형광 동소 교잡법(FISH)

시약 및 장비

1. 20x saline-sodium citrate buffer(SSC: 3 M NaCl, 0.3 M 구연산나트륨, pH 7 또는 제품 S6639번)
2. 2x SSC 내 RNase A(제품 R4642번) 100 µg/mL
3. 10 mM HCl 내 펩신(제품 P6887번) 40 units/mL
4. 파라포름알데히드, EM 등급(제품 P6148번), 물에서 신선하게 해중합(4% w/v)
5. 에탄올
6. 표지 프로브. 플라스미드 DNA는 새김눈 번역 랜덤 프라이밍 또는 A3803(예: ADVANCE™ Nick Translation Kit)를 사용하여 biotin-11-dUTP로 표지됩니다.
7. 혼성화 혼합 용액: 2x SSC 내 50% 포름아미드(제품 F7508번), 10% 덱스트란황산(제품 D8906번), 0.1% SDS(제품 L4390번), 0.5~1.5 ng/µL 표지 프로브 및 300 ng/mL 연어 정자 DNA(제품 D7656번)
8. 세척 버퍼: 0.1x SSC 내 20% 포름아미드(제품 F7508번)
9. 검출 버퍼: 4x SSC 내 0.2% Tween 20(제품 P1379번)
10. 차단 버퍼: 검출 버퍼 내 5% 소 알부민(제품 A3803번)
11. 차단 버퍼 내 항체 또는 검출 화합물(예: Streptavidin-Cy3, 제품 S6402번)
12. 안티페이드 봉입제 내 DAPI(제품 D9542번) 2 µg/mL.
13. 형광 현미경, 필터 및 옵션 삼중 대역 통과 필터(x58, Omega Optics)
14. 유리 슬라이드(제품 S8400번)
15. 배양 단계 및 교잡 단계용 플라스틱 커버 슬립(오토클레이브 쓰레기 봉투에서 절단, 예: 제품 B4408번)
16. 히트 블록/수정된 서모사이클러
17. 세척 단계용 Coplin 용기(제품 S6016번, S5641번 또는 S5891번)

절차

슬라이드 준비
혼성화
검출

슬라이드 준비

1. 임의의 세포 유형으로 염색체 준비를 시작합니다.
2. 37 °C에서 1시간 동안 200 µL RNase로 배양합니다.
3. 2x SSC에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 반복합니다.
4. 10 mM HCl에서 슬라이드를 헹굽니다.
5. 37 °C에서 10분 동안 200 µL 펩신으로 배양합니다.
6. 탈염 H₂O에서 슬라이드를 헹굽니다.
7. 2x SSC에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 반복합니다.
8. 파라포름알데히드에서 10분 동안 슬라이드를 안정화합니다.
9. 2x SSC에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 반복합니다.
10. 에탄올 70 %, 80 %, 95 %에서 각각 2분 동안 슬라이드를 탈수합니다.
11. 공기 건조합니다.

혼성화

1. 슬라이드당 30 µl 혼성화 용액을 준비합니다. 10분 동안 70 °C까지 가열하고 얼음 위에 놓습니다.
2. 각 슬라이드에 30 µl의 혼성화 용액을 놓고 플라스틱 커버 슬립으로 덮습니다.
3. 히트 블록에서 5분간 65-70 °C에서 슬라이드를 변성시킵니다.
4. 점차적으로 온도를 37 °C까지 낮춥니다.
5. 항습기에서 밤새 37 °C로 혼성화합니다.

검출

1. 2x SSC에서 슬라이드를 세척해 커버슬립을 제거합니다.
2. 5분 동안 40 °C의 세척 버퍼에서 슬라이드를 세척합니다. 반복합니다.
3. 40 °C의 0.1x SSC에서 5-15분 동안 슬라이드를 세척합니다.
4. 40 °C의 2x SSC에서 5-15분 동안 슬라이드를 세척합니다.
5. 실온까지 슬라이드를 식힙니다.
6. 검출 버퍼에서 5분 동안 슬라이드를 안정화합니다.
7. 차단 버퍼에서 20-30분 동안 차단합니다.
8. 50 µl 항체 또는 검출 화합물로 30-60분 동안 배양합니다(예: 차단 버퍼 내 5 µg/ml Streptavidin-Cy3).
9. 2x SSC에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. 2회 반복합니다.
10. DAPI 용액으로 10분 동안 대조 염색합니다.
11. 짧게 헹구고 안티페이드 봉입제에서 봉입합니다.
12. 형광 현미경으로 분석합니다.
    

제품

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참고문헌

1. Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.

2. Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.

3. Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.