โปรโตคอลการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรีย

การเปลี่ยนแปลงเป็นกระบวนการสำคัญในการโคลนโมเลกุลซึ่งมีการผลิตโมเลกุลดีเอ็นเอ recombinant หลายชุด ความสามารถในการรับสารพันธุกรรมนอกเซลล์ฟรีเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับเซลล์ที่มีความสามารถในการรับเชื้อแบคทีเรีย วัตถุประสงค์คือเพื่อให้ได้การจำลองลำดับความสนใจของพลาสมารีคอมบิแนนท์

รูปที่ 1 การเปลี่ยนแปลง

ก่อนเริ่มการแปลง:

• Prepare LB agar plates and allow to set. หากใช้งานแผ่นความร้อนที่เทไว้ล่วงหน้าให้ตรวจสอบว่าแผ่นความร้อนอุ่นอยู่ที่ 37°C
• ขึ้นอยู่กับเครื่องหมายยาปฏิชีวนะที่มีอยู่ในดีเอ็นเอพลาสมิดให้ใช้ยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมในอาหารแข็งปอนด์
• หากต้องการการคัดกรองสีฟ้า/ขาว µg รับสารผสมใหม่ให้ใช้ IPTG ขนาด 1 มม., S-Gal ขนาด 300 μ S/mL หรือ µg X-Gal ขนาด 40 μ µg และแอมโมเนียมซิเตรทขนาด 500 μ m/ มล. ในอาหารแข็งปอนด์
• หากใช้งานเซลล์ที่มีกระแสไฟฟ้าได้ให้วางช่องเก็บกระแสไฟฟ้าบนน้ำแข็ง
• ให้ความร้อนอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C
• อุ่นอุณหภูมิปานกลางถึงอุณหภูมิห้องที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (หรือ 20-25°C ในอ่างน้ำ)

โปรโตคอลสำหรับการเปลี่ยนแปลงโดยใช้เซลล์ที่มีความสามารถทางเคมี

Materials required but not provided:

โปรโตคอลการแปลงมาตรฐาน

1. ถ่ายหลอดที่ต้องการจากตู้แช่แข็ง 70°C ไปยังน้ำแข็งที่เปียก รวมหลอดเพิ่มเติมสำหรับ DNA ควบคุมหากต้องการ
2. ปล่อยให้เซลล์ละลายเป็นเวลา 5 นาที ค่อยๆเคาะหลอดหลายๆครั้งเพื่อให้ได้การแขวนที่สม่ำเสมอ
   1. For control: เติม 10 DNA µL รับควบคุม pUC19 ขนาด 1 มม. (1 นาโนกรัม) ลงในหลอดเดียว ผสมโดยการแตะเบาๆและวางบนน้ำแข็ง
   2. เติม 50 ดีเอ็นเอพลาสมิดบริสุทธิ์ 1 นาโนกรัมลงในเซลล์โดยตรงในส่วนที่เหลือของหลอด ผสมโดยการแตะเบาๆและวางบนน้ำแข็ง
3. บ่มเซลล์บนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที
4. ถ่ายโอนเซลล์ไปยังอ่างน้ำอุณหภูมิ 37°C เป็น  เวลา 45 วินาที
5. ถ่ายโอนเซลล์ไปยังน้ำแข็งเป็นเวลา 2 นาที
6. เติมอาหารเลี้ยงเชื้อ SOC ลงในแต่ละหลอด ย้ายเซลล์ไปยังหลอดโพลีโพรพิลีนปลอดเชื้อและคลายฝาครอบเพื่ออำนวยความสะดวกในการเติมอากาศของวัฒนธรรม
7. บ่มเซลล์บนเครื่องบ่มเพาะของเครื่องปั่น 225-250 (1 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
8. ปิเปตต์ 10-100 ไมโครลิตรของสารแขวนตะกอนแต่ละชนิดที่เปลี่ยนสภาพแล้วบนแผ่นวุ้นปอนด์ที่มียาปฏิชีวนะ µL รับเลือกและทาด้วยเครื่องหว่านเมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
9. บ่มจานที่อุณหภูมิ 37°C ข้ามคืน
10. เลือกอาณานิคม (อาณานิคม) และวัฒนธรรมตามต้องการ
11. แยกดีเอ็นเอพลาสมิดออกจากแต่ละวัฒนธรรม
12. วัฒนธรรมโคลนที่ต้องการ
13. ย่อยดีเอ็นเอพลาสมิดโดยใช้เอนไซม์จำกัดแยกด้วยเจลอิเล็กโตรโฟเรซิส

โปรโตคอลสำหรับการเปลี่ยนแปลงโดยใช้เซลล์ไฟฟ้า

Materials required but not provided:

โปรโตคอลการแปลงมาตรฐาน

1. ถ่ายหลอดที่ต้องการจากตู้แช่แข็ง 70°C ไปยังน้ำแข็งที่เปียก รวมหลอดเพิ่มเติมสำหรับ DNA ควบคุมหากต้องการ
2. ปล่อยให้เซลล์ละลายเป็นเวลา 5 นาที ค่อยๆเคาะหลอดหลายๆครั้งเพื่อให้ได้การแขวนที่สม่ำเสมอ
3. ถ่ายโอน SOC ขนาดกลางไปยังหลอดวัฒนธรรมหนึ่งหลอดสำหรับปฏิกิริยาการเปลี่ยนแปลงแต่ละครั้งและออกจากที่อุณหภูมิห้อง
   
