Poly(glycerol-sebakát) v tkáňovém inženýrství
Yadong Wang1, Steven Lu2, Peter Gabriele2, Jeremy J. Harris2
1Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261 USA, 2Research and Development, The Secant Group, LLC, Telford, PA 18969 USA
Material Matters, 2016, 11.3
Úvod
Svět komerčních biomateriálů za posledních 30 let stagnoval, protože jen málo materiálů úspěšně přešlo ze stolu do klinického použití. Syntetické alifatické polyestery nadále dominovaly v oblasti resorbovatelných biomateriálů díky své dlouhé historii a historii schvalování u amerického Úřadu pro kontrolu potravin a léčiv (FDA). Navzdory množství výzkumů zaměřených na vývoj biokompatibilních, biologicky odbouratelných polymerů trpěly nové biomateriály nesouladem v oblasti shody, tj. neschopností úspěšně napodobit mechanické vlastnosti přirozené tkáně. K řešení těchto problémů byl v laboratoři profesora Roberta Langera vyvinut poly(glycerol sebakát) (PGS) jako houževnatý, biologicky odbouratelný elastomer.1 Od tohoto objevu komunita biomedicínského inženýrství používá PGS v mnoha implantabilních aplikacích v oblasti kardiovaskulárních, neurovaskulárních, ortopedických a měkkých tkání.2
PGS je jednoduchý glycerol-esterový polymer vytvořený ze základních metabolitů savců glycerolu a kyseliny sebakové, které mají regulační pozadí u FDA.1 Původně byl navržen jako biologicky odbouratelný polymer se zlepšenými elastickými mechanickými vlastnostmi a biokompatibilitou, výzkum lékařských aplikací na bázi PGS však odhalil řadu jedinečných vlastností, které posílily jeho využitelnost jako biomateriálu. Kromě své elasticity vykazuje PGS minimální bobtnání, podléhá povrchové degradaci a vykazuje mírné akutní a chronické zánětlivé reakce in vivo. Ačkoli většina výzkumných pracovníků používá termosetovou elastomerní formu PGS, polymer je možné přizpůsobit prostřednictvím kontinuální formy pryskyřice. V závislosti na stupni polymerizace lze PGS vyrábět jako měkký gel, mazlavou pastu podobnou vazelíně®, termoplast nebo termoset v závislosti na aplikacích. Manipulací s různými morfologiemi lze PGS také formulovat jako povlak pro řadu lékařských implantátů a vytlačovat do luminálních struktur, desek, tyčí a dalších geometrických tvarů. Polymer je navíc kompatibilní s řadou biologických materiálů, jako je kolagen, kostní minerály a kompozice podobné extracelulární matrici (ECM), což z něj dále činí ideální bioresorbovatelný materiál pro tkáňové inženýrství, aplikace regenerativní medicíny a průmysl biomedicínských zařízení.
Poly(glycerol-sebakát)
Design a struktura
Současný zájem o bioelastomery pro tkáňové inženýrství je do značné míry dán potřebou oprav měkkých tkání. PGS byl vytvořen speciálně pro inženýrství měkkých tkání v dynamickém mechanickém prostředí, jako je kardiovaskulární systém.1 Vyrábí se z glycerolu a kyseliny sebakové polykondenzací, esterové vazby v páteři polymeru se kovalentně zesíťují a vytvářejí trojrozměrnou (3D) síť náhodných závitů, která se podobá struktuře vulkanizované pryže a dává vzniknout elasticitě podobné gumě (obrázek 1). Interakce vodíkových vazeb mezi hydroxylovými skupinami dále zlepšují mechanické vlastnosti PGS. Díky esterovým vazbám může páteř polymeru i příčné vazby podléhat hydrolytické degradaci.
Obrázek 1.Schéma reakce pro poly(glycerol-sebakát). PGS se syntetizuje z glycerolu a kyseliny sebakové a dalším vytvrzováním za tepla a ve vakuu vzniká síťovaný termoset PGS.
