qPCR
Bei der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) werden fluoreszente Reportermoleküle eingesetzt, um die Quantifizierung der amplifizierten Produkte zu ermöglichen. Wie bei der konventionellen PCR wird ein DNA-, cDNA- oder RNA-Template amplifiziert, jedoch werden in jedem Zyklus Fluoreszenzsignale zur relativen oder absoluten Quantifizierung überwacht.
Diese Methode ist für zahlreiche Forschungsbereiche nützlich, wie z.B. Genespressionsanalyse, Genotypisierung, mikroRNA-Analyse, genetische Variationsanalyse und Proteinanalyse.
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein wichtiges Verfahren in molekularbiologischen Laboren. Die PCR wird zur Vervielfältigung von DNA um mehrere Größenordnungen eingesetzt und unsere Reagenzien und Ressourcen eignen sich für zahlreiche Forschungsabläufe, darunter Genexpressionsanalysen, Genotypisierung, Sequenzierung und Mutageneseanwendungen.
Methoden und Protokolle für die zuverlässige molekulare Klonierung und robuste Proteinexpression von Insekten-, Bakterien- und Säuger-Proteinexpressionsvektoren.
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Analyse von qPCR-Daten
Die Fluoreszenz des Reportermoleküls wird gemessen und quantifiziert; üblicherweise handelt es sich dabei um Farbstoffe (z.B. SYBR® Green, Ethidiumbromid), die sich zwischen den Basen in doppelsträngiger DNA einlagern, oder um Sonden (z.B. Molecular Beacons, TaqMan® Sonden), die eine spezifische Sequenz auf der DNA binden.
Relative Quantifizierung von qPCR-Daten
Es gibt zwei wesentliche Quantifizierungsmethoden für qPCR-Daten. Die relative Quantifizierung ist die gebräuchlichere Methode und nutzt ΔΔCt-Informationen, anhand derer das Expressions- oder Abundanzverhältnis des Zielgens in der Probe bestimmt, mit einem Kontrollgen verglichen und mit dem Expressionsverhältnis eines Referenzgens normalisiert wird. Da die Effizienz(E)-Werte für Ziel- und Referenzgene unterschiedlich sind, berücksichtigt diese Methode auch die Unterschiede bei den E-Werten. Diese Methode wird häufiger bei der Genexpressionsanalyse eingesetzt.
Absolute Quantifizierung von qPCR-Daten
Die zweite Methode, die absolute Quantifizierung, ist in der Umweltmikrobiologie gebräuchlicher. In ihr wird die Standardkurve (SK) genutzt. Bei der SK-Methode wird anhand einer Verdünnungsreihe mit bekannter Templatekonzentration (N0) eine Standardkurve mithilfe der linearen Regression von log(N0) gegenüber dem CT-Wert (Schwellenwert) erstellt. Daraus werden dann die Templatekonzentrationen der Probe berechnet. Dieser Methode liegt zugrunde, dass der Effizienzwert der Probe und der Effizienzwert des Standards gleich sind.
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