Řešení tvorby aspartimidu ve Fmoc SPPS pomocí Fmoc-Asp(OBno)-OH

Tvorba aspartimidů^1,2 je způsobena opakovaným vystavením sekvencí obsahujících kyselinu asparagovou působení bází, jako je piperidin, a v konečném důsledku může vést ke vzniku 9 různých vedlejších produktů (obrázek 1)^3-8. Zatímco v mnoha případech lze aspartimidy a α- a β-piperididy vzniklé touto vedlejší reakcí snadno oddělit od cílového peptidu pomocí HPLC, β-aspartylové peptidy a epimerizovaný α-aspartylový peptid je téměř nemožné odstranit, protože mají často stejný retenční čas jako cílový peptid. Kromě toho, jelikož mají stejnou hmotnost jako cílový produkt, je přítomnost těchto vedlejších produktů obtížně zjistitelná. Tvorba aspartimidů je proto při výrobě API na bázi peptidů obzvláště závažným problémem.

Fmoc-Asp(OBno)-OH 1 je jedinečný stavební blok vyvinutý vědci společnosti Novabiochem^® který poskytuje jednoduché a univerzální řešení překonávající tvorbu aspartimidu^9,10 ve standardních Fmoc SPPS.

Obrázek 1. Tvorba aspartimidu, ukazující potenciální vedlejší produkty.

Téměř žádná tvorba aspartimidů, dokonce ani u sekvencí obsahujících Asp-Gly

Ve srovnávacích testech proti Fmoc-Asp(OtBu)-OH a Fmoc-Asp(OMpe)-OH s použitím klasického peptidu Scorpion toxin II (VKDXYI, kde X=G, N nebo R)¹¹ kde se peptidy vázané na pryskyřici ošetřují 20% piperidinem v DMF po dobu 200 min, aby se simulovalo 100 x 2 min deprotekčních cyklů, poskytl Fmoc-Asp(OBno)-OH zdaleka nejlepší výsledky. Pro X=N a R snížil tvorbu aspartimidu na téměř nedetekovatelné množství (obrázek 2, 3, tabulka 1). V případě X=G, což je nejobtížnější situace, se tvorba aspartimidu snížila na pouhých 0,1 %/cyklus, což je zanedbatelné, když uvážíme, že je to v mezích čistoty komerčně dostupných N-α-Fmoc aminokyselin (obrázek 4, tabulka 1).

Zvýšená chirální stabilita

Aspartimidy jsou chirálně labilní⁷, což se odráží ve vysokých hodnotách D-aspartátu pozorovaných u peptidů toxinu štíra II připravených s Asp(OtBu) a Asp(OMpe) (tabulka 1). D-aspartylové peptidy jsou často skrytými kontaminanty purifikovaných peptidů vzhledem k jejich identické molekulové hmotnosti a téměř totožným fyzikálně-chemickým vlastnostem. Nízké hodnoty D-Asp získané s Fmoc-Asp(OBno)-OH silně naznačují jeho použití ve výrobních procesech peptidů.

Snadné párování a žádné alkylační produkty

Standardní Fmoc SPPS z (Gly²)-GLP-2, 33meru, s použitím Fmoc-Asp(OBno)-OH poskytla surovinu, která obsahovala zanedbatelné nečistoty související s aspartimidem, což zvýšilo obsah cílového peptidu o 25 % ve srovnání se standardním derivátem Fmoc-Asp(OtBu)-OH (obrázek 5). Byly použity jednotlivé jednohodinové spojky pro dva Fmoc-Asp(Bno)-OH. Vysoká čistota produktu naznačuje, že Fmoc-Asp(OBno)-OH se spojuje snadno a jeho použití nevedlo ke vzniku žádných vedlejších produktů alkylace souvisejících s Bno během štěpení zprostředkovaného TFA.