   (ปริมาตรของ SOC medium จะขึ้นอยู่กับปริมาตรของเซลล์ที่จะถูกเพิ่มในขั้นตอนถัดไป ปริมาตรสุดท้ายที่มีเซลล์ที่มีอำนาจและสื่อ SOC ควรเป็น 1000 µL)
4. วางหลอดคิวเวตต์มาตรฐานขนาด 1 มม. และหลอดหมุนเหวี่ยงขนาดเล็กที่ผ่านการฆ่าเชื้อบนน้ำแข็งหลอดหนึ่งหลอดสำหรับปฏิกิริยาการเปลี่ยนแปลงแต่ละครั้ง
5. ถ่ายโอนเซลล์ที่มีความสามารถไปยังหลอดไมโครเซนต์เย็น ใช้ 40 µL ของเซลล์จากแพคเกจ 80 µL และ 50 µL ของเซลล์จากแพคเกจ 100 µL
   1. For control: เติมดีเอ็นเอควบคุม pUC19 ที่เจือจางแล้ว µL วน 1 ไมโครเมตรจาก 1 ถึง 5 ลงในหลอดเดียว
   2. เตรียมการเจือจาง DNA หรือการรวมกันของการเจือจาง 1 ถึง 5 เท่าในบัฟเฟอร์ TE Add to microfuge tubes.
6. ปิเปตต์ดีเอ็นเอและเซลล์ผสมลงในคิวเวทท์ขนาด 1 มม. ที่แช่เย็น
7. ตั้งค่า Electroporator ให้มีความแรงของสนามแม่เหล็ก 25 kV/cm เป็นเวลา 6 ms และรักษาเซลล์
8. นำเซลล์ออกจากคิวเวตต์และเติมลงในหลอดที่มี SOC medium
9. บ่มเซลล์บนเครื่องบ่มเชื้อขวดเขย่า (ความเร็ว 225-250 รอบต่อนาที) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
10. ปิเปตต์ 10-100 ไมโครลิตรของสารแขวนตะกอนแต่ละชนิดที่เปลี่ยนสภาพแล้วบนแผ่นวุ้นปอนด์ที่มียาปฏิชีวนะ µL รับเลือกและทาด้วยเครื่องหว่านเมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว
11. บ่มจานที่อุณหภูมิ 37°C ข้ามคืน
12. เลือกอาณานิคมและวัฒนธรรมตามต้องการ
13. แยกดีเอ็นเอพลาสมิดออกจากแต่ละวัฒนธรรม
14. ย่อยดีเอ็นเอพลาสมิดโดยใช้เอนไซม์จำกัดแยกด้วยเจลอิเล็กโตรโฟเรซิส
15. วัฒนธรรมโคลนที่ต้องการ

เคล็ดลับที่สำคัญสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการเปลี่ยนแปลง:

• ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเซลล์ยังคงถูกแช่แข็งและน้ำแข็งแห้งยังคงปรากฏอยู่เมื่อได้รับ
• เพื่อประสิทธิภาพในการเปลี่ยนแปลงสูงสุดให้ใช้ตัวอย่างดีเอ็นเอคุณภาพสูงที่ปราศจากฟีนอลเอทานอลโปรตีนเกลือหรือผงซักฟอก เมื่อใช้เซลล์ที่มีกระแสไฟฟ้าปริมาณเกลือสูงใน DNA จะทำให้เกิดประกายไฟที่แรงดันไฟฟ้าสูงซึ่งอาจทำให้ตัวอย่างและอุปกรณ์เสียหาย
• ดีเอ็นเอในปฏิกิริยา ligation ที่มีรีเอเจนต์คุณภาพสูงอาจใช้สำหรับการเปลี่ยนแปลง ไม่จำเป็นต้องปิดใช้งานเอ็นเอเอ็นเอ
• เก็บเซลล์ที่มีความสามารถไว้บนน้ำแข็งตลอดเวลาป้องกันไม่ให้เซลล์ร้อนโดยไม่ตั้งใจ
• ค่อยๆเคาะหลอดเพื่อให้เซลล์ถูกระงับอย่างสม่ำเสมอ ห้ามผสมโดยใช้ vortex หรือปิเปตต์
• แผ่นอาการ์ LB อุ่นถึง 37°C เพื่อการเติบโตของอาณานิคมที่ดีที่สุด
• การตั้งค่า Electroporator สำหรับการเปลี่ยนแปลงโดยใช้เซลล์ไฟฟ้า:
  • BTX รุ่น ECM 630 โหมด HV, 2.5 kV, 25 µF, 100 Ω, คิวเวทท์ 1 มม
  • Biorad ยีน Pulser: 2.5 kV, 25 μ µF 100 μ Ω คิวเวทท์ 1 มม

ข้อมูลอ้างอิง

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu. Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994