โคลนยีนที่น่าสนใจลงในเวกเตอร์ plasmid

Oxford Genetics

• การเลือกระบบโคลนและเวกเตอร์พลาสมิด
• Plasmid จำกัดการย่อยอาหาร
• การย่อยอาหารการจำกัดเศษชิ้นส่วน
• Gel Excission
• ทำความสะอาดชิ้นส่วนเจล
• การอบดีเอ็นเอ Oligos สำหรับ ligation
• เพิ่ม 5’ฟอสเฟตไปยังดีเอ็นเอ
• Dephosphorylating DNA
• เตรียมดีเอ็นเอสำหรับการโคลน Bunt สิ้นสุด
• การรวมดีเอ็นเอเพื่อสร้างพลาสมิดที่มียีนที่น่าสนใจ
• เว็บไซต์กำกับ Mutagenesis

 

การเลือกระบบโคลนและเวกเตอร์พลาสมิด

วิศวกรรมพันธุกรรมถูกนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการนับพันแห่งทั่วโลก เนื่องจากความสำคัญของมันจึงเป็นที่น่าสังเกตว่ากลยุทธ์การโคลนสำหรับส่วนประกอบดีเอ็นเอที่เป็นที่นิยมจำนวนมากนั้นไม่ได้เป็นมาตรฐาน การมีส่วนร่วมในการขาดมาตรฐานนี้เป็นทางเลือกมากมายสำหรับชุดโคลนนิ่งและเทคโนโลยีที่เป็นนวัตกรรม  ไม่จำเป็นต้องใช้ชุด IP- หนักเนื่องจากการโคลนแบบดั้งเดิมโดยการจำกัดการย่อยเอนไซม์ทำได้ง่ายขึ้นด้วยพลาสมิดมาตรฐานจาก Oxford Genetics

เป้าหมายที่ Oxford Genetics คือการออกแบบระบบ DNA plasmid ที่สามารถรองรับการแทรกดีเอ็นเอส่วนใหญ่ที่นักวิจัยอาจต้องการภายใน plasmid เดียว ด้วยการปรับแต่งเวกเตอร์เริ่มต้นของเราส่วนประกอบ DNA ทั้งหมดของระบบของเราสามารถถูกลบออกและแลกเปลี่ยนเป็นส่วนดีเอ็นเออื่นๆนับร้อยส่วนที่ได้รับการออกแบบและทดสอบล่วงหน้าโดยเรา   โครงสร้างทั้งหมดของเราได้รับการคัดกรองล่วงหน้าสำหรับการใช้งาน Codon ที่ไม่ดีและไซต์การจำกัดที่ขัดแย้งกัน หากเป็นไปได้จะมีการกำจัดจระเข้และไซต์ควบคุมที่หายากออกไปเพื่อให้สามารถแสดงออกได้อย่างมีประสิทธิภาพและตรวจสอบให้แน่ใจว่าไซต์ที่มีข้อจำกัดไม่ได้จำกัดการโคลนส่วน DNA ของ SnapFast อื่นๆ

เรามีหนึ่งในคอลเลกชันที่ใหญ่ที่สุดของ plasmids ที่มีอยู่ทั่วโลกให้ตัวเลือกการแสดงออกและโคลนหลายสำหรับแทรกเกือบทุกที่เราให้ กลุ่มผลิตภัณฑ์ของเราประกอบด้วย:

• ช่วงแท็กเปปไทด์ที่ใหญ่ที่สุดทุกที่ 26 (1)
• รวม 9 ยีนของผู้รายงานใน 5 รูปแบบ
• มากกว่า 20 เปปไทด์สัญญาณ
• มากกว่า 40 โปรโมเตอร์สำหรับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแบคทีเรียและการแสดงออกของยีสต์
• ตัวเลือกการเลือกยาปฏิชีวนะและการเผาผลาญรวม 10 ตัว

Benefits of the SnapFast System

• plasmids ทั้งหมดเข้ากันได้กับการโคลนมาตรฐาน, LIC, InfusionHD, Gibson Assembly, Geneart ไร้รอยต่อ
• มีส่วนดีเอ็นเอที่ไม่ซ้ำกันมากกว่า 1600 ส่วนและเข้ากันได้
• กลยุทธ์ทางวิศวกรรมที่ง่ายมีประสิทธิภาพและเรียบง่าย
• อัตราความสำเร็จสูงเนื่องจากความเข้ากันได้ที่ออกแบบไว้ล่วงหน้า
• No insert size constraints. ต้นฉบับสำเนาต่ำเพื่อความเสถียรที่เพิ่มขึ้น
• เข้ากันได้กับเวกเตอร์โคลนที่มีอยู่แล้วจำนวนมากและเวกเตอร์กระสวยเพื่ออำนวยความสะดวกในการถ่ายโอนยีน
• โคลนง่ายจากเวกเตอร์ SnapFast เข้าไปในช่วงของระบบทางเลือก, รวมทั้งเวกเตอร์ไวรัส.
• สร้างขึ้นในลำดับการกำกับดูแลและความสามารถ (เช่นยีน concatamerisation, ฉนวนและลำดับการสิ้นสุด)

* ต้องมีการออกแบบไพรเมอร์โดยใช้เว็บไซต์ homology หรือ TypeIIS
** สิทธิบัตรจำกัดการใช้เทคโนโลยีการโคลนหรือผลิตภัณฑ์
^ เครื่องมือออนไลน์เพื่อช่วยในการออกแบบ
LIC = Ligase Independent Cloning

Plasmid จำกัดการย่อยอาหาร

การเตรียมการย่อยคือการตัดดีเอ็นเอเพื่อเตรียมความพร้อมสำหรับการควบกับดีเอ็นเออีกชิ้นหนึ่งไม่ใช่เพียงเพื่อยืนยันตัวตนของดีเอ็นเอ คุณควรตั้งค่าย่อยของทั้งส่วนย่อยและเวกเตอร์ของคุณในเวลาเดียวกัน ซึ่งจะช่วยให้คุณประหยัดเวลา โปรโตคอลนี้จะถือว่าเป็นโซลูชัน plasmid ใน Tris-EDTA (TE) หรือ Elution Buffer (EB) หรือ Nuclease free H₂O ที่มีขนาด 200-300 นาโนกรัม/µL และประมาณ 3-5 kb พลาสมิดขนาดใหญ่อาจทำให้คุณต้องใช้ปริมาณมากขึ้นเนื่องจากในความเข้มข้นเดียวกันจะมีการทำสำเนาพลาสมิดน้อยลง

ในตัวอย่างนี้สามารถทำสิ่งต่อไปนี้ได้:

พลาสมามิด 10-20 µL

 10 ไม μL รกรัม (0.5 นาโนกรัม/ไ µg ม µL รกรัม, µL รวม 10 ไมโครกรัม) บัฟเฟอร์ µg กัด 10 100 เท่า 3-5 ไมโครกรัมของเซรั่มวัว 10 เท่า Albumin (BSA, ความเข้มข้นสุดท้ายมักจะเป็น 200-300 ไมโครกรัม/มล.) (หมายเลขแคตตาล็อก A7906)
1.5-2 µL Restriction Enzyme 1 (µL
µL กัด 10-20 หน่วย/ตารางเมตร) 1.5-2
µL Restriction Enzyme 2 (อุปกรณ์เสริม) รวมกันเป็นปริมาตรรวม 70 หรือ 100 μ m กับ TE (หมายเลขแคตตาล็อก T9285) o น้ำฟรี rnuclease (หมายเลขแคตตาล็อก W4502)

