HPLC für kleine Moleküle

HPLC von kleinen Molekülen

Die HPLC-Analyse kleiner Moleküle wird meist im Umkehrphasenmodus durchgeführt. Für die Trennung polarer Verbindungen sind auch die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) und die Normalphasenchromatographie geeignet, wobei die HILIC die bevorzugte Methode ist. Für die Trennung von ionischen Verbindungen können auch Ionenaustausch-Trennverfahren und für anorganische Anionen oder Kationen die Ionenchromatographie eingesetzt werden.

Die HPLC-Säule ist entweder mit vollporösen Silicapartikeln, oberflächlich porösen Silicapartikeln, polymeren Partikeln gepackt oder besteht aus einem monolithisches Siliziumdioxid als stationäre Phase. Darüber hinaus werden Aluminiumoxid-, Zirkoniumoxid- und Kohlenstoffpartikel verwendet. Die typische Porengröße des Materials der stationären Phase für die Trennung kleiner Moleküle liegt im Bereich von 60 Å - 160 Å. Für die HPLC liegt die typische Partikelgröße der stationären Phase zwischen 3 µm und 5 µm, für die UHPLC werden kleinere Partikelgrößen, typischerweise 2 µm oder weniger, verwendet. An die stationäre Phase können verschiedene Säulenselektivitäten (Modifikationen) angebracht werden. Eine C18-Alkylkette ist die am häufigsten verwendete Säulenchemie in der Umkehrphasenchromatographie (RP). Andere Modifikationen wie C30, C8, Phenyl, Pentaflourophenyl und eine breite Palette polarer Modifikationen sowie Modifikationen mit Ionenaustausch- oder chiralen Eigenschaften ermöglichen jedoch die Trennung fast aller in Flüssigkeiten löslichen Verbindungen. Die mobile Phase für die RP-HPLC besteht in der Regel aus einem wässrigen Puffer oder Wasser und wassermischbaren organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril oder Methanol.

HPLC-Probenvorbereitung

Komplexe und matrixreiche Proben wie Lebensmittel, Getränke, Kosmetika, biologische Proben und matrixreiche pharmazeutische Formulierungen (z. B. Sahne, Sirup) erfordern effiziente Probenvorbereitungsprotokolle, um unerwünschte Bestandteile zu entfernen und den gewünschten Analyten selektiv zu extrahieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, wenn eine stationäre Phase mit sehr kleinen Partikelgrößen wie bei der UHPLC verwendet wird, bei der Partikel von 2 µm oder weniger eingesetzt werden. Gängige Probenvorbereitungsmethoden sind die Flüssig-Flüssig-Extraktion, die Festphasenextraktion (SPE) und bei biologischen Proben neben der Filtration auch die Proteinausfällung. Neben der selektiven Elution der Zielverbindung und der Anreicherung besteht der Hauptzweck der Probenvorbereitung darin, die stationäre HPLC-Phase vor Verstopfung durch die Probenmatrix zu schützen. HPLC-Säulen auf Basis von monolithisches Siliziumdioxid ist in hohem Maße matrixverträglich und erfordert eine wesentlich geringere Probenvorbereitung als partikuläre Säulen.

Derivatisierung

Für einige Moleküle ist eine Derivatisierung erforderlich, entweder vor (vor der Säule) oder nach (nach der Säule) der HPLC-Trennung. Durch die Derivatisierung werden Moleküle in ihre Derivate umgewandelt, um die Empfindlichkeit oder die chromatographische Retention in der HPLC zu verbessern. Für die erforderliche Derivatisierung werden chemische Reagenzien mit erwünschten physikalischen und chemischen Eigenschaften verwendet.