Syntéza a mechanické vlastnosti
PGS se syntetizuje polykondenzační reakcí mezi glycerolem a kyselinou sebakovou, při níž nejprve vzniká předpolymerní pryskyřice, která se následně přemění na termosetový elastomer. Zejména obě výchozí látky jsou levné a lze je získat z obnovitelných zdrojů; kyselina sebaková se například získává z ricinového oleje.3 Při syntéze PGS se rovněž využívá chemie šetrná k životnímu prostředí bez potřeby toxických rozpouštědel nebo katalyzátorů, což vede k syntetickému biomateriálu prostřednictvím celkově udržitelné syntézy. V literatuře je uváděno několik způsobů syntézy, ale zde je popsána nejčastěji používaná dvoustupňová metoda. Reaktor se nejprve naplní monomery a zahřeje na 120 °C pod přikrývkou N2. Po vytvoření homogenního roztoku se směs dále zahřívá po dobu 24 hodin. Poté se reaktor umístí do vakua (40 mTorr-10 Torr) na dalších 24-48 hodin v závislosti na požadovaném stupni polymerace. V tomto okamžiku je pryskyřice nebo předpolymer hotový a připravený pro druhý krok - vytvoření termosetového elastomeru. Pryskyřici lze použít jako čistou odlitou fólii, vytvarovat ji do určitého tvaru nebo ji redukovat v rozpouštědle pro odlévání nebo nanášení ponorem. Pryskyřice se vytvrzuje po dobu 24-96 hodin v závislosti na požadovaných mechanických vlastnostech elastomeru.
Jednou z výhod PGS je možnost vyladit jeho mechanické vlastnosti provedením malých změn v postupech polymerace a vytvrzování. Hodnoty modulu pružnosti elastomeru jsou přímo závislé na stupni zesíťování a pohybují se v rozmezí 0,77-1,9 MPa při 48hodinovém, resp. 96hodinovém vytvrzování. Širšího okna hodnot modulu lze dosáhnout manipulací se stechiometrií monomerů, kdy lze hodnoty modulu vyladit v rozmezí 0,01-5 MPa. Změna stechiometrie monomeru rovněž umožňuje jemné vyladění molekulové hmotnosti i volné chemické funkčnosti. Průměrné hodnoty molekulové hmotnosti se pohybují od 2 000 do 200 000 Da a lze je vyladit jednoduchou změnou poměru glycerol:kyselina sebaková. Chemická funkčnost (měřená titrací čísla kyselosti) se pohybuje v rozmezí 110-10 mg/g, což vede k PGS s různou hydrofilností a reaktivitou elastomeru.
Degradovatelnost a biokompatibilita
PGS se rozkládá především hydrolýzou esterové vazby na menší oligomery a nakonec na výchozí monomery, glycerol a kyselinu sebakovou. Degradace PGS je jedinečná a liší se od jiných resorbovatelných polymerů (např. polylaktidu, polyglykolidu a kopolymerů) tím, že PGS degraduje povrchovou erozí na rozdíl od objemové eroze.4 Význam tohoto jevu se projevuje v lineárním profilu degradace v čase s řízenou ztrátou mechanických vlastností, na rozdíl od objemové eroze, kdy mechanické vlastnosti vykazují katastrofický pokles. Mnoho studií hodnotilo in vitro degradaci s nadějí na modelování in vivo vlastností. Existuje však špatná korelace mezi in vitro a in vivo degradačním chováním. In vitro studie prováděné za různých podmínek obvykle vykazují až 20% úbytek hmotnosti po 30 dnech ve srovnání se 70% úbytkem hmotnosti pozorovaným v podkožních tkáních.4b Navzdory zrychlené kinetice degradace PGS in vivo oproti in vitro modelovým podmínkám lze rychlost degradace vyladit modulací hustoty zesíťování prostřednictvím doby vytvrzování a teploty.5
Hydrolytická degradace PGS na jeho složkové monomery, glycerol a kyselinu sebakovou, poskytuje resorbovatelný materiál s vysokou biokompatibilitou. Glycerol je metabolickým stavebním prvkem lipidů a má dlouhou historii použití ve farmaceutickém průmyslu. Kyselina sebaková je přirozeným meziproduktem metabolitu při ω-oxidaci mastných kyselin se středně dlouhým a dlouhým řetězcem. Dále se kopolymery obsahující kyselinu sebakovou používají při podávání chemoterapeutických léčiv.6 Různé studie hodnotily biokompatibilitu PGS pomocí in vitro testů a in vivo implantačních studií. Ukázalo se, že PGS není cytotoxický in vitro1 a vyvolává minimální zánětlivou reakci s malou tvorbou vláknitých pouzder, pravděpodobně díky chování PGS při povrchové degradaci.7
Použití v tkáňovém inženýrství a regenerativní medicíně
Tkáňové inženýrství v posledních třech desetiletích rychle pokročilo a část hnací síly inovací v této oblasti pochází z nových biodegradabilních elastomerních biomateriálů.8 Všechny tělesné tkáně jsou do určité míry přirozeně elastické a mnoho implantátů/štěpů částečně selhává v důsledku nesouladu mechanických vlastností mezi nativními a konstruovanými konstrukcemi.9 U materiálů, které se stýkají s cévní tkání, elasticita substrátu a mechanická stimulace významně ovlivňují buněčné funkce a vývoj tkáně.10 Elastomerní materiály jsou tedy považovány za důležitou třídu materiálů pro skeletové konstrukce pro cévní tkáně a další aplikace regenerace měkkých tkání.
