克隆和表达

哺乳动物细胞中的重组蛋白表达

哺乳动物细胞中的重组蛋白表达

不同领域的研究人员用克隆和基因表达技术研究广泛的生物学问题,包括理解基因功能、分子通路分析、胚胎发育、疾病研究以及生物制剂和药物的生物处理过程等,不一而足。一旦确定基因或遗传序列,研究人员必须根据特定的应用需求选择最佳的分子克隆策略和基于细胞的蛋白表达系统。有关使用CRISPR技术进行基因表达或使用RNAi试剂使基因沉默的更多信息,请访问:gene expression and gene silencing page


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相关实验方案


蛋白表达载体

质粒或蛋白表达载体是环状的DNA片段,含许多功能成分,可用于克隆和表达目的蛋白。选择合适的表达载体部分取决于蛋白类型、将要表达蛋白的微生物以及研究人员要解决的具体应用和科学问题。可用的表达载体种类繁多,研究人员可以选择最适合其研究的克隆片段、克隆选择和蛋白表达成分。一旦选定目的基因序列和表达载体,研究人员通常使用核酸酶在特定位点精确切割载体,使目的基因序列在框内克隆,最终在宿主微生物中表达。重要的是,研究人员通常会使用化学感受态细胞和细菌转化来宿主重组DNA质粒,因为它们在-70°C下冷冻保存时是稳定的。

如何转染细胞

细胞转染是指将DNA、RNA或蛋白引入真核细胞的过程。研究人员可以使用各种物理、化学和生物技术来完成这一部分蛋白表达工作流程。通常使用物理方法(例如电穿孔法)、化学方法(包括使用磷酸钙(CaPi)、聚乙烯亚胺(PEI)和脂质转染试剂)。科学家还可以使用病毒转导系统,包括慢病毒,肿瘤逆转录病毒和腺病毒。不过,出于生物安全原因,使用病毒递送方法通常需要额外的控制和监控措施。

蛋白表达系统

研究人员使用各种微生物表达其目的蛋白。他们通常使用细菌,因为细菌可以有效地吸收表达载体、快速倍增,并且可以在最佳条件下产生大量重组蛋白。然而,由于细菌是原核生物,无法提供某些蛋白所需的蛋白翻译后修饰。真核细胞(包括酵母细胞和哺乳动物细胞系),有助于蛋白的翻译后修饰,也被研究人员普遍使用。选择重组蛋白表达的最佳细胞系和蛋白表达策略很大程度上取决于特定的应用需求和科学家需要解决的问题。