Injekční hydrogely pro regeneraci tkání

Prathamesh M. Kharkar¹, April M. Kloxin^1,2

¹Materials Science and Engineering and , ²Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, Newark, DE 19716 USA

[email protected]

Úvod

Použití biomateriálů na bázi hydrogelů pro dodávku a nábor buněk na podporu regenerace tkání v těle se těší rostoucímu zájmu.¹ Hydrogely jsou hydrofilní, vodou napuštěné polymerní sítě vytvořené z různých přírodních a syntetických polymerních stavebních bloků (obrázek 1). Tyto stavební bloky byly navrženy tak, aby umožňovaly zesíťování chemickou reakcí nebo prostřednictvím fyzikálních interakcí v přítomnosti buněk a proteinů, které probíhá dostatečně rychle pro vstřikování a in situ tvorbu hydrogelu. V tomto článku se zabýváme principy návrhu těchto injekčně aplikovatelných hydrogelů, pokrokem v oblasti polymerů a chemických látek pro jejich tvorbu a nedávnými příklady jejich použití pro regeneraci tkání.

Obrázek 1. Injekční hydrogely pro aplikace v oblasti buněčného doručování a tkáňového inženýrství. Injekční hydrogely lze připravit z různých přírodních a syntetických polymerů, rekombinantních proteinů a peptidů. Tyto základní materiály byly zesíťovány v přítomnosti buněk, biologických látek a tkání pomocí chemických reakcí nebo fyzikálních interakcí. Takové injekční hydrogely vytvořené in situ byly použity k dodávání různých terapeutických buněk nebo biologických látek (např. růstových faktorů, chemokinů pro modulaci funkce endogenních buněk) na podporu regenerace tkání, včetně kostí, chrupavek a kůže (zde vyobrazené).

Polymerní stavební kameny pro konstrukci injekčních hydrogelů

Injekční hydrogely se připravují z celé řady materiálů. Cyto- a biokompatibilita a reaktivní chemie jsou rozhodujícími faktory pro výběr základních materiálů, které lze použít v hydrogelech pro doručování nebo nábor buněk v těle. Síťování materiálů (tvorba a koncentrace fyzikálních nebo kovalentních vazeb), biologická rozložitelnost a biochemické vlastnosti jsou rovněž důležitými kritérii návrhu, které mohou ovlivnit strukturní, mechanické a biologické vlastnosti hydrogelů na počátku i v průběhu času. Kromě toho musí být základní polymerní materiály stabilní buď v pevné formě, nebo ve formě roztoku pro skladování před použitím v translačních nebo klinických studiích.

Hydrofilní polymery používané pro konstrukci hydrogelů lze obecně rozdělit do dvou kategorií: přírodní polymery získané z tkání nebo jiných přírodních zdrojů a syntetické polymery vyrobené pomocí principů organické chemie a molekulárního inženýrství. Biokompatibilní přírodní polymery, jako je kyselina hyaluronová, chitosan (prod. Č. 448869, 448877, a 419419), heparin, alginát, fibrin (Prod. No. F5386), kolagen (Prod. Č. 804592, 804622, and 804614), chondroitin sulfátu a hedvábí, napodobují aspekty přirozeného mikroprostředí, včetně jeho mechanických a biochemických vlastností pro modulaci buněčné adheze, migrace a dalších klíčových funkcí pro regeneraci tkání.² Tyto přírodní polymery byly použity jako stavební bloky pro tvorbu injekčních hydrogelů pomocí fyzikálních (např, iontové, vodíkové vazby) nebo kovalentním síťováním (např, reakce funkčních skupin na modifikovaných polymerech).³ Syntetické polymery, jako je poly(ethylenglykol) [PEG], poly(vinylalkohol) [PVA], poly(N-isopropylakrylamid) [PNIPAAm] a polykaprolakton [PCL] byly často používány pro konstrukci injekčně aplikovatelných hydrogelů kompatibilních s buňkami díky jejich komerční dostupnosti, nízké variabilitě mezi jednotlivými šaržemi, univerzálnosti pro chemickou modifikaci a následně snadnému ladění mechanických vlastností výsledných hydrogelů. Protože syntetické polymery postrádají přirozené biochemické signály pro interakci s buňkami, používají se v kombinaci s přírodními polymery nebo biomimetickými peptidy k usnadnění buněčné adheze, migrace a vylučování proteinů.