เติมน้ำยาดังกล่าวข้างต้นใน Ependdorf ขนาด 1.5 มล. ที่ผ่านการฆ่าเชื้อก่อนอื่นให้เติม TE หรือน้ำจากนั้นเติมพลาสมามิด/ดีเอ็นเอจากนั้นใส่บัฟเฟอร์การจำกัดและบีเอสเอและผสมให้เข้ากัน สุดท้ายเพิ่มเอนไซม์ควบคุม เอนไซม์จำกัดที่เลือกขึ้นอยู่กับเป้าหมายและแผนที่พลาสมิดของคุณแต่อาจรวมถึง ECOR I, BamH I หรือ Hind III บ่มปฏิกิริยาที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (โดยปกติจะเป็น 37°C แต่ต้องแน่ใจเสมอว่าคุณไม่ได้จัดการกับข้อยกเว้นเช่นสวายที่ 25°C) และเริ่มนาฬิกาปลุกของคุณ (นับขึ้น) ทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 40-60 นาที ตอนนี้คุณสามารถตัดฟอสฟอรัสเวกเตอร์โดยใช้อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (CIP) คุณอาจต้องการปิดใช้งานเอนไซม์อุดตันณจุดนี้นี่คือวิธีปฏิบัติมาตรฐาน

เรียกใช้การย่อยบนเจล agarose (ที่มีขนาดใหญ่มากสำหรับการใส่ตัวอย่างขนาดใหญ่) และตรวจสอบผลลัพธ์สำหรับแถบเดียวขนาดของ learized plasmid ของคุณ ผลลัพธ์ที่เป็นไปได้สามอย่างจากข้อมูลสรุปนี้:

• ไม่ได้ผลเลย ไม่มีจุดในการย่อยอีกต่อไปเนื่องจากปฏิกิริยาล้มเหลว หากเอนไซม์ทำงานกับ plasmid อื่นมาก่อนอาจตกตะกอน plasmid ที่คุณพยายามตัดใหม่หรือทำการสกัดฟีนอลใหม่ก่อนที่จะตกตะกอนและลองอีกครั้ง มิฉะนั้นให้ตรวจสอบว่าเอนไซม์ยังโอเคหรือไม่โดยใช้พลาสมิดอื่น
• ได้ผลแต่เวกเตอร์ไม่ได้ถูกตัดอย่างสมบูรณ์หลังจาก 40 นาที (มองเห็นได้มากกว่าหนึ่งวงในน้ำหนักโมเลกุลโดยประมาณที่คุณคาดหวังจากเวกเตอร์) คุณสามารถประมาณจากความคืบหน้าว่าจะใช้เวลานานแค่ไหนและลองย่อยอาหารอื่น
• ย่อยอาหารได้อย่างสมบูรณ์ คุณมีพลาสมิดเชิงเส้นที่พร้อมใช้งานในขั้นตอนการติด

เคล็ดลับ: เอนไซม์จำกัดมีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิดังนั้นหลีกเลี่ยงการวางไว้บนน้ำแข็ง ใช้กล่องเย็น -20°C ได้ดีที่สุด นอกจากนี้หลีกเลี่ยงการจับที่ด้านล่างของหลอดด้วยนิ้วมือและพยายามทำงานอย่างรวดเร็วในขณะที่จัดการกับสต็อกเอนไซม์ พวกเขาจะมีอายุการใช้งานนานถ้าคุณดูแลพวกเขา

การย่อยอาหารการจำกัดเศษชิ้นส่วน

นี่เป็นโปรโตคอลสำหรับการเตรียมการย่อยซึ่งเป็นการตัดดีเอ็นเอเพื่อเตรียมความพร้อมสำหรับการติดกับดีเอ็นเออีกชิ้นหนึ่งไม่ใช่แค่เพื่อยืนยันตัวตนของดีเอ็นเอ โดยปกติดีเอ็นเอพวกนี้จะเป็นพลาสมิดแบบวงกลมแต่มันก็อาจเป็นชิ้นส่วน PCR ได้เช่นกัน คุณควรตั้งค่าย่อยของทั้งส่วนย่อยและเวกเตอร์ของคุณในเวลาเดียวกัน ซึ่งจะช่วยให้คุณประหยัดเวลาในภายหลัง

โปรโตคอลนี้จะถือว่าเป็นโซลูชัน plasmid ใน Tris-EDTA (TE) หรือ Elution Buffer (EB) หรือ Nuclease free H₂O ที่มีขนาด 200-300 นาโนกรัม/µL และประมาณ 3-5 kb พลาสมิดขนาดใหญ่อาจทำให้คุณต้องใช้ปริมาณมากขึ้นเนื่องจากในความเข้มข้นเดียวกันจะมีการทำสำเนาพลาสมิดน้อยลง

ในตัวอย่างนี้สามารถทำสิ่งต่อไปนี้ได้:

พลาสมามิด 10-20 µL

 10 ไม μL รกรัม (0.5 นาโนกรัม/ไ µg ม µL รกรัม, µL รวม 7.5 ไมโครกรัม) บัฟเฟอร์ µg กัด 10 100 เท่า 3-5 ไมโครกรัมของเซรั่มวัว 7.5 เท่า Albumin (BSA, ความเข้มข้นสุดท้ายมักจะเป็น 200-300 ไมโครกรัม/มล.) (หมายเลขแคตตาล็อก A7906)
1.5-2 µL ของเอนไซม์ µL กัด 1 (10-20 u/
µL) 1.5-2
µL จำกัดเอนไซม์ 2 (อุปกรณ์เสริม) รวมกันได้ถึง 70 รวมกับ TE (หมายเลขแคตตาล็อก T9285) o น้ำฟรี rnuclease (หมายเลขแคตตาล็อก W4502)

DNA Fragment Restriction โปรโตคอลย่อยอาหาร

เติมน้ำยาดังกล่าวข้างต้นใน Ependdorf ขนาด 1.5 มล. ที่ผ่านการฆ่าเชื้อก่อนอื่นให้เติม TE หรือน้ำจากนั้นเติมพลาสมามิด/ดีเอ็นเอจากนั้นใส่บัฟเฟอร์การจำกัดและบีเอสเอและผสมให้เข้ากัน สุดท้ายเพิ่มเอนไซม์ควบคุม บ่มปฏิกิริยาที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (โดยปกติจะเป็น 37°C แต่ต้องแน่ใจเสมอว่าคุณไม่ได้จัดการกับข้อยกเว้นเช่นสวายที่ 25°C) และเริ่มนาฬิกาปลุกของคุณ (นับขึ้น) ทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 40-60 นาที เรียกใช้การย่อยบนเจล agarose (ที่มีขนาดใหญ่มากสำหรับการใส่ตัวอย่างขนาดใหญ่) และตรวจสอบผลลัพธ์สำหรับแถบเดียวขนาดของเม็ดมีดของคุณ

