Blue-White 스크리닝 및 Colony Selection군집 형성 프로토콜

재조합형 세균 식별

Blue-White 스크리닝은 재조합형 세균 식별을 위한 빠르고 효율적인 기법입니다. 이 방법은 대장균에서 발생하는 효소인 β-갈락토시다아제의 활성에 의존하며, 이 효소는 락토오스를 포도당과 갈락토오스로 분리합니다.

LacZ 유전자 교란

주변 환경에 락토오스가 존재하면 대장균의 LacZ 오페론(operon)이 트리거됩니다. 이 오페론 활동은 락토오스를 대사시키기 위한 β-갈락토시다아제 효소를 생성하는 결과를 가져옵니다. 대부분의 플라스미드 벡터는 β-갈락토시다아제의 첫 146개의 아미노산에 대한 코딩 정보를 포함하는 lacZ 유전자의 짧은 부분을 가지고 있습니다. 사용된 숙주 대장균 균주는 lacZΔM15 삭제 돌연변이를 포함하는 유능한 세포입니다. α-보완 프로세스로 인해 플라스미드 벡터가 그러한 세포에 의해 점유되면 기능적인 β-갈라토시다아제 효소가 생성됩니다.

복제에 사용되는 플라스미드 벡터는 이 α-보완 프로세스가 재조합의 마커 역할을 하도록 조작됩니다. MCS(다중 복제 부위)는 플라스미드 벡터의 lacZ 시퀀스 내에 존재합니다. 이 염기서열은 외부 DNA를 삽입하기 위해 제한 효소에 의해 잘려나갈 수 있습니다. 외래 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터가 숙주 대장균에 의해 흡수될 때, α-보완이 일어나지 않으므로 기능적 β-갈락토시다아제 효소는 생성되지 않습니다. 외래 DNA가 벡터에 삽입되지 않거나 MCS가 아닌 다른 위치에 삽입되면 플라스미드 벡터의 lacZ 유전자가 숙주 대장균의 lacZ 삭제 돌연변이를 보완해 기능성 효소를 생성합니다.

Blue-White 스크리닝은 어떤 방법으로 작동합니까?

재조합형 DNA를 포함하는 클론을 선별하기 위해 X-gal이라고 알려진 색소성 기질을 한천 플레이트에 첨가합니다. β-갈락토시다아제가 생성되면 X-gal은 가수분해되어 5-bromo-4-chloro-indoxyl를 형성하며, 이는 자연적으로 희미해져 5,5’-dibromo-4,4’-dichloro-indigo라고 불리는 불용성 푸른 색소를 생성합니다. 비재조합 세포에 의해 형성된 군집은 파란색으로 나타나는 반면 재조합형 세포는 흰색으로 나타납니다. 원하는 재조합 집단을 쉽게 선택하고 배양할 수 있습니다.

IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)는 X-gal과 함께 Blue-White 스크리닝에 사용됩니다. IPTG는 lacZ 유전자의 발현을 유도하는 갈락토오스의 비대사성 유사형(analog)입니다. IPTG는 β-갈락토시다아제의 기질이 아니라 유도자일 뿐이라는 점에 유의해야 합니다. 육안 검사를 위해서는 X-gal과 같은 색소성 기질이 필요합니다.

그림 1. Blue-White 스크리닝에 사용할 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터를 개략적으로 표현한 것입니다.

그림 2. 일반적인 Blue-White 스크리닝 절차를 개략적으로 표현한 것입니다.

Blue-White 스크리닝 제품(재료)

