Analýza robustní metody amplifikace celého genomu pomocí oligonukleotidového pole CGH

Chad Brueck, Sunny Song¹, Jim Collins¹

Agilent Technologies, 5301 Stevens Creek Blvd., Santa Clara, CA, 95051

Úvod

V posledních letech se zdokonaluje metoda srovnávací genomové hybridizace (aCGH), která umožňuje stanovit chromozomální změny s postupně vyšším rozlišením¹. Tuto rozvíjející se technologii však poněkud brzdí velký vstupní požadavek na DNA - ke zpracování jedné array CGH je obecně zapotřebí minimálně 150 000 kopií lidského genomu neboli 0,5 μg na vzorek. GenomePlex^® Whole Genome Amplification (WGA) poskytuje prostředek ke snížení množství potřebné DNA pro aCGH, což by mohlo rozšířit použití této technologie na analýzu nanogramových množství DNA nebo dokonce jednotlivých buněk. Kromě toho, a to je možná ještě zajímavější, GenomePlex WGA umožňuje výzkumníkům reprezentativně amplifikovat genom ze vzorků, které byly fragmentovány na průměrnou velikost menší než 1 kb. Tato funkce může umožnit analýzu CGH vzorků fixovaných formalínem a zalitých parafínem (FFPE), které byly dříve považovány za nepoužitelné kvůli vysoké míře degradace DNA. V této studii demonstrujeme úspěšné použití DNA WGA na mikročipech Agilent aCGH. Produkt WGA byl rovněž prokázán jako funkční na maticích BAC ^2, 3 a dalších platformách oligo array⁴ .

Materiály a metody

Zdroje DNA

Normální sdružené genomové DNA použité při generování dat Agilent byly zakoupeny od společnosti Promega (čísla produktů G1471 (samci) a G1521 (samice)). DNA HT29 (buněčná linie lidského karcinomu tlustého střeva) použitá společností Agilent byla zakoupena od ATCC (číslo produktu HTB-38D).

Buněčná kultivace a izolace DNA

Buňky karcinomu lidského tlustého střeva HT29 (číslo produktu ATCC HTB-38) byly kultivovány pomocí média McCoy's 5a doplněného 1,5 mM L-glutaminem upraveným tak, aby obsahoval 2,2 g/l hydrogenuhličitanu sodného, 90 %; fetální hovězí sérum, 10 %. Genomová DNA byla extrahována pomocí GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Product G1N70) a byla použita ve vzorcích MilliporeSigma. Genomová DNA normálního muže byla získána z plné krve jedince bez nádorového onemocnění v anamnéze. Genomová DNA byla extrahována pomocí stejné soupravy pro izolaci genomové DNA, jak je popsáno výše, a použita ve vzorcích MilliporeSigma.

Fragmentace genomové DNA

Mužská a ženská genomová DNA byla přerušovaně sonikována pomocí sonikátorové sondy (Digital Sonifier 450, Branson Ultrasonics Corp, CA) po dobu 5 s, 30 s, 90 s nebo 120 s. Fragmentované DNA byly poté naneseny na 1,2% agarózový gel (E-gel Agarose Gels PN# G5000, Invitrogen, CA) , aby bylo možné stanovit distribuci velikosti fragmentů.

GenomePlex WGA

Vzorky DNA byly amplifikovány pomocí sady GenomePlex WGA (produkt WGA2). Množství vstupní DNA do reakcí WGA bylo 50 ng, s výjimkou titračního experimentu, kde bylo vstupní množství uvedeno v textu níže. Po WGA byly přebytečné primery a dNTP odstraněny přečištěním produktu WGA pomocí Sady pro čištění PCR GenElute (produkt NA1020).

Značení DNA a hybridizace

K značení DNA WGA kyaninem 3 nebo kyaninem 5 byla použita sada Agilent Genomic DNA Labeling Kit PLUS (číslo výrobku Agilent 5188-5309). Podle doporučení společnosti Agilent bylo jako vstupní výchozí materiál pro každou značkovací reakci použito 2,0-2,5 μg amplifikované DNA. V případě přímého značení (neamplifikovaný materiál) bylo jako vstupní výchozí materiál pro značení použito 0,5 μg genomové DNA. Vzorky značené kyaninem 3 a kyaninem 5 byly smíchány a hybridizovány na mikročipy Agilent ze sady Human Genome CGH Microarray Kit 105A (Agilent P/N G4412A) nebo Human Genome CGH Microarray Kit 44B (Agilent P/N G4410B) podle standardních doporučení společnosti Agilent pro zpracování.