เจล Excission ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ

เพื่อเพิ่มความโดดเด่นให้กับสายนาฬิกาคุณจะต้องใช้มีดผ่าตัดหรือมีดโกนที่สะอาด การพิจารณาที่สำคัญคือปริมาณของ agarose ที่คุณใช้กับดีเอ็นเอ ยิ่งอัตราส่วนอยู่ระหว่างปริมาณของดีเอ็นเอต่อการเกิดสารปนเปื้อนน้อยลงคุณจะได้รับการดำเนินการผ่านไปยัง ligation

วิธีการมาตรฐานที่ใช้ในการแยกดีเอ็นเอจากเจล agarose คือการแสดงภาพของ ethidium bromide (หมายเลขแคตตาล็อก H5041) คราบด้วยแสงยูวี ซึ่งไม่เหมาะเนื่องจาก UV จะทำลายดีเอ็นเอและอาจทำให้เกิดการกลายพันธุ์และสามารถลดประสิทธิภาพการติด อีกทางเลือกหนึ่งคือการใช้ไฟส่องสว่าง Trans ของ Clare Chemical Dark Reader แต่บางครั้งก็ยากที่จะเห็นแถบปริมาณต่ำ หากคุณมี DNA ที่เป็นสัญลักษณ์ระบบเหล่านี้เหมาะอย่างยิ่ง อีกทางเลือกหนึ่งคุณสามารถทำการตัดแต่งโดยการใช้ DNA การตัดของคุณในเลนที่อยู่ติดกับบ่อน้ำขนาดใหญ่ของคุณและใช้ตำแหน่งของมันเพื่อสร้างดีเอ็นเอจำนวนมากในบ่อน้ำถัดไป ระวังด้วยเทคนิคนี้เนื่องจากแถบบางเส้นอาจมีความยาวค่อนข้างเล็ก/จากบนลงล่างในเจลและอาจพลาดได้หากคุณไม่ถูกต้อง หลังจากการผ่าตัดคุณสามารถดูเจลที่เหลือเพื่อดูว่าคุณได้รับสายหรือไม่ทำอย่างรวดเร็วเพราะถ้าคุณไม่ได้รับดีเอ็นเอคุณไม่ต้องการทำลายมันด้วยรังสียูวี

ระวังชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่อยู่ใกล้กัน กุญแจสำคัญของเทคนิคนี้คือการแยกกระดูกสันหลังของเวกเตอร์ออกจากชิ้นส่วนเพื่อป้องกันการปนเปื้อน เพียงเพราะคุณไม่สามารถมองเห็นบางสิ่งบางอย่างเมื่อคุณกำลังแก้ตัวไม่ได้หมายความว่ามันไม่ได้มี, คุณจะเห็นเฉพาะจุดสูงสุดของการกระจายดีเอ็นเอของเกาส์และในขณะที่วงดนตรีอาจดูแยกพวกเขาอาจจะไม่ได้และคุณอาจได้รับดีเอ็นเอบางส่วนจากวงดนตรีที่ใกล้เคียงกับอุบัติเหตุ

เคล็ดลับ: นี่เป็นขั้นตอนที่ค่อนข้างอันตรายเท่าที่ชีววิทยาโมเลกุลไป แสงยูวี, สารก่อมะเร็ง ethidium bromide และมีดผ่าตัดเป็นสูตรสำหรับภัยพิบัติ โปรดปฏิบัติตามกฎและข้อบังคับด้านความปลอดภัยในท้องถิ่นทั้งหมดและปรึกษาเจ้าหน้าที่ด้านความปลอดภัยในท้องถิ่นหากคุณไม่แน่ใจเกี่ยวกับข้อควรระวังที่จำเป็นในการปฏิบัติ

เคล็ดลับ: พิจารณาเลือกสารเคมีที่ปลอดภัยกว่าสำหรับการมองเห็นดีเอ็นเอ ทั้ง Nancy 520 (แคตตาล็อกหมายเลข 01494) และ Syber Safe (หมายเลขแคตตาล็อก S930 5 และ S9430)ได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีการกลายพันธุ์น้อยกว่า ethidium bromide

ทำความสะอาดชิ้นส่วนเจล

สำหรับเจลที่สกัดชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากเจล agarose มักจะไม่คุ้มค่าที่จะใช้อะไรนอกเหนือจากชุดที่เตรียมไว้เช่น GenElute ™ Gel Extraction Kitหมายเลขแคตตาล็อก NA1111. พวกเขาค่อนข้างถูกและมีประสิทธิภาพสูง วิธีการอื่นๆที่มีอยู่ที่ไม่เกี่ยวข้องกับชุด (เช่นท่อฟอกไตและ squashing ชิ้นส่วนเจลระหว่าง parafilm เพื่อบีบออกดีเอ็นเอในการแก้ปัญหา) แต่มักจะใช้วิธีการเหล่านี้ส่งผลให้ระดับสูงของสารปนเปื้อนและผลตอบแทนดีเอ็นเอต่ำ

ชุดสกัดดีเอ็นเอเจลมักจะประกอบด้วยลูกปัดหรือคอลัมน์หมุน ขนาดของชิ้นส่วน DNA ที่แต่ละชุดสามารถรองรับได้อาจแตกต่างกันไปดังนั้นให้ตรวจสอบว่าชุดนี้จะแยกช่วงขนาดของ DNA ที่คุณกำลังทำงานอยู่ ชุดส่วนใหญ่ครอบคลุมตั้งแต่ 100 bp - 5 Kb แต่บางชุดมีความจุต่ำกว่าหรือสูงกว่า

หลักการของทั้งคอลัมน์หมุนและชุดลูกปัดคือการผูกดีเอ็นเอกับบางสิ่งบางอย่าง (โดยปกติจะเป็นซิลิกาเรซิน) แล้วล้างสิ่งปนเปื้อนออกไปโดยการอัดเม็ดหรือล้างคอลัมน์ ขั้นตอนการละลายสุดท้ายจะปล่อยดีเอ็นเอออกจากเรซิน/ลูกปัด/คอลัมน์เพื่อให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สะอาดแก่คุณ อย่างไรก็ตามแม้ชุดสกัดที่ดีที่สุดก็ยังสามารถพกพาได้แม้ว่าสารปนเปื้อนบางอย่างและด้วยเหตุนี้ควรหลีกเลี่ยงการใช้สารละลายปริมาณมากที่ผลิตโดยการสกัดเจลในเอ็น บางครั้ง ' การเพิ่มน้อยลงจะมากขึ้น ' เมื่อพูดถึงการเพิ่มชิ้นส่วนของคุณลงใน ligation ของคุณ พยายามหลีกเลี่ยงการทำให้ ligation ประกอบด้วยปริมาณมากกว่า 30% ของของเหลวที่แยกได้โดยการสกัดเจล

ความผันแปรของชุดสกัดเจล

เราได้ทดสอบชุดสกัดดีเอ็นเอเจลหกชุดในห้องปฏิบัติการของเราแบบหัวต่อหัวเพราะกระบวนการนี้มีความสำคัญต่องานของเรามาก เราพบว่าในขณะที่ชุดเครื่องมือบางชุดให้ผลตอบแทนสูงและดีเอ็นเอบริสุทธิ์อย่างต่อเนื่องบางครั้งก็ให้ผลตอบแทนที่ดีแต่บางครั้งก็ล้มเหลวและอื่นๆก็ทำงานได้ไม่ดีอย่างต่อเนื่อง

