HPLC für große Moleküle

Umkehrphasen-HPLC für Biomoleküle

Die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) ist eine empfindliche und vielseitige Technik zur Trennung und Analyse von Proteinen, Proteinfragmenten und Peptiden. Die RP-HPLC verwendet eine unpolare stationäre Phase und eine polare mobile Phase. Die Retention von Proteinen und Peptiden auf der stationären Phase folgt dem Adsorptions- und Verteilungsprinzip. Hydrophobe Proteinbereiche binden sich reversibel an die stationäre Phase. Die Proteine werden eluiert, indem der unpolare Charakter der mobilen Phase erhöht wird. Die Auflösung kann durch die Porengröße, die Partikelgröße, die Säulenlänge und die an die stationäre Phase gebundene Kohlenwasserstoffkette beeinflusst werden.

Größenausschlusschromatographie (SEC)

Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist ein nicht denaturierendes Chromatographieverfahren, bei dem Moleküle nach ihrer Größe (d. h. hydrodynamischer Radius) getrennt werden. Dieses Verfahren beruht nicht auf der Wechselwirkung des Analyten mit der stationären Phase, sondern auf dem zufälligen Fluss des Analyten durch die Partikel der stationären Phase. Analyten mit hohem Molekulargewicht eluieren früher, da sie ganz oder teilweise von den Poren der stationären Phase ausgeschlossen werden, während Analyten mit geringerem Molekulargewicht später eluieren, da sie mehr Zeit damit verbringen, den verschlungenen Weg durch die Partikel zu bewältigen. SEC wurde zur Charakterisierung von Aggregaten und Fragmenten monoklonaler Antikörper (mAbs), zur Schätzung unbekannter Proteinmolekulargewichte und zur Bestimmung der Stabilität von Proteinformulierungen eingesetzt.

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) ist ein Chromatographieverfahren, das Analyten auf der Grundlage des Grades der Wechselwirkung zwischen hydrophoben Analyteneinheiten und hydrophoben Liganden der stationären Phase trennt. Aufgrund ihres geringeren Molekulargewichts und ihrer geringeren Neigung zur Faltung wird die HIC normalerweise nicht zur Trennung von Peptiden verwendet. Bei hohen Salzkonzentrationen können die Hydratationsschichten der Proteine so weit gestört werden, dass hydrophobe Oberflächenbereiche an die unpolare stationäre Phase grenzen. Die Auswahl der Salze richtet sich nach der Hofmeister-Reihe, die Kationen und Anionen nach ihrer Fähigkeit klassifiziert, Proteinhydratationsschichten zu zerstören (chaotrop) oder die Bildung von Proteinhydratationsschichten zu fördern (kosmotrop). Typische Salze sind Ammoniumsulfat, Kaliumsulfat und Natriumsulfat. Die hydrophobe Interaktionschromatographie wird derzeit zur Bestimmung des Wirkstoff-Antikörper-Verhältnisses (DAR) von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADC) eingesetzt.

Ion Exchange Chromatography (IEX)

Ion Exchange Chromatography (IEX) ist eine Art der Chromatographie, die Analyten nach Ladung trennt. Proteine und Peptide sind amphoter, das heißt, sie weisen sowohl saure als auch basische Funktionen auf. Zu den sauren Proteinfunktionen gehören Asparaginsäure, Glutaminsäure, Cystein, Tyrosin und das C-terminale α-Carboxylat. Zu den basischen Proteinfunktionen gehören Arginin, Histidin, Lysin und das N-terminale α-Amin. Biotherapeutische Ladungsvarianten können mit IEX nachgewiesen und aufgelöst werden. Ladungsvarianten können durch Fehltranslation von Boten-RNA (mRNA)-Transkripten und/oder posttranslationale Modifikationen wie Deamidierung, Oxidation oder Glykosylierung entstehen.

Eine IEX-Säule muss auf der Grundlage des isoelektrischen Punktes (pI) des Analyten ausgewählt werden. Wenn der pH-Wert der mobilen Phase unter dem pI-Wert liegt, ist der Analyt positiv geladen und bindet an eine Kationenaustauschersäule.Liegt der pH-Wert der mobilen Phase über dem pI, ist der Analyt negativ geladen und bindet an eine Anionenaustauschersäule.

Affinity Chromatography

Affinity Chromatography beruht auf einer spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Analyten und einem Liganden der stationären Phase. Im Idealfall verbindet sich nur der Analyt von Interesse mit der stationären Phase, so dass alle anderen Probenbestandteile die Säule passieren können. Eine zweite mobile Phase wird dann durch die Säule geleitet, um den Analyten zu eluieren.

Die Protein-A-Chromatographie ist die in der biopharmazeutischen Industrie am häufigsten verwendete Form der Affinitätschromatographie. Protein A ist ein 42 kDa großes Oberflächenprotein, das in der Zellwand von S. aureus vorkommt.Dieses Protein bindet spezifisch an die schwere Kette in der Fc-Region von IgGs, was es zu einem idealen Mechanismus macht, um IgGs von anderen Probenbestandteilen zu trennen. Die meisten Protein-A-Säulen werden hergestellt, indem das Protein auf einem porösen, organischen Partikel immobilisiert wird. Es wurden jedoch auch monolithische Formate für die Protein-A-Chromatographie hergestellt, die einen hohen Probendurchsatz bei verschiedenen Durchflussraten ermöglichen, ohne die Effizienz zu beeinträchtigen.