Pro využití příznivých vlastností tradičních přírodních i syntetických polymerů byly navrženy syntetické peptidy a rekombinantní proteiny pro injekční aplikaci a následnou montáž in situ pro doručení buněk. Příklady takových kombinací zahrnují proteiny obsahující resilin, sekvence bohaté na tryptofan a prolin v dvousložkových hydrogelech indukovaných mícháním (MITCH) a peptidové amfifily s hydrofilními peptidovými segmenty (opakování kyseliny lysinové nebo glutamové) konjugovanými s hydrofobní mastnou kyselinou.⁴ Tyto designové stavební bloky byly navrženy s peptidovými sekvencemi vázajícími integrin pro podporu adheze buněk a rozložitelnými sekvencemi pro remodelaci řízenou buňkami. Zde se zaměříme na několik polymerů, které se běžně používají při navrhování injekčních hydrogelů pro doručování buněk a regeneraci tkání.

Kyselina hyaluronová (HA) (prod. č. 1) je určena pro injekční hydrogely. H5542) je neimunogenní, biokompatibilní glykosaminoglykan, který se nachází v extracelulární matrix pojivových, epiteliálních a nervových tkání. Biomateriály na bázi HA degradují in vivo v reakci na hyaluronidázu a používají se pro různé biomedicínské aplikace.⁵ Young a kol. uvádějí použití injekčních hydrogelů HA pro dodávku progenitorových buněk sítnice (RPC) pro opravu sítnice.⁶ Komerčně dostupná thiol-funkcionalizovaná HA reagovala s akrylát-funkcionalizovaným PEG za vzniku chemicky zesíťovaných hydrogelů v přítomnosti myších progenitorových buněk sítnice. Injektované hydrogely vedly k rovnoměrné distribuci RPC v subretinálním prostoru, které se diferencovaly směrem k požadovaným fotoreceptorům. HA byla modifikována řadou reaktivních funkčních skupin důležitých pro in situ formování po injekci.⁷ V nedávném příkladu Burdick et al. modifikovali HA aldehydovými a hydrazinovými funkčními skupinami, aby vytvořili injekční hydrogely, které uvolňují rekombinantní tkáňový inhibitor matrixových metaloproteináz (TIMP3) a modulují aktivitu myofibroblastů pro lepší regeneraci tkáně po infarktu myokardu.⁸

Alginát, (prod. No. 180947), kationický biopolymer získávaný z hnědých řas, byl již dříve používán v několika klinických aplikacích, mimo jiné jako materiál pro obvazy na rány. V přítomnosti dvojmocných kationtů tvoří alginát fyzikálně zesíťované hydrogely, u nichž lze mechanické vlastnosti ladit změnou množství polymeru, molekulové hmotnosti a koncentrace zesíťovatelných kationtů. Injekční hydrogely na bázi alginátu byly použity k regeneraci různých tkání, včetně kostí, chrupavek, tukové a srdeční tkáně.⁹ Kim et al. prokázali tvorbu tukové tkáně injekčním podáváním alginátových hydrogelů naplněných předkondicionovanými kryokonzervovanými lidskými tukovými kmenovými buňkami (hADSC) in vivo na myších.¹⁰ Před injekcí byl alginát oxidován, aby se zlepšila jeho biodegradabilita, a modifikován pomocí karbodiimidové chemie integrin-vázajícím peptidem (G₄RGDASSKY), který podporuje adhezi buněk. Za 10 týdnů došlo u hydrogelů obsahujících hADSC k tvorbě tukové tkáně (~50 % původního objemu gelu), kdežto u negativní kontroly (hydrogely bez buněk) k tvorbě nové tkáně nedošlo. Kromě HA a alginátu byly připraveny injekční hydrogely s použitím řady dalších přírodních polymerů, včetně chitosanu, heparinu, kolagenu, želatiny, chondroitin sulfátu nebo jejich kombinací, pro regeneraci chrupavky, kosti a srdeční tkáně.¹¹