제품 번호	이름	용해도	조치	응용분야	특수사항
B6650	X-GlcA	DMF	Substrate for ß-galactosidase and ß-glucuronidase	gene detection screening of recombinant bacteria	blue-white screening
16658	X-GalNAc	DMF, DMSO	Substrate for N-acetyl-ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria and Candida albicans	blue-white screening
S7313	S-Gal® sodium salt	Water	Substrate for ß-galactosidase	gene detection screening of recombinant bacteria	blue-white screening autoclavable enhanced contrast for automated colony counting
S9811	S-Gal®	Water	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening autoclavable enhanced contrast for automated colony counting
C4478	S-Gal®/LB Agar Blend	Water	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening autoclavable enhanced contrast for automated colony counting has added IPTG
B2904	Bluo-Gal	DMF	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening no sterilization required
B3928	Blue-White Select™ Screening Reagent	Ready-to-use solution	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	Blue-White 스크리닝
16669	Magenta-Gal	DMF, DMSO	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	red-white screening
B8931	Magenta-Gal	Methanol	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	red-white screening
B4252	5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside	DMF, DMSO	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening can be used for immunocytochemistry no sterilization required
B9146	5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside	DMF, DMSO	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening no sterilization required
B6024	5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside(tablet)	DMF, DMSO	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening no sterilization required
16665	5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside	DMF, DMSO	Substrate for ß-galactosidase	screening of recombinant bacteria	blue-white screening no sterilization required
I1284	Isopropyl ß-D-thiogalactopyranoside solution	Ready-to-use solution	Induces Lac promoter	screening of recombinant bacteria	blue-white screening can be added to culture media
I6758	Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Water	Induces Lac promoter	screening of recombinant bacteria	blue-white screening
I5502	Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside	Water	Induces Lac promoter	screening of recombinant bacteria	blue-white screening

blue-white screening을 위한 프로토콜

blue-white screening을 위한 전체 프로토콜에는 다음 3가지 중요한 단계가 포함됩니다.

• 접합: 플라스미드 벡터의 MCS에 대한 외래 DNA의 결합
• 변환: 유력한 대장균에 외부 DNA 삽입을 포함한 플라스미드 벡터 도입
• 선별: 재조합형 세균 군집 식별을 위한 청백 선별법

접합

머크는 일과성 발현 체계뿐만 아니라 안정적 발현 체계에도 사용할 수 있는 다음과 같은 즉시 사용 가능한 발현 벡터를 공급합니다. 이 FLAG-융합 구조는 박테리아 세포와 포유류 세포 모두에서 번식하기 위한 복제개시점을 가지고 있습니다.

제품 번호	이름	호환성
E6783	pFLAG-CMV™-3 Expression Vector	Bacteria, mammalian cells
E7658	p3XFLAG-CMV™-10 Expression Vector	Bacteria, mammalian cells
E7283	p3XFLAG-myc-CMV™-26 Expression Vector	Bacteria, mammalian cells
E9033	pFLAG-Myc-CMV™-22 Expression Vector	Bacteria, mammalian cells
E6908	pFLAG-CMV™-5.1 Expression Vector	Bacteria, mammalian cells
E9408	p3xFLAG-Myc-CMV™-25 Expression Vector	Bacteria, mammalian cells
FLMAS	Mammalian Amino-terminal FLAG Stable Expression Kit	Bacteria, mammalian cells
E8158	pFLAG-ATS™ Expression Vector	Bacteria
E8408	pFLAG-CTC™ Expression Vector	Bacteria
D3404	pUC19 plasmid DNA from E. coli RRI	Bacteria
D4154	pUC18 plasmid DNA from E. coli RRI	Bacteria

필요한 재료

시약	장비
T4 DNA ligase buffer (KEM0049B)	PCR reaction tubes
Plasmid vector	Thermo cycler (optional)
Insert (foreign DNA)	PCR clean-up column(NA1020)
T4 DNA ligase(KEM0020, KEM0019)
Sterile, nuclease-free water

다음은 접합에 대한 반응 설정입니다.

구성 요소	부피(µL)	최종 농도
T4 DNA ligase buffer	2	1X
Vector	x	1-10 ng/µL
Insert	x	1-10 ng/µL
T4 DNA ligase	1	6 U/µL
Sterile water	x	NA
Total volume	20

• 위의 모든 구성 요소를 깨끗한 반응 튜브에 추가합니다.
• 25 °C에서 30분간 배양합니다(유전자 증폭기에서 수행 가능).
• PCR 정화 칼럼을 사용하여 DNA를 정제하고 약 50 μL 정도 용출하십시오.
• 접합 제품의 0.1-10 ng을 벡터와 호환되는 화학적 또는 전기 관련 세포로 변환합니다.

변환(Transformation)

변환 절차에는 고품질의 플라스미드가 필수적으로 필요합니다. 다음 키트는 변환에 적합한 분리 및 정화를 위한 고품질 플라스미드입니다.

