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HPLC de moléculas pequeñas

Científica viendo un cromatograma de HPLC

Análisis de moléculas pequeñas

Por molécula pequeña se entienden los compuestos de bajo peso molecular (normalmente inferior a 900 dalton). Algunos ejemplos comunes de moléculas pequeñas son los aminoácidos, los lípidos, los azúcares, los ácidos grasos, los alcaloides, y otros.

Se dispone de diferentes métodos para la separación de moléculas pequeñas, entre ellos: la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la cromatografía de líquidos (LC), la cromatografía de gases (GC), la cromatografía en capa fina (TLC) y la electroforesis capilar (CE). Además, las opciones para su identificación abarcan la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) o la espectrometría de masas (MS). La cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) se ha convertido en los últimos años en una técnica clave para la identificación de moléculas pequeñas.

La obtención de los mejores resultados posibles en el análisis mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), UHPLC o LC-MS de moléculas pequeñas depende de la selección de la fase estacionaria más adecuada y de las condiciones de la fase móvil . La composición química del analito es fundamental para seleccionar la composición química más adecuada de la columna. Otros aspectos como la velocidad, la matriz de la muestra y el número de compuestos definen el material base más adecuado para la fase estacionaria.

HPLC de moléculas pequeñas

El análisis de moléculas pequeñas mediante HPLC suele realizarse más a menudo en el modo de separación de fase reversa. Para la separación de compuestos polares, la cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) y la cromatografía en fase normal son también adecuadas, siendo la HILIC el método preferido. Para la separación de compuestos iónicos, pueden utilizarse los modos de separación de intercambio iónico y para los aniones o los cationes inorgánicos, también la cromatografía iónica.

La columna de HPLC puede estar rellena de partículas de sílice totalmente porosas, de partículas de sílice superficialmente porosas o de partículas poliméricas, o puede consistir en una varilla de sílice monolítica como fase estacionaria. Además, se utilizan óxido de aluminio, partículas de circonio y partículas de carbón. El tamaño de poro típico del material de fase estacionaria para la separación de moléculas pequeñas oscila entre 60 Å y 160 Å. Para la HPLC, el tamaño de partícula típico de la fase estacionaria oscila entre 3 µm y 5 µm, para la UHPLC se utilizan tamaños de partícula más pequeños, normalmente de 2 µm o inferiores. Pueden fijarse diferentes selectividades (modificaciones) de columna a la fase estacionaria. Una cadena alquilo de C18 es la composición química de columna más utilizada en cromatografía de fase reversa (RP). No obstante, otras modificaciones, como C30, C8, fenilo, pentafluorofenilo y una amplia gama de modificaciones más polares, así como modificaciones con propiedades de intercambio iónico o quirales, permiten la separación de casi todos los compuestos solubles en líquidos. La fase móvil para RP-HPLC consiste normalmente en una disolución amortiguadora o agua y disolventes orgánicos miscibles en agua como el acetonitrilo o el metanol.


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Preparación de la muestra para HPLC

Las muestras complejas y ricas en matriz, como alimentos sólidos y líquidos, cosméticos, muestras biológicas y formulaciones farmacéuticas ricas en matriz (cremas o jarabes) requieren protocolos de preparación de muestras eficaces para eliminar los componentes no deseados y extraer selectivamente el analito de interés. Esto es fundamental si se utiliza una fase estacionaria con tamaños de partícula muy pequeños, como en la UHPLC, donde se utilizan partículas de 2 µm o menores. Los métodos habituales de preparación de muestras son la extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida (SPE) y, para las muestras biológicas, también la precipitación de proteínas además de la filtración. Además de la elución selectiva del compuesto deseado y la preconcentración, el objetivo principal de la preparación de la muestra es proteger la fase estacionaria de la HPLC de la obstrucción causada por la matriz de la muestra. Las columnas de HPLC compuestas de sílice monolítica pueden tolerar mejor la matriz y requieren mucha menor preparación de la muestra que las columnas de partículas.

Derivatización

Para algunas moléculas se requiere derivatización, ya sea antes (precolumna) o después (poscolumna) de la separación mediante HPLC. La derivatización convierte las moléculas en sus derivados para una mejor sensibilidad o retención cromatográfica en la HPLC. Para la derivatización requerida se utilizan reactivos químicos con propiedades físicas y químicas deseables.






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