Aplikace v kardiovaskulární tkáni
Mechanické vlastnosti jsou obzvláště důležitým kritériem pro výběr materiálů používaných v kardiovaskulárních aplikacích. Zejména PGS vykazuje malou plastickou deformaci, což jej činí atraktivním pro inženýrství kardiovaskulárních tkání. Tepenné štěpy o malém průměru jsou stále velkou výzvou v tkáňovém inženýrství a vysoce porézní scaffoldy PGS mohou být obzvláště účinné při inženýrství malých tepen.11d Navíc endoteliální progenitorové buňky a buňky hladkého svalstva (SMC) na PGS dobře adherují a proliferují.11d SMC kultivované v PGS scaffoldech koexprimují elastin a kolagen, což vede k vysoce poddajným inženýrským cévám.11c Kromě toho, zatímco množství tropoelastinu vytvářeného těmito buňkami je na scaffoldech PGS a PLGA stejné, elastický substrát PGS umožňuje zesíťování tropoelastinu do desmosinem zesíťovaného elastinu.11b Na modelu břišní aorty na potkanech vykazovaly kompozitní arteriální štěpy složené z PGS trubiček vyztužených polykaprolaktonovým nanovlákenným pláštěm konstruktivní remodelaci štěpu do neoarterie během 3 měsíců.12 Neoartérie mechanicky, biochemicky a anatomicky napodobovaly nativní tepnu a neoartérie byly dobře integrovány s hostitelskou cévou. Pozoruhodné je, že neoartérie pulzovala synchronně s hostitelskými tepnami. Po jednom roce po implantaci obsahovaly neoartérie stejné množství elastinu jako jejich nativní protějšek a v adventicii neoartérií došlo k regeneraci (obrázek 2).13
Obrázek 2.Hrubá morfologie a tkáňová architektura neoarterií se podobá nativním tepnám. A) Vlevo nahoře: přeměna štěpu v neoarterii in situ v průběhu 1 roku. Nedegradovatelné stehy (černě) označují umístění štěpu. Vpravo nahoře: Příčný pohled na explantované neoartérie se podobá nativním aortám. Dole: Podélný pohled na explantované neoartérie se podobá přilehlé nativní aortě. Všechny tečky pravítka jsou 1 mm. B) Příčné řezy obarvené H&E uprostřed neoarterií ukazují podobnou architekturu tkáně jako nativní aorty, bez viditelných zbytků materiálu štěpu. Měřítko 100 mm. C) Řezy neoarterií imunobarvené na von Willebrandův faktor (vWF, červeně) a α-hladký svalový aktin (α-SMA, zeleně). Luminální povrch neoarterií je zcela pokryt vWF pozitivními buňkami (červeně), což naznačuje splývající endotel. Neoarterie obsahují střední vrstvu cévní stěny podobnou medii bohatou na α-SMA pozitivní buňky s obvodově protáhlými jádry, podobně jako hladká svalovina cév nalezená v nativní aortě. Vnější vrstva neoarterií postrádá α-SMA a podobá se nativní adventicii. Některé buňky ve vrstvě podobné medii jsou negativní na α-SMA a některé buňky přiléhající k endotelu jsou α-SMA pozitivní, ale nemají obvodově prodloužená jádra. Měřítko 100 mm. L označuje cévní lumen. Jádra obarvena DAPI (modře). D) En face pohled na luminální povrch neoarterií ukazuje úplné pokrytí CD31 pozitivními buňkami s morfologií podobnou dlažebním kostkám a uspořádáním rovnoběžným se směrem krevního toku, tedy uspořádáním podobným tomu, které se nachází v nativní aortě. Neoarterie byly podélně rozříznuty a zobrazeny jako celky pomocí konfokální mikroskopie a z-skládání ploch. Šipka označuje směr toku krve. Měřítko 100 mm. Přetištěno se svolením z Reference 13. Copyright 2013, Elsevier Ltd.
