou zejména chloridové soli, jsou velmi korozivní pro nerezovou ocel a mohly by napadnout stěnu kolony i vstupně-výstupní frity. V takových případech by se měla kolona (a celý systém) propláchnout méně agresivní mobilní fází. V takovém případě bych doporučil propláchnout kolonu mobilní fází bohatou na vodu (~90 %) s přibližně 10 objemy kolony (přibližné objemy kolony pro některé populární rozměry kolony naleznete v tabulce níže).
  

Pokud odpojíte kolonu od přístroje, měly by být koncové zátky pevně nasazeny, aby se zabránilo odpařování rozpouštědla, které by vedlo k vysychání stacionární fáze. Nejhorším scénářem je nesprávně promytá kolona, která byla dříve použita s vysokou koncentrací soli a časem vyschla - vzniknou krystalky soli, kolona bude s největší pravděpodobností nevratně poškozena. Některé kolony však mohou být skladovány v suchu některé ne, podívejte se na pokyny výrobce k péči o kolonu. Standardní HPLC kolony by měly být skladovány při pokojové teplotě a nikdy ne v chladničce nebo mrazničce (výjimkou jsou afinitní kolony modifikované proteinem nebo aktivní enzymové reaktorové kolony). Doporučení tohoto odstavce platí i pro střednědobé a dlouhodobé skladování kolon.

• Střednědobé intervalové skladování, tj. 2 dny nebo přes víkend, by se měly kolony propláchnout. Intenzita nebo objem proplachování závisí na koncertování vyrovnávací paměti používané při analýze. Obecně se doporučuje nejprve propláchnout pufry z kolony přibližně 10 objemy mobilní fáze s 10 % organického rozpouštědla ve vodě. V tomto případě bude promytí účinné a také bychom se vyhnuli vysrážení pufrů a možným problémům s odvlhčením kolony. Poté lze kolonu ponechat připojenou k přístroji nebo ji odpojit a uzavřít koncovými zátkami. Zvažte také doporučení pro krátkodobé skladování kolony, např. odkaz na dokumentaci ke koloně, kde je uvedeno doporučené rozpouštědlo pro skladování.
  Skladování kolony HILIC ve směsi acetonitrilu a vody může trvat dlouhou dobu, než se znovu zkalibruje, pokud se pro analytickou metodu použije pufr s nízkou iontovou silou (např. 5 mM octan amonný). Proto se pro kolony HILIC doporučuje skladovat je v rozpouštědlech obsahujících 80-90 % acetonitrilu a pufrech obsahujících 5-10 mM octan amonný nebo mravenčan amonný.
  Iontově výměnné a smíšené fáze obsahující funkční skupiny karboxylových kyselin (například slabé kationtově výměnné fáze) nelze skladovat v roztocích obsahujících alkoholy z důvodu pomalé esterifikace a následné změny selektivity/kapacity.

• Pro dlouhodobé skladování by měly být kolony na bázi oxidu křemičitého po řádném promytí min. 15 objemy kolony pomocí ~ 10% organického rozpouštědla ve vodě propláchnuty mobilní fází bohatou na organické látky po dobu min. 10 objemů kolony a mohly by být skladovány v aprotickém rozpouštědle. Pokud by mohla být přítomna také voda, neměla by být ve vyšších koncentracích, rozhodně méně než 50 %. V literatuře se jako nejlepší rozpouštědlo pro skladování doporučuje acetonitril nebo methanol (existují výjimky, např. kolony s amidovou modifikací, ty by se měly skladovat pouze v acetonitrilu). Některé studie1 také uvádějí, že za podmínek RP byla rychlost eroze a koroze nerezových součástí HPLC při použití čistého acetonitrilu nebo methanolu vyšší ve srovnání s tím, když byly smíchány s vodou. Proto je 90 % acetonitril nebo methanol ideálním prostředkem pro dlouhodobé skladování většiny kolon s reverzní fází. Pro skladování kolon s reverzní fází se používá směs isopropanolu a vody (80/20), a to z důvodu vyšší viskozity isopropanolu & tlaku par a snížené možnosti vyschnutí kolony, i když koncové armatury nejsou zcela utěsněny. Isopropanol je také silnější eluent, proto jsme si po uložení v isopropanolu mohli být jisti, že se vymyje ještě více nečistot než při použití acetonitrilu nebo methanolových gradientů. V neposlední řadě je isopropanol také méně toxický. Je důležité si uvědomit, že všechny mobilní fáze použité k proplachování, promývání nebo skladování kolony musí být stejné třídy kvality jako ty, které se používají k analýze. Kolony by měly být skladovány při pokojové teplotě (výjimkou mohou být např. afinitní kolony, jak bylo uvedeno výše) v původní krabici, s kopií certifikátu o analýze (CoA)/zprávy o koloně, možná také s knihou kolony, aby bylo vidět předchozí použití, aby bylo možné vyhodnotit kolonu před dalším použitím.