PEG je díky své biokompatibilitě a absenci vazebných míst pro proteiny jedním z nejpoužívanějších syntetických polymerů pro přípravu injekčních hydrogelů. PEG poskytuje relativně bioinertní základ pro zavedení specifických bioaktivních skupin (např. peptidů), které modulují interakce s buňkami, a byl modifikován různými koncovými skupinami, včetně aminů, thiolů, maleimidů, akrylátů a norbornenů, které lze snadno syntetizovat nebo získat komerčně.¹² Několik výzkumných skupin včetně naší vyvinulo hydrogely na bázi PEG pro doručování buněk a regeneraci tkání. Například Garcia a spol. nedávno použili makromery PEG funkcionalizované maleimidy a peptidy funkcionalizované thioly (tj, cysteiny) k vytvoření injekčně aplikovatelných hydrogelů pro doručování buněk.¹³ Tyto hydrogely udržovaly životaschopnost progenitorových buněk (C2C12) (prod. č.  91031101) během enkapsulace, přičemž doba zesíťování se pohybovala v rozmezí 1-5 minut v závislosti na koncentraci polymeru, a podporovaly šíření buněk.

Síťovací a degradační reakce pro řízení tvorby a rozpadu hydrogelu

Injekční hydrogely se tvoří pomocí různých strategií chemického nebo fyzikálního síťování, které je třeba pečlivě zvolit tak, aby odpovídaly konkrétní aplikaci, která je předmětem zájmu. Například pro správnou tvorbu injekčního hydrogelu in situ je nezbytná vhodná rychlost síťování. Pokud je gelace příliš pomalá, prekurzory pravděpodobně proniknou z místa injekce do okolních tkání, což vede ke špatným vlastnostem hydrogelu a potenciálně k zánětlivé reakci na nezreagované monomery. Pokud je gelace příliš rychlá, může dojít ke smykovému ztenčení (a potenciálně předčasné tvorbě gelu) v injekční stříkačce, což může vést k defektům sítě, které následně ovlivní mechanické vlastnosti gelu a zadržení/uvolnění nákladu (tj. buněk). Kromě toho je pro aplikace v oblasti doručování buněk a regenerativní medicíny klíčová schopnost vytvořit hydrogel v přítomnosti živých buněk a terapeutických proteinů. V následující diskusi bude zdůrazněno několik relevantních technik síťování s nedávnými příklady.

Díky rychlé kinetice síťování a vysoké účinnosti představuje click chemie jednu z nejatraktivnějších tříd síťovacích chemikálií pro tvorbu hydrogelů pro doručování buněk. K tvorbě hydrogelů byly využity běžně používané mědí katalyzované alkyno-azidové klikové reakce;¹⁴ měď však může být cytotoxická a její použití omezuje použitelnost v aplikacích zapouzdřování a doručování buněk. K překonání tohoto problému byly k zesíťování cytokompatibilních hydrogelů využity azid-alkynové cykloadice podporované kmenem (SPAAC). DeForest a Anseth oznámili použití SPAAC pro enkapsulaci fibroblastů v hydrogelu.¹⁵ Autoři ukázali, že když čtyřramenný PEG s koncovou funkcí difluorovaného cyklooctynu reaguje s azidově funkčním peptidovým síťovadlem, kruhové napětí a substituenty fluoru odvádějící elektrony podporují rychlou síťovací reakci (~2 minuty) bez katalyzátoru. V jiném přístupu Dove a spol. nedávno popsali bezkatalytickou reakci azidově funkcionalizovaného chitosanu s PEG funkcionalizovaným kyselinou propionovou za vzniku hydrogelů v přítomnosti buněk.¹⁶ Autoři byli schopni enkapsulovat mezenchymální kmenové buňky během tvorby hydrogelu a ukázali, že enkapsulované buňky vykazují vysokou životaschopnost po 24 hodinách kultivace (>95 %). Tyto a další click reakce, včetně thiol-enů (zejména Michaelovy adice thiolů s maleimidy nebo vinyl-sulfonem), Diels-Alderovy, aldehyd-hydrazinové a oximové reakce, jsou atraktivní pro injekční aplikace hydrogelů. Pro ucelený přehled chemických síťovacích reakcí jsou čtenáři odkázáni na nedávné přehledové články.^3,12,17