PGS se také hojně využívá v srdečním tkáňovém inženýrství14 díky snadné modulaci mechanických vlastností PGS tak, aby snadno odpovídaly vlastnostem tkání myokardu.5 V jedné aplikaci byl PGS použit k výrobě vysoce porézních scaffoldů s paralelními kanálky, které napodobují kapilární sítě nacházející se v nativním myokardu.14c Společné kultivace srdečních fibroblastů a kardiomyocytů v perfuzním bioreaktoru s nosiči kyslíku poskytly během 11 dnů kontraktilní konstrukce.14d Při umístění in vivo se bezbuněčné scaffoldy PGS po implantaci v modelu infarktového myokardu potkana vaskularizovaly během 2 týdnů.14d Nedávno byl vytvořen scaffold PGS s mikrostrukturou připomínající voštinu (obrázek 3).14a Jeho tuhost byla řízena dobou vytvrzování, aby odpovídala mechanickým vlastnostem myokardu pravé komory potkana. Kromě toho byly scaffoldy PGS předem potaženy proteiny ECM, aby poskytly ligandy pro zvýšenou interakci buněk, což zvýšilo buněčnost, zvýšilo produkci proteinů ECM a modulovalo diferenciaci endoteliálních progenitorových buněk.15
Použití v nervové tkáni
PGS se rovněž ukázal jako slibný materiál pro výrobu lešení pro regeneraci nervů.7 Systematicky byla hodnocena in vitro a in vivo neurální biokompatibilita PGS. Primární Schwannovy buňky vykazovaly podobnou rychlost uchycení a metabolickou aktivitu na povrchu PGS i PLGA in vitro. Buňky na PGS měly vyšší míru proliferace a nižší apoptotickou aktivitu než buňky na PLGA. In vivo implantace juxtaponovaná na sedací nerv odhalila, že PGS způsobuje výrazně nižší chronickou zánětlivou reakci než PLGA, pravděpodobně díky minimálnímu bobtnání a erozivním vlastnostem povrchu PGS. Nedávná studie zkoumala mikrofabrikované porézní lešení PGS pro transplantaci progenitorových buněk sítnice (RPC). Lešení mělo Youngův modul 1,66 }. 0,23 MPa a maximální deformaci 113 } 22 %.16 Tyto mechanické vlastnosti se více podobají vlastnostem tkáně sítnice (Youngův modul 0,1 MPa a maximální deformace 83 %) než tradiční směs PLA/PLGA (Youngův modul 9,0 } 1,7 MPa a maximální deformace 9 %) používaná pro dodávání RPC. Studie in vitro odhalila, že RPC dobře přilnou a proliferují v PGS scaffold a vykazují tendenci k diferenciaci. Subretinální transplantace prokázaly dlouhodobé přežívání RPC a vysokou míru migrace RPC do tkáně sítnice hostitele.17
Obrázek 3.Voštinové scaffoldy ve tvaru akordeonu poskytují anizotropní mechanické vlastnosti podobné nativnímu myokardu. A,B) Schémata znázorňující konstrukci voštinovitého tvaru, která je tvořena dvěma překrývajícími se čtverci 200 × 200 μm otočenými o 45° (kosočtverce). Jsou vyznačeny preferované (PD) a ortogonální příčné (XD) směry materiálu, které odpovídají obvodové a podélné ose srdce. Měřítka: 1 mm (A) a 200 μm (B). C) Skenovací elektronové mikrofotografie demonstrující věrnost mikroablace excimerovým laserem při vykreslování voštinovitého designu v PGS. Měřítka: 200 μm. D) Doba vytvrzování PGS byla systematicky měněna, což přineslo lineární závislost efektivní tuhosti PGS (EPGS) na době vytvrzování v testovaném rozsahu. E) Reprezentativní grafy jednoosého napětí a deformace pro voštinové lešení ve tvaru harmoniky s kultivovanými neonatálními srdečními buňkami potkana (lešení byla vyrobena z membrán PGS vytvrzených po dobu 7,5 h při 160 °C; neonatální srdeční buňky potkana byly kultivovány po dobu 1 týdne). Přetištěno se svolením z odkazu 19. Copyright 2008, Nature Publishing Group.
