Protein-Massenspektrometrie

Die Protein-Massenspektrometrie wird weitverbreitet zur Analyse biologischer Proben für die Entdeckung von Biomarkern, in der Proteomforschung und klinischen Anwendungen eingesetzt. Im Vergleich zu anderen Verfahren, die für die Charakterisierung von Proteinen im großen Maßstab verwendet werden, ist die Massenspektrometrie aufgrund ihrer Eignung für komplexe Analysen zu einem primären Werkzeug in der Proteomik geworden.

Die Massenspektrometrie wird für den quantitativen Nachweis und die Charakterisierung von Proteinen auf der Grundlage ihrer Struktur, posttranslationaler Modifikationen und Interaktionen eingesetzt.

Die Identifizierung von Proteinen umfasst typischerweise den chemischen oder enzymatischen Aufschluss von Proteinen zu Peptiden, die dann massenspektrometrisch analysiert und mit rechnergestützten Methoden oder durch Sequenzierung identifiziert werden.
Posttranslationale Modifikationen können durch Veränderungen in der Masse der Aminosäurerückstände identifiziert werden. Modifikationsstellen können mit Hilfe von Sequenzierungs- oder Berechnungsverfahren abgebildet werden.
Für die Glykananalyse und -profilierung werden enzymatische oder chemische Methoden zur Freisetzung von Glykananteilen aus Glykoproteinen verwendet, gefolgt von der Derivatisierung der freigesetzten Glykane für die Massenspektrenanalyse.
Proteininteraktionen werden durch Co-Affinitätsreinigung eines spezifischen Zielproteins mit allen interagierenden Proteinen bestimmt oder globaler durch Größenausschluss oder Ionenaustauschchromatographie vor der Analyse durch Massenspektrometrie untersucht.

Für die quantitative Proteomik können Proteine oder Peptide chemisch mit stabilen Isotopen mittels Tandem-Massenmarkierung (TMT) und iTRAQ oder metabolisch durch Einbau markierter Aminosäuren (SILAC) markiert werden. Der Vergleich der Einbindung schwerer und leichter Isotope ermöglicht eine relative Quantifizierung durch Korrelation von Massenspektren-Peak-Intensitäten mit Proteinhäufigkeiten. Für die absolute Quantifizierung können Proben mit isotopenmarkierten synthetischen Peptid- oder Proteinstandards für die Analyse der ausgewählten Reaktionsüberwachung (SRM) aufgestockt werden.

Bei der Protein-Massenspektrometrie werden die Massen verschiedener Proteine und Peptide durch Messung des m/z (Masse-zu-Ladung)-Verhältnisses ihrer Ionen in der Gasphase bestimmt. Massenspektrometer wandeln zunächst mit Hilfe einer Ionenquelle Proteinmoleküle in Gasphasen-Ionen um. Danach trennt ein Massenanalysator ionisierte Analyten auf der Grundlage des m/z-Verhältnisses. Ein Detektor zeichnet dann die Anzahl der Ionen bei jedem m/z-Wert auf. MALDI und Elektrospray-Ionisation (ESI) werden häufig zur Ionisierung von Peptiden oder Proteinen verwendet.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

MALDI ist eine Ionisierungsmethode, in der eine Laserenergie absorbierende Matrix verwendet wird, um Ionen mit minimaler Fragmentierung von Proteinmolekülen zu erzeugen. Die Probe wird zunächst mit einem geeigneten Matrixmaterial gemischt. Danach wird die Probe mit einem Impulslaser bestrahlt und damit Ablation und Desorption der Probe und des Matrixmaterials ausgelöst. Die Analytmoleküle werden dann vor der massenspektrometrischen Analyse durch Protonierung oder Deprotonierung in den ablatierten Gasen ionisiert.

Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) werden Ionen mit Hilfe eines Elektrosprays erzeugt, bei dem eine Hochspannung an die flüssige Probe angelegt wird, um ein Aerosol zu erzeugen, wodurch Ionen mit minimaler Fragmentierung von Peptiden und Proteinen erzeugt werden. Die Elektrospray-Ionisation wird häufig bei der Kopplung der Massenspektrometrie mit der Flüssigkeitschromatographie (LC-MS) verwendet, da das Eluat der Flüssigkeitschromatographie direkt einem Elektrospray zur Tandemverarbeitung zugeführt werden kann.

Workflow

Probenvorbereitung für die Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie

Proteinprobenvorbereitung

Die Vorbereitung von Proteinproben für die Massenspektrometrie erfordert eine Zelllyse oder eine Proteinsolubilisierung und -stabilisierung. Für die Proteomanalyse werden Zellen mit Puffern lysiert, die die Zellmembran mit Protease-Inhibitoren aufbrechen, um den Proteinabbau zu verhindern. Hochabundante Proteine werden bei Bedarf entfernt. Gewinnung und Anreicherung ausgewählter Fraktionen erleichtern die Proteomanalyse.

Aufreinigung von Serumpeptiden für die Massenspektrometrie

Ortsspezifische Proteolyse von Proben für die Protein-Massenspektrometrie

Aufschluss und Markierung

Ortsspezifische Proteasen wie Trypsin werden zur Spaltung von Proteinen in kleine Fragmente verwendet, um eine Identifizierung zu ermöglichen, indem experimentelle Spektren mit theoretischen Spektren aus Proteindatenbanken abgeglichen oder mit Laufstandards verglichen werden. Für die relative Quantifizierung können Zellkulturen metabolisch mit stabilen Isotopen markiert werden, die durch Zufuhr von Aminosäuren aufgenommen wurden, oder es können Proben unter Einsatz chemischer Verfahren mit stabilen Isotopen markiert werden. Das Aufstocken von Proben mit isotopenmarkierten synthetischen Peptiden ermöglicht eine absolute Quantifizierung durch die Analyse der ausgewählten Reaktionsüberwachung (SRM).

Verwendung von Kalibratoren und Standards für die Protein-Massenspektrometrie

Kalibrierung und Standardisierung bei der Protein-Massenspektrometrie

Kalibrierstandards können als Kontrollen für die Probenanalyse dienen und zur Bestimmung der Proteinidentität, der Testempfindlichkeit, der Aufschliusseffizienz und als Hilfsmittel bei der chromatographischen Trennung und quantitativen Analyse verwendet werden.

Kopplung von Tandemchromatographie mit Protein-Massenspektrometrie

Chromatographische Trennung

Die Chromatographie ermöglicht die Trennung von Proteinen und Peptiden in Proben, die in der Analyse leichter handzuhaben sind. Da mehrere unterschiedliche Peptide ähnliche Massen haben können, wird die HPLC häufig verwendet, um die gleichzeitige Zugabe von Peptiden mit sehr ähnlichen oder identischen Massen zum Massenspektrometer zu verhindern und so den Gesamtdynamikbereich von Messungen zu erhöhen.

Nachweis und Analyse

Proteine und Peptide werden vor Nachweis und Analyse mittels MALDI oder ESI ionisiert. In einem Massenanalysator werden die Ionen anhand ihrer m/z-Werte unterschieden. Daraus resultierende Fragmentierungsmuster können für die Identifizierung verwendet und Proben relativ durch Auswertung von Peak-Intensitätsverhältnissen von Proben, die durch Isotopenmarkierung differenziert wurden, oder absolut durch SRM-Analyse mit markierten internen Standards quantifiziert werden.

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