Tabulka 1. Složení surových produktů získaných z peptidylových pryskyřic VKDXYI po ošetření 20% piperidinem v DMF při pokojové teplotě. ^a Výpočet rozpadu na cyklus k: rozpad prvního řádu: N = N₀ - e^-kt → k = -ln(N)/t ; N₀ = 1; t = počet cyklů (100); N = % plochy cílového peptidu.

Obrázek 2. UPLC profily surových štěpených peptidů VKDNYI po ošetření 20% piperidinem v DMF po dobu 18 h. 1: produkt; 2: D/L aspartimidy; 3: D/L piperididy. A: vyrobeno s Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: vyrobeno s Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: vyrobeno s Fmoc-Asp(OBno)-OH.

Obrázek 3. UPLC profily surových štěpených peptidů VKDRYI po ošetření 20% piperidinem v DMF po dobu 18 h. 1: produkt; 2: D/L aspartimidy; 3: D/L piperididy. A: vyrobeno s Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: vyrobeno s Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: vyrobeno s Fmoc-Asp(OBno)-OH.

Obrázek 4. UPLC profily surových štěpených peptidů VKDGYI po ošetření 20% piperidinem v DMF po dobu 18 h. 1: produkt; 2: D/L aspartimidy; 3: D/L piperididy. A: vyrobeno s Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: vyrobeno s Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: vyrobeno s Fmoc-Asp(OBno)-OH.

Obrázek 5. UPLC profily surového štěpeného Gly-GLP-2 vyrobeného pomocí A, Fmoc-Asp(OtBu)-OH a B, Fmoc-Asp(OBno)-OH. A: D/L aspartimidy; B: D/L-α/β-piperididy.

Odkazy

1. Barany G, Merrifield RB. in The peptides, Vol. 2, E. Gross & J. Meienhofer (Eds), Academic Press, New York, 1979, pp. .1-234..

2. Bodansky M, Martinez J. (1978). in The peptides, Vol. 5, E. Gross & J. Meienhofer (Eds), Academic Press, New York, 1983, pp. 111-216..

3. Nicolás E, Pedroso E, Girald E. 1989. Formation of aspartimide peptides in Asp-Gly sequences. Tetrahedron Letters. 30(4):497-500. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)95238-9

4. Dölling R. et al. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 853.

5. Yang Y, Sweeney WV, Schneider K, Thörnqvist S, Chait BT, Tam JP. 1994. Aspartimide formation in base-driven 9-fluorenylmethoxycarbonyl chemistry. Tetrahedron Letters. 35(52):9689-9692. https://doi.org/10.1016/0040-4039(94)88360-2

6. Lauer JL, Fields CG, Fields GB. 1995. Sequence dependence of aspartimide formation during 9-fluorenylmethoxycarbonyl solid-phase peptide synthesis. Lett Pept Sci. 1(4):197-205. https://doi.org/10.1007/bf00117955

7. I. Schön, et al. (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 3213..

8. Orpiszewski J, Schormann N, Kluve-Beckerman B, Liepnieks JJ, Benson MD. 2000. Protein aging hypothesis of Alzheimer disease. FASEB j.. 14(9):1255-1263. https://doi.org/10.1096/fasebj.14.9.1255

9. Behrendt R, Huber S, Martí R, White P. 2015. New t-butyl based aspartate protecting groups preventing aspartimide formation in Fmoc SPPS. J. Pept. Sci.. 21(8):680-687. https://doi.org/10.1002/psc.2790

10. Behrendt R, Huber S, White P. 2016. Preventing aspartimide formation in Fmoc SPPS of Asp-Gly containing peptides - practical aspects of new trialkylcarbinol based protecting groups. J. Pept. Sci.. 22(2):92-97. https://doi.org/10.1002/psc.2844

11. Mergler M, Dick F, Sax B, Weiler P, Vorherr T. 2003. The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS. Part I. J. Peptide Sci.. 9(1):36-46. https://doi.org/10.1002/psc.430