Fyzikálně zesíťované injekční hydrogely byly vytvořeny pomocí iontových, hydrofobních, vodíkových vazeb nebo interakcí host-host, nejčastěji pomocí termoreflexních a iontových interakcí.¹⁸ Reis et al. uvedli tvorbu injekčních hydrogelů pomocí termoreaktivního poly(N-isopropylakrylamidu)-g-methylcelulózy (PNIPAAm-g-MC) pro aplikace v tkáňovém inženýrství chrupavky.¹⁹ Tvorby hydrogelu bylo dosaženo pomocí termoreaktivního fázového přechodu polymeru PNIPAAmg- MC, přičemž ke gelaci dochází nad jeho nižší kritickou teplotou roztoku (~32 °C). Zapouzdřené chondrogenní buňky ATDC5 zaujaly zaoblenou morfologii, což podporuje zachování fenotypu chondrocytů, který je pro regeneraci kloubní chrupavky rozhodující. Fyzikální síťování pomocí iontových interakcí se hojně využívá k síťování polysacharidů, jako je alginát a chitosan. Například Xu a kol. enkapsulovali lidské pupečníkové mezenchymální kmenové buňky (hUCMSCs) do injekčních hydrogelů na bázi alginátu pro inženýrství kostní tkáně.²⁰ Gelování alginátu bylo dosaženo zesíťováním s vápníkem, dvojmocným kationtem v přítomnosti hUCMSCs s životaschopností ~70 % po enkapsulaci.

U všech aplikací pro doručování buněk a regeneraci tkání musí hydrogely po injekci řízeně degradovat pro požadované terapeutické použití (např, uvolnění nebo infiltrace buněk, vylučování proteinů) bez vedlejších cytotoxických produktů rozkladu. Typicky lze degradace dosáhnout pomocí štěpitelných polymerních páteří nebo dynamických/reverzibilních příčných vazeb. Jak již bylo uvedeno, přírodní polymery, jako je kyselina hyaluronová a alginát, podléhají enzymatické hydrolýze in vivo, což poskytuje mechanismus pro degradaci hydrogelu. U syntetických polymerů byly hydrogely tradičně konstruovány s esterovými vazbami, jako je poly(kyselina mléčná), pro degradaci esterovou hydrolýzou ve vodném mikroprostředí předem naprogramovaném na základě počtu začleněných esterů. Kromě toho několik výzkumných skupin zkoumalo další citlivé nebo spouštěcí degradovatelné chemie, včetně fotodegradace,²¹ retro Michaelova typu,²² a retro Dielsovy-Alderovy reakce,²³ pro přesnou kontrolu degradace materiálu in situ. Nedávno jsme ve spolupráci s výzkumnou skupinou Kiick dosáhli přesné kontroly nad degradací injekčních hydrogelů vytvořených pomocí thiol-maldeimidové chemie začleněním dvou nebo více způsobů degradace pomocí kombinací těchto chemií.²⁴ Degradace hydrogelu v několika časových škálách bylo dosaženo začleněním: i) o-nitrobenzyl etherové vazby, které podléhají fotodegradaci (k ~ 10^-1 min^.-1 pro 365 nm až 10^-2 min^-1 pro 400-500 nm); ii) sukcinimidové thioetherové vazby na bázi aryl-thiolu, které podléhají retro reakci Michaelova typu v přítomnosti glutathionu (k ~ 10^-3 min^-1); a iii) esterové vazby, které podléhají esterové hydrolýze ve vodném mikroprostředí (k ~ 10^-4 min^-1). V zásadě by takové injekční hydrogely s multimodální degradovatelností mohly být využity k dodávání nebo náboru buněk s přesnou a přizpůsobitelnou kontrolou nad degradací gelu a profily uvolňování pro regeneraci tkání.  

Doručování buněk a regenerace tkání pomocí in situ formovacích hydrogelů

Injekční hydrogely byly použity k doručování různých nákladových molekul, včetně růstových faktorů, chemokinů a terapeutických buněk na podporu regenerace tkání in vitro a in vivo. Tyto in situ tvorné materiály se používají k regeneraci různých tkání, včetně kostí, chrupavek, meziobratlových plotének, tukové, srdeční a cévní tkáně. Zde je uvedeno několik nedávných příkladů injekčních hydrogelů používaných pro regeneraci kostní, chrupavčité a srdeční tkáně. Komplexní přehled této rostoucí oblasti výzkumu naleznete v nedávném přehledovém článku.²⁵