Skenování mikročipů a analýza dat

Skenování a analýza obrazu byly provedeny podle protokolu společnosti Agilent pro analýzu genomové DNA na bázi oligonukleotidových polí CGH (verze 4.0). Mikročipy byly skenovány pomocí skeneru Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent P/N G2565BA). K extrakci dat z nezpracovaných obrazových souborů mikročipů v rámci přípravy na analýzu byl použit software Feature Extraction společnosti Agilent (v9.1.3). Software Agilent CGH Analytics (v3.4) byl použit k vizualizaci, detekci a analýze aberačních vzorů z profilů CGH microarray.

Výsledky

I. Titrace vstupní DNA

Omezující množství výchozího templátu může inhibovat analýzy array CGH některých vzácných vzorků, jako jsou buňky vyjmuté mikrodisekcí laserem nebo jehlové biopsie. Zde popsaný experiment byl navržen tak, aby demonstroval, že GenomePlex WGA lze použít k vytvoření vysoce kvalitních dat aCGH v celé řadě vstupních genomových DNA (1-100 ng). Výtěžnost WGA pro všechny vstupy se pohybovala v rozmezí 5-10 μg, měřeno UV spektrofotometrií (údaje nejsou uvedeny). Distribuce velikosti DNA se pohybovala mezi 200 a 5000 bp, jak bylo změřeno analýzou v agarosovém gelu (obr. 1, dráhy 4-7), ačkoli distribuce velikosti produktu WGA z reakcí se vstupem 1 ng byla posunuta o něco níže (obr. 1, dráha 7). Hodnoty výkonnostních metrik mikročipů, jako je standardní odchylka derivačního logaritmu (DLRSD), poměr signálu k šumu (SNR) a šum pozadí (BGNoise), ukázaly, že výsledky aCGH z různých vstupů do reakcí WGA (vstup 1-100 ng) byly srovnatelné (tabulka 1). Hodnota DLRSD pro vstup 1 ng byla vyšší než pro ostatní vstupy, ale byla v přijatelném rozmezí (viz poznámka pod čarou k tabulce 1). Nízké hodnoty logaritmického šumu mezi sondami naznačují, že chromozomální aberace lze spolehlivě detekovat v tomto širokém rozsahu vstupních hmotností DNA.

Obrázek 1. Gelový obraz, vstupní titrace WGA. Pomocí gelové elektroforézy byla porovnána ekvivalentní množství (1 μg/jamku) amplifikované (200-5 000 bp) a neamplifikované (> 12 000 bp) genomové DNA HT29. Dráhy 1 a 3: marker molekulové hmotnosti; dráha 2: HT29 DNA neamplifikovaná; pruh 4: HT29 DNA amplifikovaná ze vstupních 100 ng; pruh 5: HT29 DNA amplifikovaná ze vstupních 50 ng; pruh 6: HT29 DNA amplifikovaná z 10 ng vstupu; pruh 7: HT29 DNA amplifikovaná z 1 ng vstupu.

Obrázek 2. Ideogramy CGH Analytics ilustrující vstupní titrační data z mikročipů Agilent Human Genome CGH 105A. V každém panelu (A-F) byly vedle sebe zobrazeny grafy záměny barviv. Vlevo je zobrazena polarita +1 (Cy5-HT29/Cy3-Female) a vpravo polarita -1 (Cy5-Female/Cy3-HT29). Tyto grafy CGH porovnávají normální ženskou DNA s buněčnou linií lidského karcinomu tlustého střeva HT29 se známou delecí napříč ramenem p (horizontální posun vlevo od nulové linie), amplifikací ramene q v oblasti q23.3-24.33 (horizontální posun vpravo od nulové linie) a fokální delecí v oblasti q23.1. U těchto vzorků byla provedena výměna barviva (záměna značek barviva mezi vzorky), aby se prokázalo, že výsledky nejsou důsledkem zkreslení barviva. A: amplifikováno ze 100 ng vstupu, B: amplifikováno z 50 ng vstupu, C: amplifikováno z 10 ng vstupu, D: amplifikováno z 1 ng vstupu, E: MilliporeSigma amplifikováno z 10 ng vstupu, F: neamplifikováno.

