Oczyszczanie próbek

W laboratorium stosuje się niektóre z poniższych najczęściej spotykanych technik oczyszczania w celu przygotowania próbek do dalszej analizy.

Dializa

Dializa to technika oczyszczania stosowana w celu usunięcia soli lub innych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej z próbki. Wykorzystuje się ją również do wymiany składu buforowego próbki. Dializa jest techniką pasywną wymagającą dużych objętości buforu.

Wymiana buforu i odsolanie

Odsolanie to prosta metoda usuwania soli i innych zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej z próbki. Stosuje się ją również do wymiany buforu przed lub po różnych etapach chromatografii oraz do szybkiego usuwania odczynników w celu zakończenia reakcji.

Strącanie frakcyjne

Strącanie frakcyjne stosuje się do usuwania zanieczyszczeń makroskopowych z niewielkich objętości próbek. Techniki strącania rozdzielają frakcje na zasadzie różnicowej rozpuszczalności. Ponieważ gatunki białek różnią się stopniem hydrofobowości, zwiększone stężenia soli mogą wzmocnić oddziaływania hydrofobowe między białkami i spowodować strącanie.

Ekstrakcja

Przygotowanie próbki poprzez ekstrakcję polega na izolacji docelowych analitów ze złożonej próbki lub znacznie większej objętości próbki. Proces ten usuwa zakłócające składniki próbki, które mogą blokować kolumny HPLC i GC. Zwiększa również stężenie analitu od 100 do 5000 razy, co znacznie poprawia czułość wykrywania. Jako część selektywnego i specyficznego przygotowania próbki, ekstrakcja pomaga zapewnić bardziej wiarygodną analizę chromatograficzną. Rodzaje ekstrakcji to ekstrakcja ciecz-ciecz, ekstrakcja w fazie stałej (SPE) oraz mikroekstrakcja w fazie stałej (SPME).

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa rozdziela białka w oparciu o odwracalne interakcje między białkiem a specyficznym ligandem, który został sprzężony z matrycą chromatograficzną. Technika ta jest wysoce selektywna i pozwala na oczyszczanie białek o dużej wydajności. Chromatografię powinowactwa można stosować zawsze, gdy dostępny jest odpowiedni ligand dla danego białka.

Oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa obejmuje etapy wychwytywania i elucji. W fazie wychwytywania docelowe białko jest specyficznie i odwracalnie wiązane z komplementarnym ligandem, który został unieruchomiony na matrycy chromatograficznej. Celem jest izolacja, zagęszczenie i stabilizacja docelowego produktu przy zachowaniu jego mocy i aktywności. Po przemyciu matrycy w celu usunięcia niezwiązanego materiału, związane białko docelowe jest odzyskiwane poprzez zmianę warunków na sprzyjające elucji. Elucja jest przeprowadzana specyficznie, przy użyciu liganda konkurencyjnego, lub niespecyficznie, poprzez zmianę pH, siły jonowej lub polaryzacji. Elucja pozwala na zebranie białka docelowego w postaci oczyszczonej i skoncentrowanej.