Aplikace v kostní tkáni
Ačkoli je kost tvrdá tkáň, v embryonálním stadiu se vyvíjí z měkké kolagenní tkáně. Podobně i přirozený proces hojení kosti začíná z měkké provizorní tkáně zvané kalus. Z tohoto důvodu byly k hojení nespojitého kostního defektu použity scaffoldy vyrobené z elastomeru PGS. Za tímto účelem byla na králičím modelu použita porézní PGS trubice ke spojení dvou konců zcela přetnuté loketní kosti.18 Hojení začalo tvorbou chrupavčité tkáně podobné kalusu, která postupně mineralizovala a během 2 měsíců zcela přemostila defekt, jak bylo vyšetřeno pomocí mikro-CT. Výsledky odhalily, že elastomer PGS s nižší tuhostí dokáže vytvořit prostředí přenášející zátěž, ve kterém dochází k účinnější regeneraci kosti. Naproti tomu kovové implantáty mohou způsobit stínění kosti před napětím, což ztěžuje hojení.
Potahování aplikací pro zdravotnické textilie
Technologie potahování hraje významnou roli při vývoji zdravotnických prostředků, protože poskytuje prostředky k úpravě podkladového substrátu a zvýšení výkonu prostředku. PGS se ukázal jako nesmírně slibný povlakovací materiál; jeho pryskyřice je snadno redukovatelná v široké škále rozpouštědel (např, ethylacetát, THF, aceton, 1,3-dioxolan a různé alkoholy), což vede k roztoku, který lze použít při namáčení a nanášení povlaků stříkáním. Obrázek 4 ukazuje řadu textilních substrátů (PET, polypropylen, PGA a nitinol) potažených hladkou konformní tenkou vrstvou PGS. Zlepšené mechanické vlastnosti, lepší biokompatibilita a antimikrobiální vlastnosti jsou vlastnosti, které povlak PGS propůjčuje, což ilustruje jeho užitečnost v oblasti zdravotnických prostředků.
Obrázek 4.Snímky SEM povlaků Regenerez nanesených na řadu běžně používaných textilních součástí zdravotnických prostředků: A) poly(ethylentereftalátová) tkanina, B) poly(glykolová) pletenina, C) PEEK síťovina, D) nitinolový oplet potažený nástřikem a E) poly(propylenová) síťovina potažená nástřikem. Snímky SEM poskytla Carissa Smoot ze společnosti Secant Group.
Závěry
Biomateriály budou i nadále hrát důležitou roli ve zdravotnických prostředcích a regenerativní medicíně, protože vždy bude existovat potřeba materiálů, které jsou schopny napodobit vlastnosti přirozené tkáně. PGS má mnoho vlastností, které z něj činí ideální materiál pro naplnění mnoha technologických požadavků aplikací v oblasti přístrojového a tkáňového inženýrství. Za posledních 15 let byl PGS využit v aplikacích v oblasti kardiovaskulárních, nervových, měkkých a tvrdých tkání a i dnes nachází nové využití, například jako povlaky pro implantabilní zařízení. Za tuto dobu se PGS dostala z výzkumné laboratoře na trh zavedením pryskyřice Regenerez® Poly(glycerol-sebakát). Nedávné pokroky ve výzkumu, jak jsou zde uvedeny, jistě rozšíří využitelnost a použití tohoto všestranného biomateriálu.
Materiály
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?