*Další vysvětlení viz poznámka pod čarou k tabulce 1.

Pro analýzu aberačních vzorců v DNA HT29 amplifikované v celém rozsahu vstupů byl použit software CGH Analytics (obrázek 2). Zobrazení chromozomů pro všechny vstupní úrovně konzistentně odhalilo všechny známé aberace včetně delece napříč ramenem 8p, amplifikace ramene 8q a fokální delece v 8q23.1. Tyto údaje naznačují, že integrita amplifikace je zachována v širokém rozsahu vstupů do WGA. Výsledky array generované společností MilliporeSigma porovnávají DNA HT29 s DNA od jednoho mužského pacienta bez anamnézy rakoviny, zatímco data společnosti Agilent byla generována porovnáním chromozomálních rozdílů mezi HT29 a souhrnnou referencí zdravých jedinců. Údaje MilliporeSigma vykazovaly vyšší hodnoty signálu pozadí a také nižší hodnoty poměru signálu k šumu pro všechny vstupy ve srovnání s údaji Agilent (tabulka 1), což lze nejlépe vysvětlit variabilitou počtu kopií; sdružený referenční vzorek použitý při generování údajů Agilent tuto variabilitu z velké části eliminuje. Souhrnně lze říci, že údaje naznačují, že při omezení množstvím dostupné předlohy může amplifikace GenomePlex z pouhého 1 ng výchozí genomové DNA generovat konzistentní výsledky CGH.

II. Amplifikace z fragmentované DNA

Mnoho výzkumníků by rádo provádělo aCGH na vzorcích s pochybnou integritou, jako jsou genomové DNA z FFPE, zmrazené a jiné archivované tkáně. Účelem následujícího experimentu bylo za prvé zhodnotit proveditelnost amplifikace nízkomolekulární DNA pomocí GenomePlex a za druhé zjistit, zda DNA amplifikovaná z fragmentované DNA poskytne přijatelné výsledky aCGH. Jako zdroj fragmentované DNA byla použita sonikovaná DNA různých velikostí. Distribuce velikostní integrity byla stanovena analýzou v agarosovém gelu (obrázek 3). WGA byla provedena s použitím intaktní i fragmentované DNA HT29 a výsledky aCGH jsou uvedeny na obrázku 4. Odhalily všechny dobře známé aberace HT29 na chromozomu 8. Kromě toho byly hodnoty metrik kvality dat z mikročipů vysoce korelovány mezi intaktní a fragmentovanou DNA (tabulka 2). Vliv fragmentace byl dále vyhodnocen a ověřen porovnáním mužských a ženských vzorků, jak je zaznamenáno v tabulce 2. Tyto výsledky naznačují, že amplifikací a následnou analýzou pomocí mikročipů Agilent lze získat výsledky srovnatelné s výsledky získanými při použití intaktní genomové DNA o vysoké molekulové hmotnosti.

Obrázek 3. Obraz gelu, časový průběh sonikace. Velikost fragmentu DNA byla stanovena pomocí gelové elektroforézy před amplifikací pomocí GenomePlex WGA. Jak lidská ženská genomová DNA, tak genomová DNA HT29 poskytují vysokomolekulární intaktní pás (> 12 000 bp), zatímco DNA sonikovaná přerušovaně po dobu 5-120 s poskytuje více menších pásů DNA s různou velikostí. Vzorky sonikované 90 s (~400 bp) byly použity při následné analýze aCGH. Dráhy 1 a 7: marker molekulové hmotnosti; dráha 2: Intaktní ženská DNA (> 12 000 bp); pruh 3: Samičí DNA sonikovaná 5 s (~1 500 bp); pruh 4: Samičí DNA sonikovaná 30 s (~600 bp); pruh 5: Samičí DNA sonikovaná 90 s (~400 bp); pruh 6: Samičí DNA sonikovaná 120 s (~300 bp); pruh 8: Intaktní DNA HT29 (> 12 000 bp), pruh 9: HT29 DNA sonikovaná 90 s (~400 bp).