ถ้าคุณเจลแยกชิ้นส่วนจาก plastid คุณควรคาดหวังว่าตัวเลขความเข้มข้นของ DNA (ถ้าใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์) จะต่ำเพราะคุณจะเริ่มต้นด้วย plastid ขนาดใหญ่ (น่าจะประมาณ 5 kb) จากนั้นตัดเศษส่วนย่อยที่เล็กกว่ามาก (อาจเป็น 1 kb) และชุดจะไม่ฟอกดีเอ็นเอ 100% จากเจล ดังนั้นอัตราผลตอบแทนของ 20 กรัม/ul ในปริมาณรวม 35 ลิตรสำหรับชิ้นส่วน 1 กิโลไบต์ที่แยกได้จากดีเอ็นเอ plamsid 5 กรัม (5 กิโลไบต์) จะไม่เลวร้ายเกินไป (ร้อยละ 70 ของดีเอ็นเอได้รับการกู้คืน)

เรามักพบว่าบ่อยครั้งที่ระดับของสารปนเปื้อนหรือคุณภาพการเตรียมดีเอ็นเอเป็นปัจจัยสำคัญในการสร้างความสำเร็จในการโคลนแทนที่จะเป็นผลผลิตของดีเอ็นเอ นอกจากนี้เรายังได้สังเกตอย่างต่อเนื่องว่าบางครั้งการเพิ่มส่วนมากขึ้นในการควบจะช่วยลดความสำเร็จในการโคลนเมื่อเทียบกับปฏิกิริยาเดียวกันที่มีน้อยกว่าเล็กน้อย แม้ว่านี่อาจเป็นเพราะปลาย DNA พิเศษทำให้เส้นเอ็นหลุดออกจากปลายเวกเตอร์การเพิ่มวัสดุที่สกัดจากเจลมากเกินไปอาจมีส่วนร่วมเนื่องจากสารปนเปื้อนในยา PrEP จากเจลในระดับต่ำ

การอบดีเอ็นเอ Oligos สำหรับ ligation

แนวคิดพื้นฐานของการหลอม oligos คือการให้ความร้อนแก่ oligonucleotides สองตัวขึ้นไปซึ่งทำให้พวกเขามีความสูงขึ้นจากนั้นทำตามนี้ตามด้วยระยะเวลาของการระบายความร้อนเพื่อให้ oligos ทั้งสองคู่เข้าด้วยกัน สำหรับ oligos ที่กำหนดเองโปรดดู oligo) กระบวนการนี้มักใช้ในการเตรียมส่วนดีเอ็นเอสั้นๆสำหรับ:

• สร้างภูมิภาคดีเอ็นเอ shrna สำหรับ ligation
• การสร้างภูมิภาค DNA microRNA สำหรับการติด
• การเพิ่มตัวเชื่อมโยงเพื่อเอาออกหรือเพิ่มไซต์การจำกัด
• การศึกษาที่ต้องการพื้นที่ดีเอ็นเอที่ติดอยู่สองชั้นขนาดเล็กเช่นการวิเคราะห์โปรตีนดีเอ็นเอที่มีผลผูกพัน

ค่าใช้จ่ายในการซื้อ oligos ฟอสฟอรัสจำนวนมากสามารถเป็นสิ่งต้องห้าม ด้วยเหตุนี้หลายกลุ่มจึงรวม oligos เข้ากับเวกเตอร์ที่ไม่มีฟอสฟอรัส ซึ่งจะมีประสิทธิภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อ oligos จะถูกควบเข้ากับเวกเตอร์ที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ข้อจำกัดสองตัวที่มีปลายที่เข้ากันไม่ได้ (ป้องกันไม่ให้เวกเตอร์ปิดตัวเอง) พื้นหลังจาก ligation อาจจะยังคงสูงแต่ oligos มักจะอยู่ในส่วนเกินที่สำคัญใน ligations oligo และเพื่อให้ปฏิกิริยาควรยังคงทำงาน

นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะ phosphorylate oligos ก่อนใช้ polynucleotide kinase (PNK) แต่การทำความสะอาด oligos เป็นเรื่องยากเพราะพวกเขามีแนวโน้มที่จะไม่ผูกคอลัมน์ทำความสะอาดดีเอ็นเอเนื่องจากความยาวสั้นของพวกเขา อย่างไรก็ตามปฏิกิริยา PNK จะดำเนินการในบัฟเฟอร์ ligase ดังนั้นอาจไม่จำเป็นแต่ต้องใช้ความร้อน PNK ก่อนที่จะใส่ oligo ลงใน ligation มิฉะนั้น PNK จะฟอสฟอรัสเวกเตอร์ของคุณ

Phosphoramidite chemistry ซึ่งผลิตโดยทั่วไป oligos สามารถพึ่งพาในการผลิตฐาน 40-50 โดยไม่มีข้อผิดพลาดมากเกินไปอย่างไรก็ตามการใช้เทคนิคนี้ในการผลิต oligos ของฐาน 100 หรือนานกว่ามักจะนำไปสู่การกลายพันธุ์ เราพบบ่อยว่ามันจะดีกว่าที่จะแบ่ง oligo ยาวเป็นสอง oligos สั้นกับ 10-15 คู่ฐานของการทับซ้อนกันในช่วงกลางใน oligo ฝ่ายตรงข้ามเพื่อให้พวกเขาสามารถเข้าร่วมกัน ความถี่ของการกลายพันธุ์ที่คุณจะได้รับหลังจากการจัดลำดับควรจะต่ำกว่ามาก

พิจารณาขั้นตอนการระบายความร้อน เราได้ลองทำให้ oligos เย็นลงในอ่างน้ำเพียงแค่ให้ความร้อน 95 องศาแล้วปิดเครื่องเพื่อให้เย็นลง หรือโดยการให้ความร้อน 100 องศาในถ้วยบีเกอร์บนขาตั้งกล้อง (โรงเรียนเก่า) แล้ววางถ้วยบีเกอร์ในน้ำเย็น (และ oligos ในหลอดภายในถ้วยบีเกอร์ยังคง) เพื่อให้เย็นลง นอกจากนี้เรายังได้ลองวาง oligos ในเครื่อง PCR ที่มีการเพิ่มขึ้นของการระบายความร้อน 5 องศาทุก 30 วินาที ความจริงก็คือวิธีการนี้ไม่ได้สร้างความแตกต่างอย่างมาก การทิ้งไว้นานเกินไปที่อุณหภูมิสูงอาจทำให้เกิดการย่อยสลายดังนั้นเราจึงหลีกเลี่ยงการปิดอ่างน้ำ โดยทั่วไปเราจะอุ่น oligos ให้ถึง 95 องศาในอ่างน้ำในถ้วยบีเกอร์โดยใช้หลอด oligos ใน Eppendorf ลอย จากนั้นวางไว้ในน้ำเย็นเป็นเวลา 10 นาที ดูเหมือนว่าจะใช้งานได้ดีสำหรับเราแต่วิธีการอื่นๆอาจใช้ได้สำหรับคุณ

การออกแบบ oligos ที่มีระยะยื่นซึ่งจะทำให้เว็บไซต์ที่จะใส่ oligo เข้าไปนั้นยาก แผนภาพด้านล่างนี้แสดงตัวอย่างของลักษณะของ Oligos ในตัวอย่างนี้ Oligos จะถูกรวมไว้กับไซต์ควบคุม Ncoi และ Xbai

