HPLC małych cząsteczek

HPLC małych cząsteczek

Analiza HPLC małych cząsteczek jest najczęściej wykonywana w trybie separacji w fazie odwróconej. Do rozdzielania związków polarnych odpowiednie są również chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) i chromatografia w fazie normalnej, przy czym preferowaną metodą jest HILIC. Do separacji związków jonowych można również stosować tryby separacji jonowymiennej, a w przypadku anionów lub kationów nieorganicznych chromatografię jonową.

Kolumna HPLC jest wypełniona w pełni porowatymi cząstkami krzemionki, powierzchniowo porowatymi cząstkami krzemionki, cząstkami polimerowymi lub składa się z monolityczna krzemionka jako faza stacjonarna. Ponadto stosuje się tlenek glinu, cząstki cyrkonu i cząstki węgla. Typowy rozmiar porów materiału fazy stacjonarnej do separacji małych cząsteczek mieści się w zakresie 60 Å - 160 Å. W przypadku HPLC typowy rozmiar cząstek fazy stacjonarnej wynosi od 3 µm do 5 µm, w przypadku UHPLC stosuje się mniejsze rozmiary cząstek, zwykle 2 µm lub mniejsze. Do fazy stacjonarnej można dołączyć różne selektywności kolumn (modyfikacje). Łańcuch alkilowy C18 jest najczęściej stosowaną chemią kolumny w chromatografii z odwróconą fazą (RP). Niemniej jednak, inne modyfikacje, takie jak C30, C8, Phenyl, Pentaflourophenyl i szeroka gama bardziej polarnych modyfikacji, jak również modyfikacje o właściwościach jonowymiennych lub chiralnych umożliwiają rozdzielanie prawie wszystkich związków rozpuszczalnych w cieczach. Faza ruchoma dla RP-HPLC zazwyczaj składa się z buforu wodnego lub wody i mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych, takich jak acetonitryl lub metanol.

Przygotowanie próbek HPLC

Próbki złożone i bogate w matrycę, takie jak żywność, napoje, kosmetyki, próbki biologiczne i preparaty farmaceutyczne bogate w matrycę (np. śmietana, syrop) wymagają skutecznych protokołów przygotowania próbek w celu usunięcia niepożądanych składników i selektywnej ekstrakcji interesującego analitu. Ma to krytyczne znaczenie w przypadku stosowania fazy stacjonarnej o bardzo małych rozmiarach cząstek, jak w UHPLC, gdzie stosowane są cząstki o wielkości 2 µm lub mniejsze. Typowe metody przygotowania próbek to ekstrakcja ciecz-ciecz, ekstrakcja do fazy stałej (SPE), a w przypadku próbek biologicznych także wytrącanie białek oprócz filtracji. Oprócz selektywnej elucji związku docelowego i wstępnego zatężania, głównym celem przygotowania próbki jest ochrona fazy stacjonarnej HPLC przed zatykaniem spowodowanym przez matrycę próbki. Kolumny HPLC oparte na monolityczna krzemionka może w dużym stopniu tolerować matrycę i wymaga znacznie mniejszego przygotowania próbki niż kolumny cząsteczkowe. 

Derywatyzacja

Dla niektórych cząsteczek wymagana jest derywatyzacja, przed (przed kolumną) lub po (po kolumnie) separacji HPLC. Derywatyzacja przekształca cząsteczki w ich pochodne w celu uzyskania lepszej czułości lub retencji chromatograficznej w HPLC. Do wymaganej derywatyzacji stosuje się odczynniki chemiczne o pożądanych właściwościach fizycznych i chemicznych.