Obrázek 4. Ideogramy CGH Analytics ilustrující data z mikročipů Agilent Human Genome CGH 44B. Produkt WGA vytvořený z intaktní DNA HT29 (A) a fragmentované DNA HT29 (B) odhalil identickou známou deleci napříč ramenem 8p (horizontální posun vlevo od nulové čáry), amplifikaci podél ramene 8q v oblasti 8q23.3-24.23 (horizontální posun vpravo od nulové čáry) a fokální deleci v 8q23.1 (horizontální posun vlevo od nulové čáry, vyznačeno tečkovaným modrým rámečkem). Odpovídající zvětšené pohledy na geny pro data z intaktní DNA (C) i fragmentované DNA (D) se zaměřením na Chr8 q22.2-23.1; zřetelně ukazují deleci o velikosti ~1,5 MB (vyznačeno tlustou čarou) zahrnující protein zinkového prstu ZFPM2 a nádorový supresor LRP12, které byly dříve zaznamenány v analýzách založených na matricích BAC. A: Pohled na chromozom 8 u HT29/Female s WGA intaktní HT29 DNA (vstup 50 ng); B: Pohled na chromozom 8 u HT29/Female s WGA fragmentované HT29 DNA (vstup 50 ng); C: Zvětšený genový pohled panelu A (12 MB zvětšovací okno); D: Zvětšený genový pohled na panel B (okno se zvětšením 12 MB).

¹Týká se pouze srovnání mužů a žen. NA, nepoužije se.
^*Další vysvětlení viz poznámka pod čarou k tabulce 1.

Závěry

Produkt WGA lze snadno použít na dvoubarevnou platformu CGH array společnosti Agilent a získat tak vysoce kvalitní data. Tato metoda amplifikace umožňuje použití menšího množství (nanogramové množství) výchozího materiálu. GenomePlex WGA navíc představuje možnost amplifikovat a analyzovat vzorky, které byly silně fragmentovány. DNA WGA lze přímo začlenit do pracovního postupu oligo-aCGH bez jakýchkoli odchylek od doporučeného protokolu společnosti Agilent. Amplifikovaný materiál poskytuje vysoce kvalitní chromozomální karyotypy, které odpovídají výsledkům z neamplifikovaných vzorků genomové DNA. Budoucí experimenty se zaměří na vytváření vysoce kvalitních genomových profilů ze vzorků tkání, včetně vzorků FFPE.

¹ Pouze pro srovnání mužů a žen. Není zahrnuto v QC metrikách softwaru CGH Analytics 3.4.

Odkazy

1. Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, Sampas N, Lipson D, Kincaid R, Tsang P, Curry B, Baird K, Meltzer PS, et al. 2004. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(51):17765-17770. https://doi.org/10.1073/pnas.0407979101

2. Johnson NA, Hamoudi RA, Ichimura K, Liu L, Pearson DM, Collins VP, Du M. 2006. Application of array CGH on archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues including small numbers of microdissected cells. Lab Invest. 86(9):968-978. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700441

3. Little SE, Vuononvirta R, Reis-Filho JS, Natrajan R, Iravani M, Fenwick K, Mackay A, Ashworth A, Pritchard-Jones K, Jones C. 2006. Array CGH using whole genome amplification of fresh-frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tumor DNA. Genomics. 87(2):298-306. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2005.09.019

4. O'Geen H, Nicolet CM, Blahnik K, Green R, Farnham PJ. 2006. Comparison of sample preparation methods for ChIP-chip assays. BioTechniques. 41(5):577-580. https://doi.org/10.2144/000112268

GenElute je ochranná známka společnosti Merck KGaA, Darmstadt, Německo a/nebo jejích přidružených společností. Všechny ostatní ochranné známky jsou majetkem příslušných vlastníků. Podrobné informace o ochranných známkách jsou k dispozici prostřednictvím veřejně přístupných zdrojů.