转化是分子克隆中的一步关键过程,通过它可产生多个拷贝的重组DNA分子。能够吸收游离的细胞外遗传物质的能力是采用细菌感受态细胞进行转化的前提。目的在于获得重组质粒上目标序列的复制。

转化

图 1.转化

开始转化之前:

  • 准备LB琼脂板并使其凝固。如果使用预先灌装板,请确保将板加热至37 °C。
  • 根据质粒DNA中存在的抗生素标记,在LB琼脂中加入适当的抗生素。
  • 如果需要对重组体进行蓝/白筛选,则在LB琼脂中加入1 mM IPTG、300 μg/mL S-Gal或40 μg/mL X-Gal以及500 μg/mL柠檬酸铁铵。
  • 如果使用电转感受态细胞,请将电穿孔室置于冰上。
  • 将水浴加热至37 °C。
  • 将无菌SOC培养基加热至室温(或在水浴中升温至20-25 °C)。

使用化转感受态细胞转化的实验方案

所需材料(未提供):

标准转化实验方案

  1. 将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要,额外取用一个试管用于对照DNA。
  2. 让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
    1. 对于对照:将1 μL(10 ng)pUC19对照DNA加入一个试管中。轻弹试管以便混合,并置于冰上。
    2. 将1 ng至50 ng纯化的质粒DNA直接加入其余试管的细胞中。轻弹试管以便混合,并置于冰上。
  3. 将细胞在冰上孵育30分钟。
  4. 将细胞转移到37°C水浴中静置刚好45秒。
  5. 将细胞转移至冰上静置2分钟。
  6. 将SOC培养基添加到每个试管中。将细胞转移到无菌聚丙烯试管中,并松开盖子以便培养物通气。
  7. 将细胞在摇床培养箱(225-250 rpm)上于37℃孵育1小时。
  8. 移取10-100 μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上,并用无菌涂布器涂抹。
  9. 将板在37℃孵育过夜。
  10. 根据需要选择一个(多个)菌落和培养物。
  11. 从每种培养物中分离质粒DNA。
  12. 培养优选的克隆。
  13. 使用限制酶消化质粒DNA,用凝胶电泳分离。

使用电转感受态细胞转化的实验方案

所需材料(未提供):

标准转化实验方案

  1. 将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要,额外取用一个试管用于对照DNA。
  2. 让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
  3. 将SOC培养基转移至培养管中,每个转化反应一个管,并置于室温下。

    (SOC培养基的体积取决于下一步中将要添加的细胞体积。感受态细胞和SOC培养基的最终体积应为1000μL。)
  4. 将1 mm标准比色皿和无菌微量离心管置于冰上,每个转化反应配一套。
  5. 将感受态细胞转移到冷冻的微量离心管中。使用来自80 μL包装的40 μL细胞以及来自100 μL包装的50 μL细胞。
    1. 对于对照:将1 μL的1至5倍稀释的pUC19对照DNA添加至一个试管中。
    2. 在TE缓冲液中制备DNA或Ligation Mix的1至5倍的稀释液。添加至微量离心管中。
  6. 将DNA和细胞混合物移液到冷冻的1 mm比色皿中。
  7. 将电穿孔仪设置为25 kV/cm的场强6ms,并处理细胞。
  8. 从比色皿中取出细胞,添加至含有SOC培养基的试管中。
  9. 将细胞在摇床培养箱(225-250 rpm)上于37℃孵育1小时。
  10. 移取10-100 μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上,并用无菌涂布器涂抹。
  11. 将板在37 ℃孵育过夜。
  12. 根据需要选择一个菌落和培养物。
  13. 从每种培养物中分离质粒DNA。
  14. 使用限制酶消化质粒DNA,用凝胶电泳分离。
  15. 培养优选的克隆。

优化转化过程的重要提示:

  • 确认收到时细胞仍处于冷冻状态,且仍然有干冰。
  • 为了获得最大的转化效率,请使用不含苯酚、乙醇、蛋白质、盐或去垢剂的优质DNA样品。使用电转感受态细胞时,DNA中的高盐含量会导致高压电弧,这可能会损坏样品和设备。
  • 含有优质试剂的连接反应中的DNA可用于转化。DNA连接酶不需要灭活。
  • 始终将感受态细胞保持在冰上,防止细胞意外升温。
  • 轻弹培养管以获得均匀的细胞悬浮液。请勿使用涡旋或移液器混合。
  • 将LB琼脂板温热至37 °C,以获得最佳的菌落生长。
  • 使用电转感受态细胞进行转化的电穿孔仪设置:
    • BTX Model ECM 630:HV模式,2.5 kV,25 μF,100 Ω,1 mm比色皿
    • BioRad基因脉冲发生器:2.5 kV,25 μF,100 Ω,1 mm比色皿
材料
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参考文献

1.
Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.
2.
Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu.Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. http://dx.doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217
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Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. http://dx.doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994