Annealing DNA Oligos Protocol

เคล็ดลับ: หุ้น oligo และ primer มักจะถูกปรับใหม่ที่ความเข้มข้น 100 µM (100 picomoles/ul)

1. เพิ่ม 10 µL ของ oligos หุ้น (สมมติว่าคุณมีสองเพื่อหลอม) ไป 25 µ น้ำฟรี Lnuclease (หมายเลขแคตตาล็อก W4502)ลงในหลอดขนาดเล็ก 1.5 มล.
2. เพิ่มบัฟเฟอร์ย่อยข้อ µL กัด 5 รายการ (เช่น NaCl 100 มม. (หมายเลขแคตตาล็อก S3014), 50 มม. Tris-HCl (แคตตาล็อกหมายเลข 93362), 10 มม. MgCl₂ (หมายเลขแคตตาล็อก M0250), 1 มม. Dithiothriitol (หมายเลขแคตตาล็อก D0632),pH 7.9 การปรากฏตัวของบัฟเฟอร์ช่วยให้ pH ถูกต้องสำหรับความมั่นคงของดีเอ็นเอและเกลือควรส่งเสริมการหลอม ตอนนี้ความเข้มข้นของ oligo อยู่ที่ 20 picomoles/ul
3. ลอยท่อในถ้วยบีเกอร์ในน้ำที่อุ่นไว้ล่วงหน้าถึง 95 องศาเป็นเวลา 5 นาที
4. ใส่ถ้วยบีเกอร์ลงในกล่องใส่น้ำแข็งที่มีน้ำแข็งและน้ำเพื่อให้ถ้วยบีเกอร์เย็นลงเป็นเวลา 10 นาที
5. เมื่อน้ำในถ้วยบีเกอร์เย็นลงแล้วให้เจือจาง oligos 10 เท่าและ 100 เท่าในน้ำและเพิ่ม 1 µL ของสิ่งนี้ลงในปฏิกิริยา ligation มาตรฐาน 20 µL สิ่งล่อใจคือการเพิ่มมากขึ้นแต่สิ่งนี้จะไทเทรตเอ็นออกไปจากจุดสิ้นสุดของเวกเตอร์ของคุณไปยัง oligos พิเศษซึ่งสามารถลดประสิทธิภาพของ ligation ความเข้มข้นสุดท้ายของ oligos ใน ligation จะอยู่ที่ประมาณ 2 หรือ 0.2 picomoles/ µL นี่จะยังคงเป็นส่วนเกินที่สำคัญของ oligos กับเวกเตอร์

เติมฟอสเฟต 5 ฟุตลงในดีเอ็นเอ

เอ็นเอ็นเอ็นเอ T4 จำเป็นต้องใช้ฟอสเฟต 5’บนโมเลกุลดีเอ็นเอหนึ่งที่จะถูกควบเพื่อเข้าร่วมดีเอ็นเอด้วยเหตุนี้จึงมักจำเป็นต้องมีโมเลกุลดีเอ็นเอฟอสฟอรัสก่อนที่จะเพิ่มลงใน ligation ตัวอย่างเช่นเมื่อการโคลนนิ่งผลิตภัณฑ์ PCR

โปรโตคอลการฟอสฟอรัส DNA

น้ำฟรีนิวไคลด์ (หมายเลขแคตตาล็อก W4502): 4.5
ผลิตภัณฑ์ PCR หรือดีเอ็นเออื่นๆ (ทำความสะอาด): 4 ul (หากผลิตภัณฑ์ PCR ของคุณมีระยะห่าง 5 ฟุตหรือปลายทื่อให้อุ่นที่ อุณหภูมิ 70°C เป็นเวลา 5 นาทีและเย็นลงบนน้ำแข็งก่อนที่จะเติมลงในปฏิกิริยา)
บัฟเฟอร์ไลกาส DNA T4 10 x: 1 ul (ใช้บัฟเฟอร์ ligase เนื่องจากมี ATP)
t4 polynucleotide kinase: 0.5 ล

บ่มปฏิกิริยาไคเนสเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C จากนั้นสามารถใช้ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีฟอสฟอรัสโดยตรงในปฏิกิริยาการติดโดยไม่ต้องทำความสะอาด (ตัวอย่างเช่นเมื่อทำการกลายพันธุ์โดยตรงในไซต์) หากผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกยึดเข้ากับเวกเตอร์ที่ปราศจากฟอสฟอรัสการปิดใช้งานความร้อนของเอนไซม์ PNK อาจเป็นความคิดที่ดีที่จะป้องกันไม่ให้เกิดฟอสฟอรัสเป็นเวกเตอร์กระดูกกระดูกสันหลังและนำไปสู่พื้นหลังสูง ซึ่งสามารถทำได้โดยการบ่มเพาะปฏิกิริยาเป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิ 65°C

Dephosphorylating DNA

วัตถุประสงค์ของการลดฟอสฟอรัสเวกเตอร์คือการป้องกันไม่ให้มันเอ็นกลับมาในตัวเองในระหว่างขั้นตอนการติดโดยการลบกลุ่มฟอสเฟต 5 ' ที่จำเป็นโดยเอ็นเอเพื่อเข้าร่วมกระดูกสันหลังดีเอ็นเอ phosphodiester ร่วมกัน มีอัลคาไลน์ฟอสฟาเทสหลากหลายชนิดรวมถึง Calf ลำไส้ Phosphatase (CIP) กุ้งและแอนตาร์กติกฟอสฟาเทส CIP (หมายเลขแคตตาล็อก P4978)เป็นที่นิยมมากที่สุดแต่มันเป็นเรื่องยากที่จะทำให้ความร้อนไม่ทำงาน อุณหภูมิและบัฟเฟอร์ของเอนไซม์ที่แตกต่างกันอาจแตกต่างกันโปรดดูคำแนะนำของผู้ผลิต

โปรโตคอลดีเอ็นเอ dephosphorylation สำหรับดีเอ็นเอ dephosphorylating ในปฏิกิริยาย่อยข้อจำกัด

50-100 µL ของดีเอ็นเอ (5µg) ในปฏิกิริยาย่อยข้อ
µL กัด/สารละลาย 1-2 ไม µL รเมตรของเอนไซม์ CIP (1 หน่วย/ไม รเมตร)

1. เพิ่ม CIP 1-2 รายการในข้อมูลสรุปข้อ µL กัดของคุณ CIP มีเสถียรภาพและใช้งานได้ดีในบัฟเฟอร์การย่อยอาหารที่มีข้อจำกัดมากที่สุด
2. บ่มตัวอย่างเป็นเวลา 30-60 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C

โปรโตคอลดีเอ็นเอ dephosphorylation สำหรับดีเอ็นเอ dephosphorylating ใน TE หรือ H₂O

20-40 µL ของดีเอ็นเอ (5µg) ใน TE (หมายเลขแคตตาล็อก T9285) o rnuclease H₂O (หมายเลขแคตตาล็อก W4502)
5 µL ของบัฟเฟอร์ 10 x CIP
1-2 µL ของเอนไซม์ CIP (1 หน่วย/µL)
ทำได้ถึง 50 µL

1. ใน Eppendorf ขนาด 1.5 มล. ที่ผ่านการฆ่าเชื้อให้เพิ่มดีเอ็นเอจากนั้นบัฟเฟอร์ CIP และ CIP 1-2 µL ของ CIP
2. ผสมให้เข้ากันด้วยปิเปตต์ทิปและบ่มเป็นเวลา 30-60 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C