Kost

Řešení kostních defektů a abnormalit je jedním z klíčových problémů v ortopedii. Strategie kostního tkáňového inženýrství využívající injekční hydrogely představují atraktivní alternativu k tradičním způsobům léčby, jako je autologní implantace kosti a materiály pro kostní štěpy, jak ukázaly zásadní práce Hubbella a kol.²⁶ Nedávno Song a kol. zkoumali použití injekčních termoreaktivních hydrogelů na bázi poly(fosfazenu) pro trvalé podávání kostního morfogenetického proteinu-2 (BMP-2) (prod. No. H4791).²⁷ Poly(fosfazen) s dalšími karboxylovými skupinami, které podporují iontové interakce s BMP-2, byly použity k vytvoření hydrogelů po injekci, kde dochází ke gelaci, když se teplota blíží fyziologické teplotě (37 °C). Bylo dosaženo dlouhodobého uvolňování BMP-2 z takových hydrogelů po dobu 20 dnů in vitro a vedlo k výrazně vyšší sekreci osteokalcinu (~14 ng/ml) buňkami C2C12 (prod. č.  91031101) ve srovnání s kontrolou (~2 ng/ml), což naznačuje zachování bioaktivity BMP-2 pro osteoblastickou diferenciaci. Injekce hydrogelů naložených BMP-2 in vivo vedla k ektopické tvorbě kosti u myší, což zdůrazňuje slibnost injekčních hydrogelů pro regeneraci kostí.

Chrupavka

Vzhledem k omezené samoléčebné schopnosti chrupavkových tkání byla vyvinuta řada chirurgických postupů na podporu regenerace chrupavky. Mezi nimi je jednou z nových strategií použití injekčních nebo in situ tvořících se hydrogelů, které dodávají růstové faktory a terapeutické buňky v místě defektu chrupavky.²⁸ Jin a kol. uvedli injekční a biodegradabilní hydrogely tvořené pomocí dextranu a kyseliny hyaluronové pro tkáňové inženýrství chrupavky. Rychlé tvorby hydrogelu (~2 minuty) bylo dosaženo pomocí oxidačního spojení fenolových skupin v přítomnosti křenové peroxidázy (prod. č.  77332) a peroxidu vodíku (H₂O₂, Prod. č.  H3410). Hovězí chondrocyty si během procesu enkapsulace zachovávají vysokou životaschopnost buněk (~95 %) a vykazují zvýšenou produkci glykosaminoglykanu a kolagenu po dobu 21 dnů. U těchto typů oprav je pro přístup k místu tkáně nutný chirurgický zákrok. V důsledku toho byly využity i jiné reaktivní chemické látky, které umožňují rychlou, spouštěnou tvorbu gelu in situ  (např. fotopolymerizované metakrylátové nebo thiol-enové systémy²⁹) a představují aktivní oblast výzkumu pro regeneraci tkání v místech nejednotných defektů. Takové in situ tvořící se hydrogely jsou slibné pro opravu defektů chrupavky.

Kardiovaskulární tkáně

Kardiovaskulární onemocnění jsou další náročnou oblastí, kde injekční hydrogely nabízejí slibné možnosti léčby. K řešení problémů spojených s chronickým infarktem myokardu Park a spol. vyvinuli thiol- enové hydrogely, které využívají akrylovou kyselinu hyaluronovou a peptidový síťovač obsahující thiol citlivý na MMP k modulaci buněčných aktivit směrem k regeneraci tkání.³⁰ Konkrétně chemokin, stromální faktor-1, (SDF-1) (prod. Č. SRP3253 a SRP3276.), který hraje klíčovou roli při reparaci infarktu myokardu, a Ac-SDKP (peptid, který stimuluje proliferaci endoteliálních buněk a angiogenezi) byly začleněny do roztoku hydrogelového prekurzoru. Po injekci do epikardu na modelu infarktu myokardu byly vytvořeny hydrogely s proteinem a po 4 týdnech byly hodnoceny srdeční funkce. Tato hodnocení ukázala, že injekce hydrogelů naložených SDF-1 a SDKP zlepšila funkci komor, zvýšila angiogenezi, zmenšila velikost infarktu (~8 % pro SDF-1/SDKP ve srovnání s ~41 % pro kontrolu) a zvýšila tloušťku stěny (o 211 % větší ve srovnání s kontrolou) v oblasti infarktu. Tyto výsledky ukazují na užitečnost injekčních hydrogelů pro modulaci buněčných funkcí, včetně endogenních buněk, pro regeneraci tkání.

