MIQE: Standardy eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym

Potencjalne zastosowania ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) wzrosły wykładniczo od czasu pierwszego opisu (Higuchi, 1993). Jednak badacze byli sfrustrowani komplikacjami, takimi jak zanieczyszczenie, niewystarczająca amplifikacja, niska czułość i niepewność co do tego, co stanowi odpowiednią analizę statystyczną. Do niedawna brakowało konsensusu co do tego, jak radzić sobie z tymi przeszkodami.

Międzynarodowy zespół badawczy, w tym dr Tania Nolan, nasz globalny menedżer ds. zastosowań i wsparcia technicznego, opublikował w 2009 r. wytyczne MIQE (wymawiane Mykee), aby sprostać wyzwaniom związanym z wykonywaniem niezawodnych pomiarów qPCR. Postępując zgodnie z MIQE, z pewnością uzyskasz bardziej wiarygodne dane:

• Promować przejrzystość eksperymentalną
• Zapewnić spójność między laboratoriami
• Zachować integralność literatury naukowej

.Nasze usługi qPCR, w tym projektowanie starterów i sond, opracowywanie protokołów testów, rozwiązywanie problemów i wsparcie w zakresie analizy danych, są zgodne z MIQE, co pozwala szybciej i pewniej publikować lub wprowadzać produkt na rynek.

Skrócona instrukcja obsługi listy kontrolnej MIQE
Lista kontrolna MIQE dla qPCR1	Ważność2
Importance2
Projekt eksperymentalny
Definicja grup eksperymentalnej i kontrolnej	Niezbędne
Badanie przeprowadzone przez laboratorium podstawowe czy laboratorium badacza?	Pożądane
Uznanie wkładu autorów	Pożądane
Próbka
Opis	Essential
Volume/mass of sample processed	Pożądane
Mikrodysekcja lub makrodysekcja	Niezbędne
Jeśli zamrożone - metoda i jak szybko?	Essential
If fixed - with what and how quickly?	Niezbędne
Warunki i czas przechowywania próbek (szczególnie w przypadku próbekFFPE)	Niezbędne
Ekstrakcja kwasu nukleinowego
Procedura i/lub oprzyrządowanie	Niezbędne
Nazwa zestawu i szczegóły wszelkich modyfikacji	Niezbędne
Źródło użytych dodatkowych odczynników	Pożądane
Szczegóły obróbki DNazą lub RNazą	Niezbędne
Ocena zanieczyszczenia (DNA lub RNA)	Niezbędne
Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych	Essential
Instrument and method	Essential
Purity (A260/A280)	Pożądane
Wydajność	Pożądane
Metoda/instrument integralności RNA	Niezbędne
RIN/RQI lub Cq transkryptów 3' i 5'	Niezbędne
Ślady elektroforezy	Pożądane
Testy inhibicji (rozcieńczenia Cq, spike lub inne)	Niezbędne
Odwrotna transkrypcja
Pełne warunki reakcji	Niezbędne
Ilość RNA i objętość reakcji	Essential
Priming oligonucleotide (if using GSP) i stężenie	Niezbędne
Odwrotna transkryptaza i stężenie	Niezbędne
Temperatura i czas	Niezbędne
Producent odczynników i numery katalogowe	Pożądane
CqS z i bez gene-specific primingRT	Pożądane3
Warunki przechowywania cDNA	Pożądane
qPCR Target Information
Jeśli multipleks, wydajność i LOD każdego testu	Essential
Numer akcesji sekwencji	Niezbędne
Lokalizacja amplikonu	Pożądane
Długość amplikonu	Essential
in silico specificity screen (BLAST, etc)	Niezbędne
Pseudogeny, retropseudogeny lub inne homologi?	Pożądane
Wyrównanie sekwencji	Pożądane
Analiza struktury wtórnej amplikonu	Pożądane
Lokalizacja każdego startera według eksonu lub intronu (jeśli dotyczy)	Niezbędne
Jakie warianty splicingu są celem?	Kluczowe
OligonukleotydyqPCR
Sekwencje primerów	Niezbędne
Numer identyfikacyjny RTPrimerDB	Pożądane
Sekwencje sondy	Pożądane4
Lokalizacja i tożsamość wszelkich modyfikacji	Niezbędne
Producent oligonukleotydów	Pożądane
Metoda oczyszczania	pożądana
protokół qPCR
Pełne warunki reakcji	Niezbędne
Objętość reakcji i ilość cDNA/DNA	Niezbędne
Primer, (sonda), Mg++ i stężenia dNTP	Niezbędne
Tożsamość i stężenie polimerazy	Essential
Buffer/kit identity and manufacturer	Niezbędne
Dokładny skład chemiczny bufora	pożądane
Dodatki (SYBR Green I, DMSO, itp.)	Niezbędne
Producent płytek/rurek i numer katalogowy	Pożądane
Pełne parametry termocyklingu	Essential
Reaction setup (manual/robotic)	Pożądane
Producent urządzenia qPCR	Niezbędne
qPCR Validation
Evidence of optimization (from gradients)	Pożądane
Specyficzność (żel, sekwencja, stop lub trawienie)	Niezbędne
Dla SYBR Green I, Cq NTC	Essential
Standardowe krzywe z nachyleniem i punktem Y	Essential
Wydajność PCR obliczona na podstawie nachylenia	Essential
Confidence interval for PCR efficiency or standard error	Pożądane
R2 krzywej standardowej	Essential
Linear dynamic range	Essential
Cq variation at lower limit	Niezbędne
Przedziały ufności w całym zakresie	pożądane
Dowody na granicę wykrywalności	Niezbędne
Jeśli multipleks, wydajność i LOD każdego testu	Niezbędne
Analiza danych
Program do analizy qPCR (źródło, wersja)	Niezbędne
Oznaczanie metody Cq	Essential
Outlier identification and disposition	Essential
Results of NTCs	Essential
Uzasadnienie liczby i wyboru genów referencyjnych	Essential
Opis metody normalizacji	Niezbędne
Liczba i zgodność replikacji biologicznych	Pożądane
Liczba i etap (RT lub qPCR) replikacji technicznych	Essential
Repeatability (intra-assay variation)	Essential
Reproducibility (inter-assay variation, %CV)	Pożądane
Analiza mocy	Pożądane
Metody statystyczne dla istotności wyników	Niezbędne
Oprogramowanie (źródło, wersja)	Niezbędne
Cq lub surowe dane przesłane przy użyciu RDML	pożądane

¹Clinical chemistry Copyright 2009 by AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY, INC. Reproduced with permission of AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY, INC in the format Internet posting via Copyright Clearance Center.

²Wszystkie istotne informacje muszą być dostarczone wraz z manuskryptem. Pożądane informacje należy przesłać, jeśli są dostępne. Jeśli startery pochodzą z RTPrimerDB, informacje na temat celu qPCR, oligonukleotydów, protokołów i walidacji są dostępne z tego źródła.

³Ocena braku DNA przy użyciu testu bez odwrotnej transkrypcji jest niezbędna przy pierwszej ekstrakcji RNA. Gdy próbka zostanie zwalidowana jako wolna od DNA, włączenie kontroli bez odwrotnej transkrypcji jest pożądane, ale nie jest już niezbędne.

⁴Ujawnienie sekwencji sondy jest wysoce pożądane i zdecydowanie zalecane. Ponieważ jednak nie wszyscy komercyjni dostawcy wstępnie zaprojektowanych testów dostarczają tych informacji, nie może to być niezbędny wymóg. Stosowanie takich testów jest odradzane.