เคล็ดลับที่ 1: ตรวจสอบให้แน่ใจว่าชิ้นส่วนของคุณที่คุณจะติดเข้าไปในเวกเตอร์ dephosphorylated มีกลุ่ม 5 'phosphate โอลิโกมาตรฐาน/ไพรเมอร์และผลิตภัณฑ์ PCR โดยทั่วไปจะไม่มีฟอสฟอรัสและต้องได้รับการรักษาด้วยโพลีนิวคลีโอไทด์ไคเนส T4 (ดูที่ phosphorylating 5 ' สิ้นสุด) โดยปกติแล้วการเพิ่มไซต์การจำกัดลงในส่วนท้ายของผลิตภัณฑ์ PCR จะง่ายกว่า (บวกกับคู่ฐานพิเศษสองสามคู่ที่ส่วนท้าย) แทนที่จะเป็นฟอสฟอรัสส่วน

เคล็ดลับที่ 2: CIP ถูกเก็บไว้ในบัฟเฟอร์กลีเซอรอลเพื่อความมั่นคงแต่นั่นหมายความว่ามันจมลงไปที่ด้านล่างของสารละลายในน้ำ เมื่อเพิ่ม CIP ให้ดูที่ส่วนผสมของ DNA โดยใช้หลอดที่อยู่ด้านหน้าของคุณแล้วตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ถูกระงับใหม่อย่างถูกต้องก่อนการบ่ม

โปรโตคอลการโคลน DNA Blunt

บางครั้งมันเป็นสิ่งจำเป็นที่จะทำให้ปลายของโมเลกุลดีเอ็นเอทื่อตัวอย่างเช่น:

• เมื่อสร้างห้องสมุดดีเอ็นเอ
• ดีเอ็นเอที่ฉีกขาดด้วยปลายขรุขระที่จำเป็นต้องโคลนเป็นเวกเตอร์

ในสถานการณ์ที่การเลือกเว็บไซต์ข้อจำกัดที่เข้ากันได้เป็นไปไม่ได้ที่จะต้องมีเวกเตอร์และแทรกหรือทั้งสองอย่างที่จะผิดพลาดก่อนที่จะควบ (อาจเป็นทางเลือกสุดท้าย) มีสองทางเลือกคือใช้ DNA polymerase (เช่น Klenow หรือ T4) หรือ Mung bean nuclease Klenow และ T4 DNA polymerases ทั้งกรอก 5 ' ยื่นและเคี้ยวกลับ 3 ' ยื่น หากคุณต้องการเติมเอนไซม์ 5 ' ที่ยื่นออกมาจะดีแต่ถ้าคุณต้องการลบส่วนยื่น 3 ' T4 อาจเป็นทางเลือกที่ดีกว่าเนื่องจากมีกิจกรรม exonuclease 3 ' ถึง 5 ' ที่แข็งแกร่งกว่า Mung bean nuclease เคี้ยวทั้ง 5 และ 3 ' ยื่นออกมา

Klenow โปรโตคอลการด่า

1. ดีเอ็นเอควรละลายในบัฟเฟอร์ย่อย 1 เท่าหรือบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา μM ดีเอ็นเอของไลกาเสะ T4 เสริมด้วย 33 μ m แต่ละ dNTP [ ความเข้มข้นสุดท้าย ]
2. เติม Klenow 1 หน่วยต่อดีเอ็นเอหนึ่งไมโครกรัมและบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 25°C
3. หยุดปฏิกิริยาโดยการเพิ่ม EDTA ลงในความเข้มข้นสุดท้าย 10 มม. แล้วให้ความร้อนที่ 75°C เป็นเวลา 20 นาที

วิธี T4 Blunting

1. ดีเอ็นเอควรละลายในบัฟเฟอร์ย่อยข้อ µM กัด 1 เท่าและเสริมด้วย dNTP 100 μ s [ ขั้นสุดท้าย ]
2. เพิ่ม 1 หน่วย T4 DNA Polymerase ต่อ DNA ไมโครกรัมและบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่ 12°C
3. หยุดปฏิกิริยาโดยการเพิ่ม EDTA ลงในความเข้มข้นสุดท้าย 10 มม. และให้ความร้อนที่ 75°C เป็นเวลา 20 นาที

วิธีการ Mung Bean Nuclease Blunting

1. ระงับดีเอ็นเอ (0.1 ไม μg รเมตร/ไม μL รเมตร) ในบัฟเฟอร์ 1 เท่าของ Mung Bean Nuclease Buffer หรือบัฟเฟอร์เอนไซม์ที่มีข้อ กัด
2. เพิ่ม 1.0 หน่วยของ Mung Bean Nuclease ต่อ μg DNA
3. บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 30 นาที

อย่าพยายามให้ความร้อนกระตุ้นนิวไคลีถั่วมูลเนื่องจากอาจมีดีเอ็นเอที่ติดอยู่ในบริเวณเดียวก่อนที่เอนไซม์จะถูกปิดใช้งานส่งผลให้การย่อยสลายโดยไม่ได้ตั้งใจ ยับยั้งเอนไซม์โดยการทำให้บริสุทธิ์คอลัมน์หมุนหรือโดยการสกัดฟีนอล/คลอโรฟอร์มและการตกตะกอนเอทานอล

โปรโตคอลเอ็นเอ

ในระหว่างกระบวนการโคลนถนนทั้งหมดจะนำไปสู่การติดและดังนั้นขั้นตอนทั้งหมดที่นำหน้าจะส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพอย่างมาก เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องอ่านเคล็ดลับและบันทึกย่อในแต่ละส่วนก่อนที่จะเกิดปฏิกิริยาการติด

ปฏิกิริยาการควบจะถูกตั้งค่าพร้อมกับการควบคุม โดยปกติแล้วคุณจะมีตัวควบคุมสองตัวซึ่งได้แก่:

• เวกเตอร์เพียงอย่างเดียวโดยไม่ต้อง ligase (การควบคุมสำหรับเวกเตอร์ที่ไม่ได้ตัด)
• เวกเตอร์ที่มี ligase (ตัวควบคุมสำหรับ dephosphorylation ไม่เพียงพอเมื่อใช้ในการสร้างด้วยการควบคุม 1
• การรวมตัวจริงซึ่งเป็นเวกเตอร์ + ส่วน + ligase

หากคุณมีอาณานิคมในการควบคุม 1 แล้วการย่อยข้อจำกัดของเวกเตอร์ของคุณไม่ทำงานเพราะคุณมีอาณานิคมแม้ไม่มี ligase หากคุณมีอาณานิคมในการควบคุม 2 แต่ไม่ใช่ 1 การรักษาด้วยอัลคาไลน์ฟอสฟาเทสของคุณไม่ทำงาน นี่เป็นเพราะการย่อยของคุณทำงานได้ดี (ไม่มีอาณานิคมในการควบคุม 1 แต่เอ็นสามารถหมุนเวียนพลาสติกได้อีกครั้งเนื่องจากฟอสเฟต 5 ' ไม่ถูกลบออกในระหว่างการลดฟอสฟอรัส หากคุณมีอาณานิคมใน 3 และไม่มี (หรือน้อยกว่า) ใน 1 และ 2 คุณควรแสดงความยินดีกับตัวเองเลือกอาณานิคมบางแห่งและกลับบ้านเพื่อดื่มชาเพื่อฉลอง