Závěr

V průběhu posledního desetiletí se injekční hydrogely objevily jako slibné biomateriály pro doručování nebo nábor buněk pro podporu regenerace tkání. Významného pokroku bylo dosaženo v konstrukci základních polymerů a síťovacích chemikálií pro tvorbu hydrogelů a štěpných a reverzibilních chemikálií pro degradaci hydrogelů, a to jak v přítomnosti buněk, tak tkání. Tyto přístupy zachovávají bioaktivitu dodaných terapeutických buněk a biologických látek a vedou k pokroku v kvalitě a funkci regenerovaných tkání.

Poděkování

Autoři vděčně děkují za podporu související práce z programu COBRE v Delaware s grantem od Národního institutu všeobecných lékařských věd (NIGMS P20GM104316-02), od Národního institutu zdraví, Burroughs Wellcome Fund a University of Delaware Research Foundation. Děkujeme MediaLab na katedře biochemie Wisconsinské univerzity v Madisonu za použití šablony Adobe Illustrator.

Odkazy

1. Slaughter BV, Khurshid SS, Fisher OZ, Khademhosseini A, Peppas NA. 2009. Hydrogels in Regenerative Medicine. Adv. Mater.. 21(32-33):3307-3329. https://doi.org/10.1002/adma.200802106

2. Munarin F, Petrini P, Bozzini S, Tanzi MC. 2012. New perspectives in cell delivery systems for tissue regeneration: natural-derived injectable hydrogels. JABFM. 2(10):67-81. https://doi.org/10.5301/jabfm.2012.9418

3. Kharkar PM, Kiick KL, Kloxin AM. Designing degradable hydrogels for orthogonal control of cell microenvironments. Chem. Soc. Rev.. 42(17):7335-7372. https://doi.org/10.1039/c3cs60040h

4. Sun JEP, Pochan D. 2015. Peptidic Hydrogels.127-150. https://doi.org/10.1007/978-981-287-152-7_6

5. Burdick JA, Prestwich GD. 2011. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Adv. Mater.. 23(12):H41-H56. https://doi.org/10.1002/adma.201003963

6. Liu Y, Wang R, Zarembinski TI, Doty N, Jiang C, Regatieri C, Zhang X, Young MJ. 2013. The Application of Hyaluronic Acid Hydrogels to Retinal Progenitor Cell Transplantation. Tissue Engineering Part A. 19(1-2):135-142. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2012.0209

7. Burdick JA, Prestwich GD. 2011. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Adv. Mater.. 23(12):H41-H56. https://doi.org/10.1002/adma.201003963

8. Purcell BP, Lobb D, Charati MB, Dorsey SM, Wade RJ, Zellars KN, Doviak H, Pettaway S, Logdon CB, Shuman JA, et al. 2014. Injectable and bioresponsive hydrogels for on-demand matrix metalloproteinase inhibition. Nature Mater. 13(6):653-661. https://doi.org/10.1038/nmat3922

9. Bidarra SJ, Barrias CC, Granja PL. 2014. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10(4):1646-1662. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2013.12.006

10. Kim WS, Mooney DJ, Arany PR, Lee K, Huebsch N, Kim J. 2012. Adipose Tissue Engineering Using Injectable, Oxidized Alginate Hydrogels. Tissue Engineering Part A. 18(7-8):737-743. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2011.0250

11. Munarin F, Petrini P, Bozzini S, Tanzi MC. 2012. New perspectives in cell delivery systems for tissue regeneration: natural-derived injectable hydrogels. JABFM. 2(10):67-81. https://doi.org/10.5301/jabfm.2012.9418

12. Bakaic E, Smeets NMB, Hoare T. Injectable hydrogels based on poly(ethylene glycol) and derivatives as functional biomaterials. RSC Adv.. 5(45):35469-35486. https://doi.org/10.1039/c4ra13581d

13. Phelps EA, Enemchukwu NO, Fiore VF, Sy JC, Murthy N, Sulchek TA, Barker TH, García AJ. 2012. Maleimide Cross-Linked Bioactive PEG Hydrogel Exhibits Improved Reaction Kinetics and Cross-Linking for Cell Encapsulation and In Situ Delivery. Adv. Mater.. 24(1):64-70. https://doi.org/10.1002/adma.201103574

