Elektrokompetentní buňky BL21(DE3)

• Příprava na transformaci
• Informace pro objednání produktu
• Protokol o transformaci
• Protokol o indukci vzorku

Příprava na transformaci

Elektrokompetentní buňkyBL21(DE3) jsou dodávány v 25 μl alikvotech, které postačí na jednu reakci. Transformace se provádí v kyvetě s mezerou 0,1 cm. Optimální nastavení pro elektroporaci je uvedeno v tabulce níže. Všimněte si, že alternativní nastavení vedou k účinnosti transformace o 20-50 % nižší. Typické časové konstanty jsou 3,5 až 4,5 msec.

Pro zajištění úspěšných výsledků transformace je třeba dodržet následující opatření:

• Pro dosažení nejlepších výsledků je třeba ligační reakci před transformací přečistit nebo tepelně usmrtit při 70 ºC po dobu 15 minut.
• Vzorky DNA, které se mají použít pro elektroporaci, musí být rozpuštěny ve vodě nebo v pufru s nízkou iontovou silou, jako je TE. Přítomnost soli ve vzorku pro elektroporaci vede při vysokém napětí ke vzniku oblouku, což má za následek ztrátu buněk a DNA.
  Mikrodestičkové zkumavky a elektroporační kyvety musí být před použitím důkladně předchlazeny na ledu.
• Buňky musí být před použitím zcela rozmraženy na ledu 
  .
• Recovery Media musí být před použitím při pokojové teplotě 
• Pro nejvyšší účinnost transformace použijte k resuspenzi buněk po elektroporaci dodané Expression Recovery Medium. Použití TB nebo jiného média bude mít za následek nižší účinnost transformace.

Transformační protokol

1. Mějte k dispozici expresní regenerační médium a sterilní kultivační zkumavky o rozměrech 17 x 100 mm při pokojové teplotě (jedna zkumavka pro každou transformační reakci).
   Poznámka: Účinnost transformace se může snížit při použití SOC nebo jiných médií.
2. Umístěte elektroporační kyvety (mezera 0,1 cm) a mikrocentrifugační zkumavky na led (jedna kyveta a jedna zkumavka pro každou transformační reakci).
3. Vyjměte elektrokompetentní buňky BL21(DE3) z mrazničky o teplotě -80 °C a umístěte je na mokrý led, dokud se nerozmrazí úplně (10-20 minut).
4. Když jsou buňky rozmrazené, promíchejte je jemným poklepáním. Přidejte 25 μl elektrokompetentních buněk BL21(DE3) do vychlazené mikrocentrifugační zkumavky na ledu.
5. Přidejte 1 μl tepelně denaturované reakce CloneSmart Ligation k 25 μl buněk na ledu. Krátce promíchejte špičkou pipety; nepipetujte  nahoru a dolů, abyste promíchali, což může vnést vzduchové bubliny a zahřát buňky.
   Poznámka: Pokud nedojde k tepelné inaktivaci ligační reakce, zabrání to transformaci.
   Poznámka: Nepoužívejte více než 2 μl ligační směsi, mohlo by dojít k elektrickému oblouku během elektroporace.
6. Opatrně napipetujte 25 μl směsi buněk/DNA do vychlazené elektroporační kyvety, aniž byste do ní vnesli bublinky. Zápěstím rychle mrskněte kyvetou směrem dolů, aby se buňky nanesly po celém dně jamky. Elektroporujte podle podmínek doporučených v Tabulce nastavení elektroporace .
7. Do 10 sekund po pulzu přidejte do kyvety 975 μl Expression Recovery Medium a třikrát pipetujte nahoru a dolů, abyste buňky znovu suspendovali. Přeneste buňky a Recovery Medium do kultivační zkumavky.
8. Umístěte kultivační zkumavku do třepacího inkubátoru při 250 otáčkách za minutu na 1 hodinu při 37 °C.
9. Na LB agarové plotny obsahující příslušné antibiotikum rozetřete až 100 μl transformovaných buněk.
10. Inkubujte destičky přes noc při 37 °C.
11. Transformované klony lze dále pěstovat v LB nebo v jakémkoli jiném médiu bez laktózy

Vzorový indukční protokol

1. Inokulujte jednu kolonii z čerstvě naočkované plotny do 5 ml LB média obsahujícího příslušné antibiotikum pro plazmid a hostitelský kmen.
2. Inkubujte s třepáním při 37 °C přes noc. Pro minimalizaci množství exprese cílového proteinu před indukcí přidejte do růstového média glukózu v koncentraci 0,2 % (w/v).
3. Inokulujte 50 ml LB média obsahujícího příslušné antibiotikum 0,5 ml noční kultury připravené v kroku 2.
4. Inkubujte za třepání při 37 °C, dokud OD600 nedosáhne 0,6 - 0,8.
5. Přidejte IPTG na konečnou koncentraci 1 mM (Připravte 1 M roztok IPTG rozpuštěním 2,38 g IPTG ve vodě a upravte konečný objem na 10 ml. Před použitím sterilizujte filtrem). Pro stanovení optimální koncentrace IPTG pro maximální expresi cílového proteinu vyzkoušejte rozmezí koncentrací IPTG od 0,25 do 2 mM.
6. Inkubujte při 37 °C po dobu 3-4 hodin. Pro stanovení optimální doby pro indukci cílového proteinu se doporučuje provést experiment s časovým průběhem, který se bude lišit v rozmezí 2-16 hodin.
7. Kulturu umístěte na 10 minut na led. Sklízejte buňky centrifugací při 5 000 x g po dobu 10 minut při 4 °C.
8. Odeberte supernatant a buněčný pelet skladujte při -20 °C (skladování při nižších teplotách je rovněž přijatelné).