主页应用蛋白生物学裂解和蛋白提取

裂解和蛋白提取

人细胞

当纯化蛋白用于功能或结构研究,或用于制备处理和生产时,首先要做的是破坏细胞或组织从而获取其中的目标蛋白。细胞裂解和蛋白质溶解是进行有效分析和高效处理的关键步骤。提取方法包括酶法、化学法、机械法或几种方法的联合使用。


相关技术文章

  • MilliporeSigma为研究人员和学生提供的磷酸酶抑制剂混合物信息。磷酸化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰。
  • 在细胞裂解、膜蛋白和脂质增溶、蛋白结晶或蛋白质免疫印迹应用中更有效地使用去垢剂。
  • 裂解酶提供了一种非机械式细胞裂解和原生质体准备方法。这看上去是个非常简单的过程:只需加入酶,将试管放入水浴然即可。但这过程中到底发生了什么?
  • 稳定完全、均匀的组织匀浆。使用Stabilyser试剂维持RNA和功能蛋白质的稳定性,它是在一种均一裂解物混合物中保护核酸和活性蛋白完整性的唯一一种试剂。
  • 我们的酵母细胞裂解试剂具有通用性、无磷酸盐、非变性等特点。CelLytic Y细胞裂解试剂可作为酵母细胞裂解和蛋白溶解的有效方法。CelLytic Y酵母酶解试剂盒为从酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母酵母菌株中高效形成原生质球和提取蛋白提供了一种便捷的方法。
  • 查看完整内容

相关实验方案


许多方法可用于破坏细胞、制备​​其内含物进行分析。通常,当样品由易于裂解的培养细胞或血细胞组成时,采用温和的方法;如要破坏更坚固的细菌或植物细胞,或嵌入结缔组织的哺乳动物细胞,则采用更有力的方法。

  • 表面活性剂溶解法:基于去污剂的裂解:去污剂裂解是一种比较温和的方法,适用于哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母和植物。细胞悬浮液轻轻离心后重悬于含有去污剂的裂解液中,去污剂可用于破坏细胞膜。溶解细胞膜,裂解细胞并释放其内容物。若去污剂会干扰分析或生产,需在下游处理时除去去污剂。
  • 冻融裂解法:本方法适用于哺乳动物或细菌细胞悬浮液。用液氮快速冷冻细胞悬浮液。然后将样品解冻,用移液管或在裂解缓冲液中温和涡旋将其重悬,重复此过程数次。在循环之间,将样品离心,保留含有可溶蛋白的上清液。
  • 渗透压休克法:这是一种非常温和的方法,可以在不使用表面活性剂的情况下裂解悬浮的哺乳动物或细菌细胞。本方法通常与机械破碎技术结合,依赖于从高渗透性介质到低渗透性介质的变化,非常适合于后续将裂解物分馏成亚细胞组分的应用。
  • 超声破碎法:这种蛋白质提取方法最常用于细胞悬浮液。通过插入样品中的探针,细胞被高频声波破坏。声波产生低压区域,导致细胞膜破裂。
  • 机械破碎技术:可以使用各种粗略但有效的“破碎和研磨”措施从细胞和组织中提取蛋白。例如,可以使用Dounce或Potter-Elvehjem匀浆法运用液体剪切力破坏细胞膜。使用Waring搅拌器或Polytron®匀浆器在冷却的缓冲液中切碎或碾碎组织,将组织均质化。在液氮中冷冻组织或细胞,加入氧化铝或沙子用研钵和研杵一起研磨成细粉。快速搅动细胞和小玻璃珠会破坏细胞壁,对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效。
  • 酶解法:酶解法从夹杂在纤维组织中的细菌,酵母或真核细胞中提取蛋白质时,经常使用酶促方法,在这些组织中,细胞膜被坚固的保护结构所包围。溶菌酶(Lysozyme)、变溶菌素(Mutanolysin)、MetaPolyzyme六酶混合物、Lysonase和链霉蛋白酶(Pronase)等细胞裂解酶或混合液可联合组织消化酶(即胶原酶、软骨素酶、透明质酸酶),用于溶解或破坏单独的机械方法无法轻易裂解的细胞壁、外壳、荚膜、衣壳等结构。酶解之后,通常在裂解缓冲液中进行均质化、超声处理或剧烈涡旋处理。

此外,由于细胞破裂后释放内源性蛋白酶和磷酸酶并降解靶蛋白,因此应在细胞破裂期间和随后的纯化过程中,使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂保护样品,避免靶蛋白不受控制地损失。