14. Adzima BJ, Tao Y, Kloxin CJ, DeForest CA, Anseth KS, Bowman CN. 2011. Spatial and temporal control of the alkyne?azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nature Chem. 3(3):256-259. https://doi.org/10.1038/nchem.980

15. DeForest CA, Anseth KS. 2011. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nature Chem. 3(12):925-931. https://doi.org/10.1038/nchem.1174

16. Truong VX, Ablett MP, Gilbert HTJ, Bowen J, Richardson SM, Hoyland JA, Dove AP. In situ-forming robust chitosan-poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by copper-free azide?alkyne click reaction for tissue engineering. Biomater. Sci.. 2(2):167-175. https://doi.org/10.1039/c3bm60159e

17. Nimmo CM, Shoichet MS. 2011. Regenerative Biomaterials that ?Click?: Simple, Aqueous-Based Protocols for Hydrogel Synthesis, Surface Immobilization, and 3D Patterning. Bioconjugate Chem.. 22(11):2199-2209. https://doi.org/10.1021/bc200281k

18. Wang H, Heilshorn SC. 2015. Adaptable Hydrogel Networks with Reversible Linkages for Tissue Engineering. Adv. Mater.. 27(25):3717-3736. https://doi.org/10.1002/adma.201501558

19. Sá-Lima H, Tuzlakoglu K, Mano JF, Reis RL. 2011. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-g-methylcellulose hydrogel as a three-dimensional extracellular matrix for cartilage-engineered applications. J. Biomed. Mater. Res.. 98A(4):596-603. https://doi.org/10.1002/jbm.a.33140

20. Zhao L, Weir MD, Xu HH. 2010. An injectable calcium phosphate-alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering. Biomaterials. 31(25):6502-6510. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2010.05.017

21. Kloxin AM, Kasko AM, Salinas CN, Anseth KS. 2009. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324(5923):59-63. https://doi.org/10.1126/science.1169494

22. Baldwin AD, Kiick KL. Reversible maleimide?thiol adducts yield glutathione-sensitive poly(ethylene glycol)?heparin hydrogels. Polym. Chem.. 4(1):133-143. https://doi.org/10.1039/c2py20576a

23. Koehler KC, Anseth KS, Bowman CN. 2013. Diels?Alder Mediated Controlled Release from a Poly(ethylene glycol) Based Hydrogel. Biomacromolecules. 14(2):538-547. https://doi.org/10.1021/bm301789d

24. Kharkar PM, Kloxin AM, Kiick KL. Dually degradable click hydrogels for controlled degradation and protein release. J. Mater. Chem. B. 2(34):5511-5521. https://doi.org/10.1039/c4tb00496e

25. Bae KH, Wang L, Kurisawa M. 2013. Injectable biodegradable hydrogels: progress and challenges. J. Mater. Chem. B. 1(40):5371. https://doi.org/10.1039/c3tb20940g

26. Lutolf MP, Lauer-Fields JL, Schmoekel HG, Metters AT, Weber FE, Fields GB, Hubbell JA. 2003. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100(9):5413-5418. https://doi.org/10.1073/pnas.0737381100

27. Seo B, Choi H, Koh J, Song S. 2015. Sustained BMP-2 delivery and injectable bone regeneration using thermosensitive polymeric nanoparticle hydrogel bearing dual interactions with BMP-2. Journal of Controlled Release. 20967-76. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2015.04.023

28. Johnstone B, Alini M, Cucchiarini M, Dodge G, Eglin D, Guilak F, Madry H, Mata A, Mauck R, Semino C, et al. Tissue engineering for articular cartilage repair ? the state of the art. eCM. 25248-267. https://doi.org/10.22203/ecm.v025a18

29. Lin C, Ki CS, Shih H. 2015. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J. Appl. Polym. Sci.. 132(8):n/a-n/a. https://doi.org/10.1002/app.41563

30. Song M, Jang H, Lee J, Kim JH, Kim SH, Sun K, Park Y. 2014. Regeneration of chronic myocardial infarction by injectable hydrogels containing stem cell homing factor SDF-1 and angiogenic peptide Ac-SDKP. Biomaterials. 35(8):2436-2445. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.12.011