Jak dlouho se mají kolony skladovat? To závisí na mnoha aspektech. Některé sloupce se nemění ani po 5 nebo 10 letech skladování. Pokud se rozhodnete vyzkoušet kolonu po takto dlouhém skladování, předpokládejte, že kolona s největší pravděpodobností vyschla a je třeba ji znovu navlhčit nejprve propláchnutím 100% acetonitrilem (RP-fáze) a poté asi 1 h ekvilibrovat v mobilní fázi před provedením jakéhokoli měření selektivity. Kromě toho možná proveďte testovací směs kolony a porovnejte údaje s CoA.

Správné skladování kolony je nezbytné pro správnou chromatografii a prodloužení její životnosti. V neposlední řadě - vždy dodržujte pokyny výrobce týkající se provozních údajů kolony!

Testovací směsi kolony

Směsi pro hodnocení výkonnosti kolony HPLC.

Dobře definované testovací směsi umožňují řešit chromatografické problémy, optimalizovat účinnost systému a hodnotit kolony za podmínek, kdy je jejich výkonnost srozumitelná. Naše testovací směsi dodáváme v jantarových ampulích, abychom zabránili fotodegradaci, a přikládáme pokyny pro správné použití a interpretaci výsledků.

PREVENCE A ŘEŠENÍ BĚŽNÝCH PROBLÉMŮ S HARDWAREM

Předcházení únikům

Úniky jsou běžným problémem při analýzách HPLC. Chcete-li minimalizovat netěsnosti v systému, vyhněte se záměně hardwaru a šroubení od různých výrobců. Nekompatibilní šroubení lze zpočátku přinutit, aby pasovalo, ale při oddělování se mohou projevit problémy a opakovaná spojení mohou nakonec způsobit netěsnost šroubení. Pokud je záměna nutná, použijte vhodné adaptéry a před pokračováním zkontrolujte těsnost všech spojů.

Vysoce koncentrované soli (>0,2 M) a žíravé mobilní fáze mohou snížit účinnost těsnění čerpadla. Životnost těsnění rotoru injektoru závisí také na podmínkách mobilní fáze, zejména na provozu při vysokém pH. V některých případech má dlouhodobé používání iontových párových činidel mazací účinek na písty čerpadla, který může způsobit drobné netěsnosti na těsnění. Některá těsnění nefungují dobře s určitými rozpouštědly. Před použitím čerpadla za nepříznivých podmínek si přečtěte specifikace výrobce přístroje nebo se obraťte na servisního technika. Chcete-li vyměnit těsnění, nahlédněte do části příručky k čerpadlu věnované údržbě nebo se opět obraťte na servisního technika.

Odstranění ucpané frity kolony

Ucpaná frita kolony je dalším častým problémem HPLC. Chcete-li tento problém minimalizovat hned od začátku, použijte předkolonový filtr a ochrannou kolonu. Chcete-li vyčistit vstupní část, nejprve odpojte a obráťte kolonu. Připojte ji k čerpadlu (ale ne k detektoru) a čerpejte přes ni rozpouštědlo dvojnásobným standardním průtokem. K odstranění malého množství částic na vstupní fritě by mělo stačit asi 5 až 10 objemů rozpouštědla z kolony. Vyhodnoťte výkonnost vyčištěné kolony pomocí standardní zkušební směsi.

VÝBĚR PRODUKTŮ NA OCHRANU SLOUPŮ

Přístroj pro filtraci mobilní fáze Supelco^® (připojuje se k aspiračnímu potrubí)

• Filtrační přístroj 1 (připojuje se k 1000ml boční baňce): Obsahuje skleněný zásobník o objemu 250 ml, základnu nálevky a zátku, svorku, držák a sítko z nerezové oceli, 10 teflonových těsnění, 50 filtrů Nylon 66 (47 mm, póry 0,45 μm).
• Filtrační přístroj 2 (připojuje se k aspiračnímu vedení): Obsahuje skleněný zásobník o objemu 250 ml, kuželovou základnu nálevky 34/45, kuželovou baňku o objemu 1000 ml a skleněný uzávěr 34/45, svorku, držák a sítko z nerezové oceli, 10 teflonových těsnění, 50 filtrů Nylon 66 (47 mm, póry 0,45 μm).

Ochraňte svůj přístroj a kolony odstraněním částic a plynů z rozpouštědel a dalších složek mobilní fáze. Membránové filtry z nylonu 66 jsou kompatibilní se všemi rozpouštědly běžně používanými v HPLC.

Filtry

Předkolonový filtr je nezbytný pro ochranu HPLC kolon před částicemi, které se mohou hromadit na fritě kolony a vést k rozštěpení píků a vysokému zpětnému tlaku. Zdrojem částic jsou mobilní fáze (zejména při smíchání pufrů s organickými rozpouštědly), těsnění čerpadel a injektorů a vzorky. Pro ochranu kolon obsahujících částice o velikosti 5 μm a větší použijte fritovou podložku o velikosti 2,0 μm, pro kolony s částicemi menšími než 5 μm použijte fritovou podložku o velikosti 0,5 μm.