제품 번호	이름
PLN10	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit(10회분)
PLN70	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit(70회분)
PLN350	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit(350회분)
PFM10	GenElute™ 5 Minute Plasmid Miniprep Kit(10회분)
PFM50	GenElute™ 5 Minute Plasmid Miniprep Kit(50회분)
PFM250	GenElute™ 5 Minute Plasmid Miniprep Kit(250회분)
PLX15	GenElute™ Plasmid Maxiprep Kit(15회분)
PLD35	GenElute™ Plasmid Miniprep Kit(35회분)

화학적 세포 또는 전기 관련 세포를 이용한 변환의 자세한 프로토콜은 여기에서 확인할 수 있습니다.

기본 정보

머크는 재조합형 박테리아 선별 검사를 돕는 다양한 색소성 기질을 공급합니다. 일부 제품은 LB 한천 플레이트(스크린 프로토콜 1)에서 확산하는 데 사용될 수 있으며, 다른 제품은 미생물 배지(스크린 프로토콜 2)에 통합되어 있습니다. 제품이 필요한 곳이면 어디든 IPTG와 함께 사용할 수 있습니다. 두 가지 모든 절차를 위한 프로토콜은 아래를 참조하십시오.

스크리닝 프로토콜 1(제품 번호 B6650, 16658, B2904, B3928, 16669, B8931에 해당)

• 무균 스프레더를 사용하여 LB 한천 플레이트에 색소성 기질 40 μL 또는 적정량의 IPTG 용액 10 μL를 바릅니다(제품 번호 B3928은 이미 IPTG가 포함되어 있으므로 사용 시 IPTG를 추가할 필요가 없습니다).
• 플레이트에는 적절한 항생제가 포함되어야 하며, 항생제가 없는 경우 적절히 제어해야 합니다.
• 플레이트는 덮개를 약간 연 상태로 층류 유동 챔버에서 건조하십시오.
• 변형된 대장균 세포 10-100 μL를 멸균 스프레더로 LB 한천 플레이트에 도포합니다.
• 37 °C에서 24-48시간 동안 플레이트를 배양합니다.
• 한천 표면에 청백색 군집이 나타납니다. 배양할 흰색 군집에서 재조합형 세포를 선택합니다.

스크리닝 프로토콜 2 (제품 번호 S7313, S9811, C4478에 해당)

• 무균 플라스크에서 적절한 분말, 한천, 용수의 무게를 재고 LB 한천을 제조합니다. 또는 적절한 양의 C4478의 무게를 재고 멸균 플라스크에 물을 붓습니다.
• 배지에 제품 번호 S7313과 S9811 300 mg/L, 구연산 철 암모늄(제품 번호 F5879) 500 mg/L를 첨가한 후 오토클레이브 안에서 처리합니다. C4478을 사용하는 경우에는 이 단계를 진행하지 마십시오.
• 배지를 오토클레이브 처리하고 플라스크를 취급할 수 있을 정도로 충분히 식힙니다.
• 선택된 항생제를 적절한 농도로 매체에 첨가합니다.
• 약 25-30 mL의 LB 한천을 무균 플레이트에 붓고 뚜껑을 약간 열어 둡니다.
• 변형된 대장균 세포 10-100 μL를 멸균 스프레더로 LB 한천 플레이트에 도포합니다.
• 37 °C에서 24-48시간 동안 플레이트를 배양합니다.
• 한천 표면에 청백색 군집이 나타납니다. 배양할 흰색 군집에서 재조합형 세포를 선택합니다.

그림 3. X-gal을 이용한 재조합형 세균의 청백색 선택

Blue-white screening의 한계

• Blue-white screening은 선별 절차에 해당하며 선택 기법은 아닙니다.
• 벡터의 lacZ 유전자는 때때로 비기능적일 수 있으며 β-갈락토시다아제를 생성하지 않을 수 있습니다. 그 결과 군집을 재조합하지 않고서 흰색으로 나타날 수 있습니다.
• 작은 염기서열의 외래 DNA가 MCS에 삽입되어 lacZ 유전자의 판독 틀을 바꿀 가능성도 있습니다. 이는 거짓의 양성 백색 군락을 만들게 됩니다.
• β-갈락토시다아제는 부분적으로만 활성화되기 때문에 lacZ의 판독 프레임 내에 작은 삽입 개체가 있으면 불분명한 흐린 청색 군집을 생성할 수 있습니다.

참고문헌

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Padmanabhan S, Banerjee S, Mandi N. Screening of Bacterial Recombinants: Strategies and Preventing False Positives. https://doi.org/10.5772/22140