สภาวะการตอบสนองอาจแตกต่างกันไปในแต่ละห้องปฏิบัติการ ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดจะได้ที่อุณหภูมิ 16°C ในชั่วข้ามคืนแต่หมายถึงการเพิ่มวันพิเศษลงในกระบวนการทั้งหมด (ทำให้เป็นรอบการโคลน 4 วัน) การทำ ligation ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงมักจะให้ผลลัพธ์ที่ดีและลดการโคลนเป็น 3 วันสำหรับรอบที่สมบูรณ์ นี่คือสิ่งที่คุณไม่รังเกียจวันแรกที่ยาวนาน

เอ็นสองประเภทที่ยากที่สุดคือการรวมผลิตภัณฑ์ PCR และการควบทื่อ คุณควรคาดหวังว่าสิ่งเหล่านี้จะมีประสิทธิภาพน้อยกว่าการโคลนชิ้นส่วนมาตรฐานจากเวกเตอร์หนึ่งไปยังอีกเวกเตอร์หนึ่ง

ปฏิกิริยาทั่วไปสามารถตั้งค่าได้ดังนี้:

1. เริ่มการตั้งค่าปฏิกิริยาโดยการเพิ่มส่วนประกอบที่ใช้ร่วมกันสำหรับปฏิกิริยาทั้งหมดเช่นเติมน้ำแล้วใส่บัฟเฟอร์แล้วจึงใส่เวกเตอร์ลงในหลอดแต่ละหลอด
2. จากนั้นเพิ่มชิ้นส่วนลงในหลอด ligation
3. สุดท้ายเพิ่ม ligase ลงในหลอด ligation และหลอดควบคุมที่ถูกต้อง อย่าหมุนวนปฏิกิริยาเนื่องจากเอ็นเอ็นเอมีความไวต่อแรงเฉือน ให้ผสมกับส่วนปลายที่คุณเพิ่มเข้าไปด้วยโดยการคนให้เข้ากันและ/หรือสะบัดเบาๆบนท่อด้วยนิ้วของคุณ
4. บ่มเชื้อเป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหรือ 16°C ค้างคืน บางคนให้ความร้อนปิดใช้งาน ligation ที่ 65°C เป็นเวลา 20 นาทีแต่ไม่จำเป็นอย่างเคร่งครัด
5. เมื่อเอ็นเสร็จแล้วให้ใช้พลาสมามิดเพื่อเปลี่ยนแบคทีเรียเพื่อให้คุณสามารถแสดงโปรตีนได้โดยตรงหรือปลูกสำเนาดีเอ็นเอพลาสมามิดจำนวนมากเพื่อใช้ต่อไป

เคล็ดลับที่ 1: บีเอสเอในบัฟเฟอร์ ligase สามารถตกตะกอนออกจากการละลายน้ำแข็งมองเห็นได้เป็นตะกอนสีขาวที่ด้านล่างของบัฟเฟอร์ ระงับการใช้งานอีกครั้งโดยการหมุนวนและอุ่นระหว่างนิ้วของคุณชั่วคราวหรือที่อุณหภูมิ 37°C

เคล็ดลับที่ 2: บัฟเฟอร์ ligase มี ATP ซึ่งจะลดลงหลังจากละลายน้ำแข็งหลายรอบ เก็บสต็อกบัฟเฟอร์ไว้ในอะลิควอทขนาดเล็กและทิ้งไปหลังจาก > 3 รอบ

เคล็ดลับที่ 3: ทำให้เอ็นของคุณร้อน (ก่อนเพิ่มเอนไซม์) ถึง 37°C เป็นเวลาสองสามนาทีเพื่อเปิดปลายเหนียวหรือช่วยให้เป็นเส้นตรงเวกเตอร์ที่หมุนวนซ้ำชั่วคราวเมื่อใช้การจำกัดตำแหน่งเดียว เย็น ligation กลับไปที่อุณหภูมิห้องก่อนที่จะเพิ่มเอนไซม์เพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหาย ligase เมื่อคุณเพิ่ม เราไม่ได้ทำเช่นนี้แต่เราได้ยินมาว่ามันสามารถช่วยได้จากคนอื่นๆที่ทำ

เคล็ดลับที่ 4: การรักษาผลิตภัณฑ์ PCR ด้วย Proteinase K ก่อนที่จะมีการรายงานการติดเพื่อช่วยในการติด เจลที่แยกออกจากผลิตภัณฑ์ PCR จะทำให้ไม่จำเป็นต้องทำเช่นนี้เช่นเดียวกับการใช้ชุดทำความสะอาด PCR เพื่อทำให้บริสุทธิ์

เคล็ดลับที่ 5 หลีกเลี่ยงการเปิดเผย DNA ของคุณต่อ UV เมื่อสกัดจากเจล ซึ่งจะช่วยลดประสิทธิภาพในการติดเอ็นลงได้อย่างมากในบางกรณี

เคล็ดลับที่ 6 หลีกเลี่ยงการใช้ปริมาณ ligation รวมมากกว่า 20 - 30% (โดยปกติปริมาณรวมคือ 20 μL) ของวัสดุเจลบริสุทธิ์ หากคุณทำคุณอาจมีเกลือและสารปนเปื้อนอื่นๆมากเกินไปในปฏิกิริยาของคุณและประสิทธิภาพการติดอาจลดลง

เคล็ดลับที่ 7: ปริมาณเวกเตอร์ควรจะมองเห็นได้ยากหากคุณใช้มันกับเจล agarose ดังนั้นประมาณ 20-30 นาโนกรัม เศษชิ้นส่วนควรมีความอุดมสมบูรณ์มากขึ้นแต่ไม่เกิน 5 - 10 เท่าเข้มข้นเมื่อเทียบกับเวกเตอร์ โดยปกติเราใช้เวกเตอร์ 1:2 หรือ 1:3 กับอัตราส่วนส่วน.

การคำนวณอัตราส่วนแทรกต่อเวกเตอร์

อัตราส่วนการแทรกต่อเวกเตอร์โมลาร์อาจมีผลอย่างมากต่อผลลัพธ์ของการรวมและขั้นตอนการแปลงที่ตามมา อัตราส่วนโมลาร์อาจแตกต่างกันไปตั้งแต่การแทรกแบบ 1:1 ไปจนถึงเวกเตอร์ไปจนถึงอัตราส่วน 1: 10 1 อาจจำเป็นต้องลองใช้อัตราส่วนหลายแบบขนานเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด การคำนวณด้านล่างจะบอกจำนวนเศษส่วนกับเราความสัมพันธ์กับเวกเตอร์ที่อัตราส่วน 6:1 (ส่วน: เวกเตอร์) เปลี่ยนค่า 3 เป็นค่าใดก็ได้เพื่อหาค่าความเข้มข้นทางเลือก

เว็บไซต์กำกับโครงการศึกษา Mutagenesis

เว็บไซต์กำกับ Mutagenesis (SDM) เป็นเทคนิคที่มีประโยชน์สำหรับการแนะนำการกลายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงลงใน plasmid ที่เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจง การกลายพันธุ์อาจเป็นการแทนที่การแทรกหรือการลบก็ได้ มีการใช้งานหลายอย่างสำหรับ SDM, ตัวอย่างเช่นการประเมินการทำงานของกรดอะมิโนบางอย่างในเอนไซม์, เพื่อตรวจสอบผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงฐานในโปรโมเตอร์หรือลบเว็บไซต์จำกัดจากพลาสมา.