Náš Supelco^® předkolonový filtr lze připojit přímo, ručně těsně, k jakékoliv koloně HPLC nebo ochranné koloně uvedené na našich webových stránkách nebo k jakékoliv jiné koloně, která má koncovky kompatibilní s Valco. Víčko a tělo z PEEK, 2 μm frita z nerezové oceli. 

Fritové a sítkové filtry Valco Precolumn³

In-line instalace. Účinné filtry s nízkým mrtvým objemem chrání kolony před částicemi, aniž by snižovaly jejich výkon. Vyměnitelná 1/8" frita má póry o velikosti 0,5 μm, které chrání 3 μm nebo 5 μm náplně kolony, vyměnitelné síto má póry o velikosti 2 μm. Vyberte si fritový filtr pro vyšší filtrační kapacitu (většina aplikací) nebo filtr se sítkem pro menší mrtvý objem (např. u kolon s mikrootvorem). Používejte s hadičkami o průměru 1/16quot; 1/16quot; šroubení je součástí dodávky.

Předkolonový filtr Isolation Technologies

In-line instalace. Vysokokapacitní vstupní filtr minimalizuje mrtvý objem a rozšíření pásma, aby se zabránilo ztrátě účinnosti kolony a zároveň chránila vaše kolona. Pórovitost frity: 0,5 μm. Kompletní provedení podle obrázku.

Vysokotlaký předkolonový filtr SSI

In-line instalace. Filtrační kotouč z nerezové oceli 316 (póry 0,5 μm) lze snadno vyměnit bez nutnosti demontáže koncovky kolony. Maximální provozní tlak: 15 000 psi (1054 kg/cm²). Pro 1/16" trubky.

Vysokotlaký předinjektorový filtr SSI

Umístěte jej mezi čerpadlo a injektor a zajistěte konečnou filtraci mobilní fáze. Snadno vyměnitelný filtrační prvek z nerezové oceli 316 (póry 0,5 μm). Maximální provozní tlak: 15 000 psi (105 MPa). Pro trubky s průměrem 1/16quot; O.D., závit 10-32

Předsazený filtr Upchurch

In-line instalace. Tělo z nerezové oceli s inertními koncovkami z polyetheretherketonu (PEEK) a fritou z PEEK o tloušťce 0,5 μm nebo 2 μm v jedné koncovce.

Injektory Rheodyne Model 7725 a 7725i

Injektor Rheodyne Model 7725 umožňuje vstřikovat vzorky o objemu 1 μl-5 ml s přesností a precizností. Robustní, snadno udržovatelná konstrukce nabízí mnoho pokročilých funkcí:

• Patentovaná konstrukce s kontinuálním průtokem (viz obrázek) - průtok je nepřerušen, když přepnete z režimu LOAD na INJECT
• Snadné nastavení těsnění pomocí tlakového šroubu na přední straně injektoru.
• Široký úhel otvoru (30°), pro snadný přístup k příslušenství

Injektor obsahuje 20 μl vzorkovací smyčku a je dodáván s těsněním rotoru VESPEL, které lze nahradit těsněním rotoru Tefzel pro provoz při pH 0-14. Tovární nastavení na 5000 psi (345 barů), nastavitelné na 7000 psi (483 barů). Model 7725i je vybaven vnitřním spínačem pro snímání polohy.

Běžný ventil HPLC během vstřikování vzorku na okamžik přeruší průtok a vystaví kolonu opakovaným tlakovým rázům. Patentovaná konstrukce MBB (make-before-break) společnosti Rheodyne vytvoří nové spojení před přerušením starého, čímž zajistí nepřerušovaný průtok.

Rheodyne Model 7725 injector. 1. To sample loop, 2 From pump, 3. MBB passage, 4. MBB port, 5. To column, 6. From sample loop

Optimize Technologies Náhradní díly pro čerpadla

Program preventivní údržby, který zahrnuje rutinní výměnu dílů čerpadla podléhajících opotřebení, vám pomůže vyhnout se nákladným prostojům. Náš rozsáhlý výběr zpětných ventilů, těsnění a pístů Optimize Technologies splňuje nebo překračuje specifikace výrobců čerpadel. Nejaktuálnější výběr dílů čerpadel naleznete na webových stránkách.

SSI^™ LO-Pulse^™ tlumič

Tlumič pulsů řídí pulsace čerpadla pro stabilnější základní linii. Tlumič SSI^™ LO-Pulse^™ je patentovaná jednotka kompatibilní s jednopístovými pístovými HPLC čerpadly (Altex 110A, čerpadla Eldex, LDC Mini-Pump VS, SSI modely 200 a 300 atd.). Při tlacích od 500 psi do 6000 psi (35-420 kg/cm²) zvyšuje přesnost kvantitativních analýz a limity detekce stopových složek vzorku. Šroubení a návod jsou součástí dodávky.