ที่นี่เราจะอธิบายถึงวิธีการสร้างการกลายพันธุ์โดยตรงในไซต์ PCR หลักการพื้นฐานคือการออกแบบสีรองพื้น PCR คู่หนึ่งกลับไปด้านหลังเพื่อให้ plasmid ทั้งหมดถูกขยายโดย PCR หนึ่งในไพรเมอร์เหล่านี้รวมเอาการกลายพันธุ์ที่ต้องการ PCR จะสร้างผลิตภัณฑ์เชิงเส้นที่ปลายสามารถเชื่อมเข้าด้วยกัน (หลังการเกิดฟอสฟอรัส) ด้วยเอ็นเอ็นเอ เวกเตอร์ทรงกลมจะเปลี่ยนเป็น E. coli

Step 1: กระบวนการกลายพันธุ์และการออกแบบ Primer

ดีไซน์ไพรเมอร์คู่หนึ่งที่ผสมผสานการกลายพันธุ์ที่คุณต้องการเข้ากับปลายด้านที่ 5 ของหนึ่งในนั้น ออกแบบให้พื้นที่ส่วนเสริมมี TM ที่อุณหภูมิประมาณ 60°C

Example:

โปรดทราบว่ามีเพียงไพรเมอร์ไปข้างหน้าเท่านั้นที่มีการกลายพันธุ์ดังนั้นคุณจึงสามารถสร้างชุดของการกลายพันธุ์ที่แตกต่างกันได้อย่างง่ายดายโดยการรักษาไพรเมอร์ย้อนกลับเหมือนกันแต่ใช้ไพรเมอร์ไปข้างหน้าที่แตกต่างกัน ตัวอย่างด้านบนคือการแทนที่ 3 bp แต่สามารถแทรกได้ในลักษณะเดียวกัน หากคุณต้องการการแทนที่หรือการแทรกที่มีขนาดใหญ่มากฐานที่กลายพันธุ์อาจถูกนำมาใช้ที่ปลาย 5 ' ของทั้งสองไพรเมอร์

การลบขนาดใดก็ได้สามารถทำได้โดยการเว้นระยะไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับออกจากกันบนเทมเพลต

โดยปกติแล้วไพรเมอร์ PCR จะมาโดยไม่มีกลุ่มฟอสเฟตบนเทอร์มินิขนาด 5 ฟุตเนื่องจากวิธีการสังเคราะห์ ซึ่งหมายความว่าส่วนปลายของผลิตภัณฑ์ PCR ไม่สามารถเชื่อมเข้าด้วยกันได้อย่างง่ายดายแต่จะต้องมีฟอสฟอรัสก่อน There are two main options for this: 1) คุณสามารถสั่งซื้อไพรเมอร์ที่มีฟอสเฟตเพิ่มแล้วในปลาย 5 ' หรือ 2 คุณสามารถฟอสฟอรัสผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้โพลีนิวคลีโอไทด์ไคเนส (PNK) ไพรเมอร์ฟอสฟอรัสเป็นความคิดที่ดีถ้าคุณทำ SDMs เพียงไม่กี่และไม่มี PNK ใดๆในตู้แช่แข็ง (บวกกับมันตัดออกขั้นตอน) การใช้ PNK จะมีประสิทธิภาพมากขึ้นหากคุณใช้ SDMS จำนวนมาก (อาจจะ 10 หรือมากกว่า)

Step 2: PCR

สิ่งสำคัญคือต้องใช้พอลิเมอเลสพิสูจน์อักษรเพื่อหลีกเลี่ยงการกลายพันธุ์อื่นๆ ที่กล่าวว่าถ้าคุณยังคงกังวลเกี่ยวกับการแนะนำการกลายพันธุ์คุณสามารถย่อยโคลนชิ้นส่วนกลายพันธุ์กลับเข้าไปในกระดูกสันหลังเดียวกันหลังจากการกลายพันธุ์

เนื่องจากวิธีการนี้ใช้ PCR จึงมีแนวโน้มที่จะทำงานได้ดีขึ้นกับพลาสมิดที่มีขนาดเล็กกว่า ควรปฏิบัติตามคำแนะนำที่มาพร้อมกับพอลิเมอเรสแต่ควรตั้งค่า PCR ที่คล้ายกับตัวอย่างนี้:

35.5 μL น้ำ
5 μL 10 x บัฟเฟอร์โพลิเมอร์
1.5 μL ไพรเมอร์ไปข้างหน้า (0 3μM สุดท้าย)
1.5 μL Reverse Primer (รอบสุดท้าย 0.3 μM)
5 ul dNTPs (รอบชิงชนะเลิศ 200 μM)
1 ul Template DNA (การเจือจาง 1 ใน 100 ของ mini-PrEP)
0.5 μL พอลิเมอเรส

ตั้งค่าการตอบสนองบนน้ำแข็งและถ่ายหลอดไปยังบล็อก PCR ที่อุ่นไว้ล่วงหน้าโดยตรงหลังจากผสมปฏิกิริยา

PCR program:

1. 98°C 60 วินาที
   
2. 98°C 8 วินาที
   
3. 55-65°C 20 วินาที
   
4. 72°C (เวลาในการยืดตัวขึ้นอยู่กับขนาด plasmid และประเภทของพอลิเมอเรสที่ใช้) ทำซ้ำ/รอบขั้นตอน 2-4 A เพิ่มเติม 27-30 ครั้ง
   572°C 5 นาที

Hold at room temperature.

Step 3: ทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR

เรียกใช้ปฏิกิริยาทั้งหมดบน เจล nagarose μL แถบและทำความสะอาดดีเอ็นเอโดยใช้ชุดสกัดเจล, eluting มันใน 30 μ m

Step 4: ฟอสฟอรัสเทอร์มินิ 5

* ขั้นตอนนี้สามารถละเว้นได้หากคุณใช้ phosphorylated oligos ใน PCR

4.5 μL น้ำปลอดสารนิวเคลียร์ (หมายเลขแคตตาล็อก W4502)
 ผลิตภัณฑ์ PCR
1 μL 10 x T4 บัฟเฟอร์ดีเอ็นเอ Ligase *
0.5 μL T4 polynucleotide kinase

บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 40 นาที

* ใช้บัฟเฟอร์ Ligase เนื่องจากมี ATP และ PNK อยู่แล้ว

Step 5: เอ็นเอจะจบลง

ตั้งค่า การปรับปรุงคุณสมบัติ บนน้ำแข็ง

6.7 μL น้ำปลอดสารนิวเคลียร์ (หมายเลขแคตตาล็อก W4502)
2
10 μL ปฏิกิริยา PNK (จากขั้นตอนที่ 1) 5 μL 0.8 x T4 บัฟเฟอร์ดีเอ็นเอ Ligase
0.5 μL T4 DNA Ligase

บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 16°C ค้างคืนหรือที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง

Step 6: เปลี่ยนเป็นอีโคไลที่มีความสามารถ

Step 7: ยืนยันการกลายพันธุ์โดยการจัดลำดับ DNA